全 文 ：云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University，2014，29 (4):602 － 605 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 － 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2013 － 09 － 23 修回日期:2013 － 10 － 22 网络出版时间:2014 － 06 － 18 15∶54
* 基金项目:云南省烟草公司项目 (2011YN58)。
作者简介:李祖红 (1969 －)，男，云南曲靖人，高级工程师，主要从事卷烟产品技术和烟叶的生产及科研工作。
E-mail:hylzuhong@ 163. com
＊＊通信作者Corresponding authors:赵明富 (1975 －)，男，云南宣威人，博士，副教授，主要从事微生物学研究。
E-mail:zhaomingfu@ 163. com;文国松 (1988 －)，男，云南曲靖人，博士，副研究员，主要从事分子生
物学和微生物技术研究。E-mail:wengs@ 163. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20140618. 1554. 025. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 － 390X (n). 2014. 04. 025
一株紫茎泽兰根际细菌分离鉴定
及对烟草促生作用研究*
李祖红1，曾 嵘1，刘 芳1，林选知1，张瑞勤1，赵明富3＊＊，文国松2＊＊
(1． 云南省烟草公司 曲靖市公司，云南 曲靖 655000;
2． 云南农业大学 农业与生物技术学院，云南 昆明 650201;
3． 云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201)
摘要:对紫茎泽兰根际分离到细菌 ZJZL-1 进行形态结构鉴定、生理生化特性测定及扩增 16s rDNA序列并进行
分析，初步确定 ZJZL-1 巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium) (序列登录号:KF658192)。ZJZL-1 接种盆栽烟
草测定其定殖效果及对烟草促生作用。定殖试验结果表明 ZJZL-1 能在烟株根部成功定殖，35 d 后处于 6. 8 ×
103 CFU /g的相对稳定状态;促生试验发现 ZJZL-1 接种的烟株比对照在中部、上部叶片全磷和全钾的含量在
不同程度上增加，表明 ZJZL-1 能促进烟株对 P元素和 K元素的吸收。
关键词:巨大芽孢杆菌;鉴定;烟草;定殖;促生
中图分类号:S 182 文献标志码:A 文章编号:1004 － 390X (2014)04 － 0602 － 04
Isolation and Identification of Ｒhizosphere Bacteria from
Crofton Weed and Growth Promoting Effect on Tobacco
LI Zuhong1，ZENG Ｒong1，LIU Fang1，LIN Xuanzhi1，
ZHANG Ｒuiqin1，ZHAO Mingfu3，WEN Guosong2
(1． Yunnan Qujing Tobacco Corporation，Qujing 655000，China;2． Key Laboratory for Agricultural Biodiversity for
Pest Management of China Education Ministry，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;3． College
of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China)
Abstract:A bacterium strain ZJZL-1 was isolated from rhizosphere of Ageratina adenophora，Based
on its morphological，physiological and biochemical properties as well as the 16S rDNA sequence anal-
ysis result，ZJZL-1 was tentatively identified as Bacillus megaterium (sequence accession number:
KF658192)． ZJZL-1 was inoculated to potted tobacco to determine its colonization in roots and its
growth promoting effect on tobacco． Colonization trial results showed that ZJZL-1 could successfully
colonize in the rhizosphere of tobacco，colonization density leveled off at 6. 8 × 103 CFU /g root。It was
found that in the Middle，upper leaves of tobacco inoculated with ZJZL-1，phosphorus and potassium
content could increase in varying degrees，compared with controls，growth promoting results of pot trail
showed that ZJZL-1 could promote tobacco potassium and phosphorus absorption．
Key words:Bacillus megaterium;identification;tobacco;colonization;promoting growth
紫茎泽兰 (Ageratina adenophora)，多年生草
本或亚灌木，是一种世界性入侵恶性杂草，给农、
林、牧业带来严重的经济损失和生态破坏。紫茎
泽兰对土壤养分的吸收性强，能极大耗损土壤肥
力，对土壤可耕性的破坏也较严重。紫茎泽兰的
抗逆性极强，对土壤的选择性不大，即使在干旱
脊薄的荒地、隙地、墙头、石缝里也能生长。紫
茎泽兰根际微生物作为土壤和植物的中介与桥梁，
扮演着重要角色，其活动规律对于土壤肥力、植
物营养和植物病害都有举足轻重的作用。有研究
表明，紫茎泽兰的强抗逆性可能与其根际微生物
群落结构有关，特别是有时微生物增加了与土壤
养分循环相关的微生物功能类群数量，进而提高
了土壤可利用的养分水平，创造对自身生长有利
的土壤环境。这种改变加速了土壤养分循环，增
强了紫茎泽兰的养分吸收，进而促进其生长、竞
争和扩张［1，2］。关于紫茎泽兰根际微生物分离鉴
定、对植物病原抑制或对其他植物生长促进作用
已有报道［3 － 6］。本文以烟草为材料，对从紫茎泽
兰根际分离到的巨大芽孢杆菌对在烟株根部定殖、
促生方面进行研究，为紫茎泽兰根际细菌对烟草
促生作用，减少化肥用量应用提供参考。
1 材料与方法
1. 1 ZJZL-1 分离与形态及生理生化特性测定
将紫茎泽兰植株连根拔出，用清洁毛刷取紫
茎泽兰根表 1 mm土层，置于自封袋中，4 ℃保存
备用。按照常规方法进行分离，称取采集土样
10 g放入盛有 90 mL 无菌水的带有玻璃珠的三角
瓶中，振荡摇匀 10 min，使土和水充分混合，然
后用移液枪从三角瓶中吸取 1 mL (此操作要求无
菌操作)，加入另一盛有 9 mL 无菌水的试管中，
混合均匀，依此类推分别制成制成 10 －2，10 －3，
10 －4，10 －5不同稀释度的稀释液，用移液枪吸取
稀释液 100 μL，利用稀释平板涂布法在 NA 培养
基上均匀涂布，每个稀释度重复 3 次，于 28 ℃下
恒温箱培养 48 h后观察菌落生长情况，并挑取单
菌落分离纯化，对数量较多的优势菌株进行形态
观察、生理生化测定和提取总 DNA 进行 16S
rＲNA序列扩增进行序列分析，生理生化测定参
照东秀珠等方法［7 － 9］。
1. 2 细菌总 DNA制备
采用 CTAB /NaCl 法提取细菌总 DNA［11］。
(1)挑取一环单菌落于 5 mL NA 培养基中活化，
30 ℃培养过夜;(2)取 0. 1 mL上述菌液于 10 mL
2% NA 液体培养基中，37 ℃，220 r /min 培养
12 h; (3)取 1 mL 菌液于 1. 5 mL 离心管中，
5 000 r /min离心 15 min，除去上清液;(4)加入
1 mL TE 离心洗涤，再加入 1 mL TE 溶菌; (5)
取 0. 3 mL菌悬夜加入 20 μL 10% SDS 混匀，90 ℃
水浴 90 min;(6)加入 74 μL 5 mol /L NaCl，再加
入 52 μL CTAB /NaCl混匀，65℃温育 10 min;(7)
加入等体积氯仿 /异戊醇，混匀，10 000 r /min，
5 min，保留上清液;(8)再加入酚∶氯仿∶异戊醇
(25∶24∶1)混匀，10 000 r /min，5 min，保留上清
液; (9)加入 0. 6 倍的异戊醇混匀，10 000 r /
min，5 min，收集 DNA沉淀，用 70%乙醇离心洗
涤 DNA沉淀;(10)用 1 mL TE 溶解 DNA，4℃
保存。
1. 3 16S rＲNA序列扩增
用于扩增 16S rＲNA 的 PCＲ 引物为通用引物，
27F:5 －AGAGTTTTATCNTGGCTCAG －3和 1492Ｒ:
5 －GGYACCTTGTTACGACTT －3 。PCＲ 反应体系
如下:2 × power Taq PCＲ mastermix 25 μL，27F
0. 5 μL，1492Ｒ 0. 5 μL，模板 DNA 15 μL，ddH2O
9 μL，总体系 50 μL。PCＲ 扩增条件为:95 ℃
5 min;95 ℃ 1 min;56 ℃ 30 s;72℃ 1 min，40
个循环;72 ℃ 10 min。电泳采用琼脂糖凝胶电
泳，核酸染料为花青素，Marker 大小为 2 000 bp。
最后将 PCＲ纯化产物送上海生工生物工程有限公
司进行测序。所得序列提交 NCBI GenBank，并与
核酸数据库中的相关序列进行比对分析。
1. 4 烟草盆栽定殖促生试验
1. 4. 1 供试烟草品种
盆栽定殖促生试验所栽烟苗品种为红花大金
元，在育苗基质中培育至 5 ～ 6 片真叶，备用。
1. 4. 2 菌悬液的制备
将菌株接种到 NA 液体培养基中，30 ℃，
120 r /min 摇瓶培养 3 d，用无菌水稀释成 6 ×
108 CFU/mL。用不接种菌株的 NA 液体培养基做
306第 4 期 李祖红，等:一株紫茎泽兰根际细菌分离鉴定及对烟草促生作用研究
对照。
1. 5 烟草根际定殖动态
取浓度为 6 × 108 CFU /mL的 ZJZL-1 菌液加入
移栽烟苗根际土壤中，每株烟 5 mL 菌液。待 3 d
后按无菌操作取样，每天取样 1 次，检测其是否
成功定殖并进行定殖动态观测。取样方法:取出
烟幼苗，抖掉附着在根上的泥土，以每 1 cm根长
为一段剪取，将相同部位的根段收集在 1 个无菌
培养皿内;每个部位的根段样品由 3 株烟苗根系
的同一部位组成;并将各根段转入装有 20 mL
0. 1% MgS04·7H2O 溶液的三角瓶中，涡旋高速
振荡 30 min，再进行 10 倍梯度稀释，在 NA 固体
培养基按 MPN 法测定细菌数量［6］。试验 3 次重
复，设置不加菌液的烟株作为对照。
1. 6 盆栽促生试验
试验采用常规土培法，设置 2 个处理，分别
为 CK和移栽烟苗时接种 ZJZL-1 于烟苗根际土
壤中，接种 ZJZL-1 菌液的操作如上烟草根际定
殖试验所述，对照采用无菌水按同样的方法处
理，每个处理各重复栽烟 3 株。待 ZJZL-1 成功
定殖烟株根际并生长旺盛时对烟株的中部叶片
(取从上至下第 4 片展开的叶片)、上部叶片
(顶叶)进行总氮、全钾、全磷含量测定，对所
得数据进行统计分析。测定方法参照王树会等
方法［10］。
2 结果与分析
2. 1 ZJZL-1 形态特征及生理生化特性
从紫茎泽兰根际共分离到细菌 21 株，编号
ZJZL-1 ZJZL-21，在显微镜下观察，选择数量较
多，菌体较大的菌株 ZJZL-1 进一步生理生化
测定。
ZJZL-1 菌株在 NA培养基上培养 24 h 后，按
照革兰氏染色法对其进行染色，镜检 ZJZL-1 菌株
为革兰氏阳性菌，菌株呈杆状，末端圆，芽孢椭
圆形，端生。在 30 ℃培养 48 h 后，菌落近圆形，
直径 2 ～ 4 mm，边缘整齐，表面凸起，淡色至黄
色，不透明。
对 ZJZL-1 菌株进行相关生理生化指标的测
定，结果表明 ZJZL-1 菌株形态大小，生理生化特
性与滕春红、张鑫和张春华等［11 － 13］报道的基本一
致 (表 1)。
表 1 菌株 ZJZL-1 生理生化特性
Tab. 1 Physiological and biochemical
characteristics of strain ZJZL-1
特征
characteristics
结果
results
特征
characteristics
结果
results
明胶液化
gelatin liquefaction test
+ 吲哚试验
Indole test
－
过氧化氢酶反应
catalase test
+
VP试验
VP test
－
葡萄糖发酵反应
glucose fermentation test
+
产 H2S
H2S producing test
－
淀粉水解反应
starch hydrolysis test
+ 培养基生长
(pH5. 5)
growth on medium
W
柠檬酸盐利用试验
citrate utilization test
+ 培养基生长
(pH6. 8)
growth on medium
+
注: + . 表示阳性;－表示阴性;W表示弱阳性 .
Note: + . positive;－ . negative;W. weak positive.
2. 2 ZJZL-1 的 16S rDNA序列测定
利用通用引物 27F和 1492Ｒ进行 PCＲ扩增的
6S rDNA扩增产物送上海生工生物工程有限公司
进行纯化和测序，结果 ZJZL-1 的 16S rDNA 扩增
核苷酸序列大小为 1 459 bp (序列登录号:
KF658192)。将 ZJZL-1 的 16S rDNA 测序结果与
基因库进行 blastn 比对，发现该 ZJZL-1 菌株与巨
大芽孢杆菌 Bacillus megaterium strain TS-1 (序列
登录号:EU979528)、Bacillus megaterium strain
HS14 (序列登录号:GU3233741)、Bacillus mega-
teriumstrain XAS3-2 (序列登录号:JF496309)亲
缘关系最近，相应区域核苷酸序列同源性达到
99%，结合形态及生理生化特征，确定 ZJZL-1 菌
株为巨大芽孢杆菌。
2. 3 ZJZL-1 在烟草根际的定殖能力
通过在移栽烟苗的同时向烟苗土壤中接种 ZJ-
ZL-1，待第 3 天在烟株根系各根段部位根进行定
殖水平检测。结果表明:在接种 ZJZL-1 后的第 5
天在烟株根系根段部位检测到该菌，说明 ZJZL-1
在烟株根系的成功定殖。与此同时在根际 1 ～
5 cm范围内的根段部位均实现定殖，接种的 ZJZL-
1 在烟株根部的定殖分布表现为尖部位定殖数量
最小，离根尖越远的根段部位 ZJZL-1 的定殖数量
越多且在 5 cm的根段部位定殖密度达到 2. 8 × 106
CFU /g，随后在 35 d 检测发现定殖密度下降至
6. 8 × 103 CFU /g。
406 云南农业大学学报 第 29 卷
2. 4 在烟草盆栽试验中 ZJZL-1 的促生效果
通过烟草盆栽试验，接种 ZJZL-1 并定殖成功
的烟株中部叶片和上部叶片表现出一定的促生作
用，其中烟株总氮中部叶片比对照略微持平，上
部叶片比对照增加 4. 7%;在全钾上中部叶片比
对照增加 36. 80%，上部叶片比对照增加 31. 4%;
而在全磷上中部叶片比对照增加 26. 7%，上部叶
片都比对照增加 23. 5%，如表 2 所示。
表 2 ZJZL-1 对烟株的促生作用
Tab. 2 Growth promoting effect of ZJZL-1 on tobacco
%
处理
treatment
中部叶片 middle leaves 上部叶片 upper leaves
总氮
total
nitrogen
全钾
total
potassium
全磷
total
phosphate
总氮
total
nitrogen
全钾
total
potassium
全磷
total
phosphate
CK 2. 07 1. 44 0. 15 2. 11 1. 53 0. 17
ZJZL-1 2. 08 1. 97 0. 19 2. 21 2. 01 0. 21
3 讨论
关于巨大芽孢杆菌研究的的报道目前主要集
中在一些植物根际促生作用以及经济用途方面，
巨大芽孢杆菌可以用来生产解磷固钾肥，巨大芽
孢杆菌具有很好的降解土壤中有机磷的功效，是
生产生物有机肥的常用菌种［14 － 16］。本研究从紫茎
泽兰根际分离到巨大芽孢杆菌 ZJZL-1，在烟株根
部进行定殖及促生作用的研究，研究表明巨大芽
孢杆菌能成功定殖于烟草根际，定殖密度达到
2. 8 × 106 CFU /g ，随后有所下降，35 d 后处于
6. 8 × 103 CFU /g的相对稳定状态。而在盆栽促生
试验中，ZJZL-1 接种的烟株相比对照在中部、上
部叶片全磷和全钾的含量在不同程度上增加，这
一试验结果表明 ZJZL-1 能够促进烟株生长及其利
用 P，K元素的可能性。巨大芽孢杆菌能在烟株
根部成功定殖并能促进烟草利用 P 元素和 K 元
素，这对减少烟草化肥用量、改善土壤结构具有
重要应用前景，但在大田烟草实际生产应用中定
殖和促生作用有待于进一步研究。
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