全 文 ：祁宏英 ,徐洪国 ,梁　艳 ,等.六出花基因组 DNA的提取 [ J] .江苏农业科学, 2010(3):29-31.
六出花基因组 DNA的提取
祁宏英 , 徐洪国 , 梁　艳 , 黄　凯
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 ,黑龙江齐齐哈尔 161006)
　　摘要:通过采用 DoyleCTAB改良方法Ⅰ 、DoyleCTAB改良方法 Ⅱ 、DoyleCTAB改良方法 Ⅲ 、DoyleCTAB改良方
法Ⅳ、SDS(十二烷基硫酸钠)法和高盐沉淀法对六出花叶片基因组 DNA进行提取 , 经紫外分光光度计分析及琼脂糖
凝胶电泳检测对所提取 DNA的浓度 、纯度 、产率进行比较分析 , 结果表明:提取 DNA质量效果最好的方法是 Doyle
CTAB改良方法Ⅲ ,得到的 DNA产率为 4 081.7 μg/g, 其电泳条带也最为清晰;而提取 DNA质量效果最差的方法是
DoyleCTAB改良方法Ⅳ,其产率为 723.3μg/g。
　　关键词:六出花;DNA提取;琼脂糖凝胶电泳
　　中图分类号:S682.1+90.1　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)03-0029-03
(上接第 28页)
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　　六出花(Alstromeriaaurantiaca)花色艳丽 ,具有很高的观
赏价值 。目前六出花在我国还处于引种阶段 ,对于六出花的
研究目前主要集中在形态学 、促成栽培技术 、延长瓶插花期 、
良种选育等问题 [ 1-7 ]上 。本试验采用 6种方法对六出花基因
组提取 ,以期为六出花遗传学的研究及基因文库的建立提供
基础依据 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
六出花 ,品种为公主百合嫩叶 。
1.2　试验方法
1.2.1　DNA检测方法
1.2.1.1　DoyleCTAB改良方法 Ⅰ 　①取 0.3 g六出花嫩叶
片 ,用酒精清洗晾干后 ,用剪刀剪成碎片放入离心管中 。 ②倒
入适量液氮于管中 ,迅速捣碎研磨呈粉末状 ,于各管内加入
0.06 gPVP。 ③在离心管中 ,加入 1%β -巯基乙醇(15 μL)
和 1.5 mL2%CTAB抽提液(已提前预热至 65 ℃)。 ④轻微
振荡后 ,将离心管置于 65 ℃水浴锅中保温 45 min,水浴过程
中温和地混匀几次 。 ⑤取出离心管 ,每管加入等体积的氯仿 /
收稿日期:2010-02-04
作者简介:祁宏英(1976—),女 ,硕士 , 讲师 ,研究方向为园艺植物栽
培与育种。 E-mail:qihongying1976@ 163.com。
异戊醇(体积比 24 ∶1)溶液 ,混匀后 ,离心 (12 000 r/min,
10 min)。⑥取上清液转入 1个新离心管中 ,加入等体积的氯
仿 /异戊醇 (体积比 24 ∶1)颠倒混匀 ,离心 (12 000 r/min,
10 min)。⑦取上清液转入 1个新离心管中 ,加入等体积的氯
仿 /异戊醇(体积比 24 ∶1)颠倒混匀 ,离心 (8 000 r/min, 5
min),此时在中间分层处无白色物质 。 ⑧取上清液转入 1个
新离心管中 ,加入 2 /3体积异丙醇 (提前在 -20 ℃预冷),轻
微振荡后静置 30 min,然后离心(8 000 r/min, 5 min)。 ⑨取
出离心管 ,倒掉管内试剂 ,发现有白色物质附着在离心管底
部 ,用 75%乙醇清洗 2次 ,用无水乙醇清洗 1次 ,晾干(DNA
被洗脱出来)。 ⑩加入适量 1×TE缓冲液溶解 DNA,然后保
存在 -20 ℃。
1.2.1.2　DoyleCTAB改良方法Ⅱ　①②步与 “1.2.1.1”相
同 。 ③加入 2%β -巯基乙醇(30μL)和 1.5 mL2%CTAB抽
提液(已提前预热至 65 ℃)。其他步骤与 DoyleCTAB改良
方法 Ⅰ相同 。
1.2.1.3　DoyleCTAB改良方法Ⅲ　①②步与 “1.2.1.1”相
同 。 ③加入 4%β -巯基乙醇(60μL)和 1.5 mL2%CTAB抽
提液(已提前预热至 65 ℃)。其他步骤与 DoyleCTAB改良
方法 Ⅰ相同 。
1.2.1.4　DoyleCTAB改良方法Ⅳ　①②步与 “1.2.1.1”相
同 , ③加入 4%β -巯基乙醇 (60 μL)和 1.5 mL1%CTAB抽
提液(已提前预热至 65 ℃)。其他步骤与 DoyleCTAB改良
—29—江苏农业科学　2010年第 3期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.03.098
方法 Ⅰ相同 。
1.2.1.5　SDS法　具体操作参照文献 [ 8] 。
1.2.1.6　高盐沉淀法　具体操作参照文献 [ 8] 。
1.2.2　DNA质量检测
1.2.2.1　紫外分光光度计检测　从已溶解的 DNA的溶液中
吸取 30 μL, 稀释 100倍后 , 用紫外分光光度计检测其在
230nm、260 nm和 280 nm波长处的光吸收值 ,并计算出相应
的浓度值(紫外分光光度计在使用前提前预热)。 DNA溶液
的纯度用 D260 nm/D230 nm , D260 nm /D280 nm的比值来表示 , 当
D260 nm/D280 nm的值接近 1.8 ～ 2.0 , D260 nm /D230 nm﹥ 2.0时 , DNA
的纯度符合质量标准 。若 D260 nm /D280 nm﹤ 1.8 ,表明有蛋白质
污染;若 D260 nm /D280 nm﹥ 2.0时则表明 DNA样品中有 RNA污
染 ,而当 D260 nm /D280 nm﹤ 2.0 ,表明溶液中有残存的盐和小分
子杂质 。
DNA质量浓度(μg/mL)=D260 nm×50μg/mL×稀释倍数
DNA产率(μg/g)=[ DNA质量浓度(μg/mL)×TE体积
(mL)] /试验材料用量(g)
1.2.2.2　琼脂糖凝胶电泳检测 　(1)琼脂糖凝胶电泳试剂
的配制 。 ①5×TBE缓冲液:将 Tris5.4 g,硼酸 2.75 g, EDTA
3.262 4 g(pH值 8.0),加水定容至 100 mL,与室温下保存
(TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物 ,为避免该问题 ,可在
室温下用玻璃瓶保存 ,出现沉淀后则予以废弃)。 ②溴化乙
啶溶液(EB溶液:1 mg/mL):用蒸馏水配制 ,于 4 ℃保存 ,用
时稀释成 0.5 ～ 1 μg/mL(EB是一种诱变剂 ,也是致癌剂 ,用
完后用漂白粉先处理 ,再倒掉 )。 EB可嵌入堆积的碱基对之
间 ,在紫外灯下发荧光 ,检测 DNA的下限可达 1 ～ 10ng。 ③6
×上样缓冲液(溴酚蓝溶液):将 0.25%溴酚蓝与 40%(m/V)
蔗糖水溶液混合 。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测步骤 。 ①用蒸馏水将 5 ×TBE
缓冲液配制成 0.5×TBE稀释缓冲液 。 ②取 1g琼脂糖置于
三角瓶中 ,加入 0.5×TBE稀释缓冲液 ,加热使之熔化 ,混匀 。
③将两端封闭的电泳槽置于水平支持物上 ,插上样品梳子 ,将
冷却至 50 ～ 60 ℃的琼脂糖凝胶液中加入 EB溶液至终浓度
为 0.5μg/mL,将 1%凝胶倒入电泳槽 ,待胶液完全凝固后拔
出梳子 ,然后向槽内加 0.5×TBE稀释缓冲液至液面刚好没
过胶板表面 。 ④将在冰箱中保存的 DNA样本取出 ,用枪头取
5 μL,加入 5 μL左右上样缓冲液 ,用移液枪混匀 ,小心加到样
品槽中 。 ⑤从负极到正极 ,电压 60 ～ 80V,电流 40 mA以上 ,
当溴酚蓝条带移动至距凝胶前沿约 2 cm时 ,停止电泳 ,在凝
胶成像系统下拍照 。
2　结果与分析
2.1　采用不同提取方法提取六出花 DNA的产率分析
对 Doyle的经典 CTAB法的改良是对加入的 CTAB提取
液和 β -巯基乙醇的浓度进行变化 ,其中 DoyleCTAB改良方
法 Ⅰ是使用 2%CTAB提取液并加入 1%β -巯基乙醇 , Doyle
CTAB改良方法 Ⅱ是使用 2%CTAB提取液并加入了 2%
β -巯基乙醇 , DoyleCTAB改良方法 Ⅲ是使用 2%CTAB提取
液并加入了 4%β -巯基乙醇 , DoyleCTAB改良方法Ⅳ是使用
1%CTAB提取液并加入 4%β -巯基乙醇。
通过紫外分光光度计检测 ,得出了采用各种方法提取的
DNA在 230nm、260 nm和 280nm波长处的光吸收值 ,并因此
计算出 DNA产率 。从表 1可以看出 ,提取的 DNA的质量浓
度由高到低依次为 DoyleCTAB改良方法Ⅲ (395 μg/mL)、
DoyleCTAB改良方法Ⅱ(345μg/mL)、SDS法(240 μg/mL)、
高盐沉 淀法 (155 μg/mL)、 DoyleCTAB改 良 方法 Ⅰ
(95μg/mL)、DoyleCTAB改良方法 Ⅳ(70 μg/mL)。采用
DoyleCTAB改良方法Ⅲ进行 DNA提取与采用 DoyleCTAB改
良方法Ⅳ相比差异极显著 ,其中采用 DoyleCTAB改良方法Ⅲ
提取的 DNA的质量浓度为 395μg/mL,产率为 4 081.7μg/g;
而采用 DoyleCTAB改良方法 Ⅳ提取的 DNA的质量浓度为
70 μg/mL,产率为 723.3 μg/g。
这 6种方法提取得到的 DNA经过紫外分光光度计检测
后得出 ,其 D260 nm/D230 nm和 D260 nm /D280 nm的值均大于 2.0 ,这表
明样品中 RNA的含量很高 ,但是没有多糖和酚类等杂质污
染 [ 9 ] 。RNA的污染 ,对试验结果不会造成太大的影响 。
表 1　采用不同方法提取基因组 DNA测试结果
方法 D260 nm D280nm D260nm/D230nm D260 nm/D280 nm DNA质量浓度(μg/mL)
DNA产率
(μg/g)
DoyleCTAB改良方法Ⅰ 0.019 0.008 2.111 2.375 95c 981.7
DoyleCTAB改良方法Ⅱ 0.069 0.026 2.300 2.654 345ab 3 565.0
DoyleCTAB改良方法Ⅲ 0.079 0.028 2.724 2.821 395a 4 081.7
DoyleCTAB改良方法Ⅳ 0.014 0.007 3.500 2.000 70d 723.3
SDS法 0.048 0.021 2.370 2.286 240b 2 480
高盐沉淀法 0.031 0.012 2.171 2.583 155bc 1601.7
　　注:同列不同字母表示 5%差异水平。
2.2　采用不同提取方法提取六出花 DNA的琼脂糖凝胶电泳
分析
利用 1%的琼脂糖凝胶对 DNA样品进行电泳检测 ,结果
显示与分光光度计检测所得结果基本一致(图 1)。跑出的条
带基本在同一水平上 ,迁移率高 ,条带略清晰 ,但均有拖尾现
象 ,这表明所提取 DNA的完整性不好 ,并且 RNA基本没有去
除 ,这是由于在试验过程中 ,可能抽提次数过多或振荡剧烈造
成的 DNA分子片段的断裂产生了很多小分子 DNA,所以在
电泳跑带过程中会产生这样的拖尾;而且在试验过程中 ,由于
没有加入 RNA酶 (RNase),导致植物叶片中的 RNA没有去
—30— 江苏农业科学　2010年第 3期
除 ,产生如图 1所示的情形 。在图 1中可以看出 , DoyleCTAB
改良方法Ⅲ提取的条带最为清晰 , DoyleCTAB改良方法Ⅳ提
取的条带最为模糊 。
　　图 1中 1、2号是采用 DoyleCTAB改良方法Ⅱ提取得到
的 DNA电泳图 ,条带略清晰;3、4号是使用 DoyleCTAB改良
方法 Ⅲ提取得到的 DNA电泳图 ,条带清晰;5号是 Doyle
CTAB改良方法Ⅳ提取得到的 DNA电泳图 ,条带模糊;6、7号
是采用 DoyleCTAB改良方法 Ⅰ提取得到的 DNA电泳图;8
号是用维生素 C(抗坏血酸)代替 PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )的
电泳图 ,在这个试验过程中发现研磨液变黄 ,由图可知其多糖
等杂质没有去除干净;9号是采用 SDS法提取得到的 DNA电
泳图;10号是采用高盐沉淀法提取得到的 DNA电泳图。
2.3　氯仿 /异戊醇抽提次数对六出花嫩叶 DNA提取质量的
影响
提取出的 DNA未经纯化处理往往会含有较多的杂质 ,常
不符合下游试验研究的质量要求 ,必须对其进行纯化 。要从
所提取的 DNA中除去的主要污染物是蛋白质和 RNA,加入
某些有机溶剂可使蛋白质变性 ,本试验采用氯仿 /异戊醇去除
杂质蛋白 。针对采用 DoyleCTAB改良方法 Ⅲ (加入 2%
CTAB提取液和 4%β -巯基乙醇)来提取 DNA的过程中 ,用
不同抽提次数的氯仿 /异戊醇处理后 ,得出氯仿 /异戊醇抽提
次数对 DNA纯度和得率产生的影响(表 2)。
表 2　不同抽提次数提取基因组 DNA测试结果
抽提
次数 D260nm
D260nm/
D230nm
D260nm/
D280nm
DNA
质量浓度
(μg/mL)
DNA
产率
(μg/g)
1 0.197 1.697 3.039 985a 10 178.3
2 0.158 2.171 2.911 790a 8 163.3
3 0.079 2.724 2.821 395b 4 081.7
　　注:同列不同字母表示 5%差异水平。
　　方差分析表明(表 2),氯仿 /异戊醇抽提次数为 1次或
2次的 DNA含量与抽提次数为 3次的之间差异达到显著水
平 。增加抽提次数 ,相对应的 D260 nm/D230 nm的值也增大 ,叶片
由 DoyleCTAB改良方法Ⅲ提取的基因组 DNA提取终产物经
过 2次抽提后 ,其 D260 nm /D230 nm的值大于 2.0 ,随着抽提次数
的增多而增大 ,即抽提次数对小分子杂质 、多糖或者酚类的去
除有一定的作用 。
另一方面 ,氯仿可以使蛋白质变性沉淀 ,从而减少或去除
异丙醇析出的 DNA中蛋白质的含量。试验结果表明 ,抽提次
数对核酸和蛋白质得率也有影响 ,但这种影响不是很明显 ,随
着抽提次数的增加 , D260 nm /D280 nm的值相应减小 ,产物中蛋白
质含量减少的同时 , DNA含量也在减少 ,即核酸损失增多 。
所以 ,采用 DoyleCTAB改良方法 Ⅲ进行 DNA提取时 ,用氯
仿 /异戊醇抽提 2次效果较好 。
3　讨论与结论
在本试验中 ,采用 DoyleCTAB改良方法Ⅲ提取六出花嫩
叶基因组 DNA比 SDS法 、高盐沉淀法和其他几种 Doyle
CTAB改良方法效果好。这几种方法均可提取出六出花嫩叶
片基因组 DNA,但经紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳
分析可得出其产率和纯度各有不同 。采用 DoyleCTAB改良
方法Ⅲ进行 DNA提取与采用 DoyleCTAB改良方法Ⅳ相比差
异极显著 ,其中采用 DoyleCTAB改良方法 Ⅲ提取的 DNA的
产率为 4 081.7μg/g;而采用 DoyleCTAB改良方法Ⅳ提取的
DNA产率为 723.3 μg/g。在采用 DoyleCTAB改良方法Ⅲ
时 ,用氯仿 /异戊醇抽提 2次去除 DNA中蛋白质效果较好 。
植物基因组 DNA提取一般必须经历破碎细胞膜 、除去多
糖和多酚等次生物质 、变性分离蛋白质 、沉淀核酸 、去除 RNA
和浓缩 DNA等几个步骤 。植物 DNA的提取方法基本上是成
熟的 ,但对于不同的植物来说 ,由于各自的生物化学成分和结
构不同 ,在具体的操作中也存在较大的差异 。所以应针对植
物的不同之处 ,选用提取 DNA的方法并进行探索和改进 。
DNA的提取方法有很多种 ,在本试验中所使用的方法有改良
的 4种 CTAB法 、SDS法和高盐沉淀法 。
通过本试验得出 ,采用 DoyleCTAB改良方法Ⅲ较其他几
种提取方法效果好 。在进行 DNA分子提取时 ,还应确定植物
材料与提取液的最佳比例 ,加入 CTAB过多或不足都会影响
DNA的提取效果 。本试验中 ,使用 2% CTAB提取液比用
1%CTAB提取液效果好 。由琼脂糖凝胶电泳图可知 ,由于没
有在试验中加入 RNase,因此有 RNA污染 。而在试验中用氯
仿 /异戊醇(24∶1)代替苯酚抽提 ,既可降低苯酚残存对 DNA
的质量造成的影响 ,又可避免苯酚的毒性对人体的危害 。
由正式试验之前的预试验比较得出试验过程中经过
45 min水浴时间 ,去除 DNA中蛋白质效果很好 ,由试验结果
知道 DNA中蛋白质 、多糖、酚类物质以及其他杂质去除比较
干净 。
紫外分光光度计检 测各种方法提 取的 DNA时 ,
D260 nm/D280 nm的理论值是 1.8 ～ 2.0 ,可实际得出的值却大于
2.0,这是因为在试验过程中没有加入核酸酶去除 RNA,导致
有 RNA污染 ,若试验结果是用于 RAPD分析 ,少量的 RNA存
在对试验结果不会有太大影响 [9 ] 。
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