全 文 ：中国农学通报 2013,29(36):302-305
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
当植物受到逆境胁迫时，体内会产生大量的氧自
由基，即活性氧(ROS)，当植物体内活性氧超出一定浓
度时，过氧化酶系统活动加强，以清除过多的活性
氧[1]。植物细胞内存在复杂的活性氧清除系统，过氧
还蛋白是一类新的过氧化物酶，它可以催化H2O2还原
为水，或在供体氢的存在下，催化各种烷基过氧化物还
原为水和相应的醇[2]。Prxs不仅保护植物免受有害活
性氧的伤害，还可通过调节细胞内的H2O2浓度在信号
转导中起作用。植物过氧还蛋白共分为4类，PrxQ属
于第 4类。2000年从佛甲草(Sedum lineare)中分离出
了17 kDa的蛋白质，该蛋白与大肠杆菌细菌铁蛋白共
迁移蛋白具有较高的同源性，命名为SI-PrxQ，在体内
PrxQ具有抗氧化的作用[3]。Dietz等[4]在拟南芥基因组
中发现一个PrxQ基因，用过氧化氢或肼处理拟南芥叶
片时，AtPrxQ表达量增加，对H2O2的反应尤为强烈。
基金项目：宁夏回族自治区科技攻关宁陕合作项目“植物抗逆基因克隆、功能分析及应用研究”(KGZ-09-10-11)；宁夏回族自治区科技支撑项目“抗旱
耐盐碱植物功能基因挖掘与利用研究科技支撑项目编号（2012ZYS041)”。
第一作者简介：甘晓燕，女，1982年出生，助理研究员，学士，主要从事植物基因工程研究。通信地址：750002宁夏银川市金凤区黄河东路590号，Tel：
0951-6886759，E-mail：ganxiaoyan1982@163.com。
通讯作者：宋玉霞，女，1963年出生，宁夏贺兰人，研究员，硕士，主要从事植物生物技术育种研究。通信地址：750002宁夏银川市金凤区黄河东路590
号宁夏农林科学院，Tel：0951-6886755。
收稿日期：2013-06-21，修回日期：2013-08-19。
转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测
甘晓燕，吴明朝，周晓燕，石 磊，宋玉霞
（宁夏农业生物技术重点实验室，银川 750002）
摘要：为了研究HaPrxQ的生理功能，根据已发表的过氧还蛋白基因序列，设计特异引物，扩增到完整的
HaPrxQ基因；构建植物表达载体 pCAMBIA2300-HaPrxQ，通过农杆菌介导转化拟南芥，获得转化植株
种子，用 50 mg/L卡纳霉素对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选，并通过 PCR对抗性苗进行检
测。将拟南芥花序于浓度OD=0.8~1.0的菌液中浸染10~20 s，转化效率可以达到2.5%~3%。构建的载
体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。
关键词：HaPrxQ基因；植物表达载体；拟南芥遗传转化
中图分类号：Q812 文献标志码：A 论文编号：2013-1709
Transformation of Arabidopsis thaliana with Haloxylon ammodendron HaPrxQ Gene
Gan Xiaoyan, Wu Mingzhao Zhou Xiaoyan, Shi Lei, Song Yuxia
(Key Lab. of Agricultural Biotechnology of Ningxia, Yinchuan 750002)
Abstract: This study aimed to study the physiological functions of HaPrxQ. In this paper, the full length
HaPrxQ gene from the genomic DNA of Haloxylon ammodendron was isolated with PCR technique using
primers designed according to the published sequence. To identify potential function of this gene in plant,
expression vector pCAMBIA2300-HaPrxQ was constructed, and then transformed into Arabidopsis thaliana by
Agrobacterium-mediated in florescence infection method. T0 transgenic seeds were screened by MS plate
containing 50 mg/L Kanamycin. The results showed that the best transforming condition was immersion in OD=
0.8-1.0 liquid bacterium for 10-20 s, 2.5%-3% kan-resistant green seedlings were obtained. 9 positive
transgenic seedlings were identified by PCR, providing material for further studies on the function of HaPrxQ
gene and its interaction with other genes in plants.
Key words: HaPrxQ gene; construction of plant expression vector; Arabidopsis thaliana transformation
甘晓燕等：转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测
郭晓黎[2]从盐地碱蓬中分离得到了PrxQ基因，命名为
SsPrxQ，并采用DNA重组技术成功构建了植物表达载
体，利用花序侵染法将农杆菌携带的表达载体转入拟
南芥，在低温和盐胁迫条件下，转基因植株生长状况明
显好于野生型，在一定程度上提高了对其胁迫的耐受
能力。另外，杨树 PrxQ的表达量在病虫害侵染时升
高，推测可能在抗病中发挥重要作用 [5]。梭梭
(Haloxylon ammodendrom)主要分布在亚非大陆温带
和亚热带干旱区，属于旱生、超旱生植物，自然生长在
流动沙丘、盐渍土及砾质戈壁上[6]，其耐盐和耐干旱贫
瘠的能力均很强。梭梭能在土壤含盐量达4%~6%，含
水量仅为 13.2~26.0 g/kg的条件下正常生长[7]，其抗逆
能力显著高于中生植物。研究表明，它具有独特的抗
渗透胁迫的生理机制[8]。因此，本研究在克隆获得梭
梭 HaPrxQ的基础上 [9]，构建该基因植物表达载体
pCAMBIA2300-HaPrxQ，利用农杆菌介导的花序侵染
法转化拟南芥，并获得阳性植株，为进一步研究
HaPrxQ基因在植物中的功能与耐盐性作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
将野生型拟南芥种子播种于蛭石中，培养条件为
温度25℃、湿度为60%、光照强度3000~4000 lx和16h/
8h光周期。间歇浇Hogland营养液，待拟南芥花序长
出，花序有授粉现象时进行转化。
1.2 试剂、菌株与载体
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Promega公司；
pCR2.1载体为 Invirtogen产品；质粒提取试剂盒购自
Axygen公司；限制性内切酶 Kpn I、Pst I及其反应
Buffer购自 Takara公司；Taq DNA聚合酶及其反应
Buffer购自Tiangen公司；所用化学试剂均为国产或进
口分析纯。
根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101
菌株、高效植物表达载体 pCAMBIA2300均为本实验
室保存。
1.3 植物表达载体的构建
根据已获得的梭梭HaPrxQ基因序列设计引物，
PrxQF1-KpnI：(CGGGGTACCTAGTCACCAATGGCT)，
PrxQR1-PstI：(AACTGCAGGAAACGAAGGTTACA)，
并分别引入KpnI和PstI限制性内切酶位点，以获得的
HaPrxQ基因cDNA完整ORF序列为模板，进行带有酶
切位点的HaPrxQ基因PCR扩增反应。所用的扩增反
应程序为：预变性 94℃ 5 min，变性 94℃ 30 s，退火
55℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，扩增 35个循环，72℃延伸
10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，连
接到 pGEM-Teasy载体上，命名为 pHaPrxQ-T[6]。对
pHaPrxQ-T和 pCAMBIA2300分别用KpnI和PstI双酶
切，然后回收目的片段，用T4连接酶连接，将重组质粒
采 用 PCR 和 双 酶 切 鉴 定 ，阳 性 克 隆 命 名
pCAMBIA2300-HaPrxQ。 采 用 电 击 法 将
pCAMBIA2300-HaPrxQ 质 粒 导 入 农 杆 菌 菌 株
GV3101，采用PCR鉴定阳性菌株。
1.4 花序侵染法转化拟南芥
采用改良的花序侵染法[10]转化拟南芥。挑取含有
pCAMBIA2300-HaPrxQ质粒的农杆菌单菌落，转入
100 mL LB液体培养基中，置入 28℃摇床中 200 r/min
过夜培养，使农杆菌菌液浓度达到OD600在0.8~1.0时，
4000 r/min离心10 min，弃上清后，用100 mL含有蔗糖
5 g、SilwetL-77 50 μL的LB液体培养基重新悬浮农杆
菌菌液。将拟南芥花盆倒扣于含有菌悬液的烧杯中,
将拟南芥的花序浸在菌液中10~20 s，黑暗下培养24 h
后，置于温度 25℃、湿度为 60%、光照强度 3000~4000
lx和 16h/8h光周期的光照培养箱中培养，隔天浇水和
培养植株，待开花后收获种子[11]。
1.5 转基因植株的抗性筛选及PCR检测
将收获的拟南芥种子用8% NaClO酒精溶液（95%
酒精配制）中消毒 5 min后，在选择培养基（MS +
50 mg/L卡那霉素+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖）上进行筛
选。采用CTAB法提取阳性植株基因组DNA并进行
PCR检测，阳性对照为 pCAMBIA2300-HaPrxQ质粒，
阴性对照为未转化植株的基因组DNA。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体的构建
对 HaPrxQ 的 完 整 ORF 序 列 与
pCAMBIA2300-35S-OCS使用限制性内切酶KpnI与
PstI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图 1所
示。切胶回收带有酶切位点的目的片段和载体，进行
HaPrxQ M pCAMBIA2300
750bp
9467bp946
750
M：DL2000 Marker
图1 HaPrxQ和pCAMBIA2300-35S-OCS
质粒双酶切电泳检测
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连接反应。目的基因 HaPrxQ 和植物表达载体
pCAMBIA2300双酶切后，经连接反应获得重组植物
表达载体 pCAMBIA2300-HaPrxQ，载体图谱如图 2。
使用限制性内切酶KpnI、PstI对重组植物表达载体
pCAMBIA2300-HaPrxQ进行双酶切鉴定，结果表明与
预期大小一致，表明已成功构建了植物表达载体，结果
如图3所示。
2.2 转基因植株的抗性筛选
经播种发苗、移苗、农杆菌介导花序侵染、收集当
代植株的种子（T0代）（图 4）、再播种于Kan+MS培养
基上筛选，转基因幼苗具有卡那霉素抗性，在Kan+MS
培养基上能正常生长，叶片为绿色，而非转基因幼苗不
能正常生长，则黄化死去；转HaPrxQ基因的拟南芥种
子已在抗性平板分化出幼苗（图 5），待植株长到发出
四片真叶时，将其转入蛭石基质中继续栽培。
2.3 转基因植株的PCR检测
以植株为绿色且正常生长为指标，获得了抗卡那
霉素植株 13株，取叶片提取DNA，用HaPrxQ基因的
引物进行PCR检测，以未转化植株为阴性对照，9株转
基因植株的DNA都扩增出了HaPrxQ基因，未转化植
株均未扩增出HaPrxQ（图6）。
3 结论与讨论
逆境胁迫可以引起植物活性氧产生，而植物体发
展了一套高效的酶促防御系统来保护细胞免受氧化损
750 bp
500 bp
2000 bp
3000 bp
5000 bp
8000 bp
图2 重组植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ图谱
M：DL2000 Marker 1：pCAMBIA2300-HaPrxQ；
2：使用限制性内切酶Kpn I、Pst I双酶切后的pCAMBIA2300-HaPrxQ
图3 重组植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ的
双酶切鉴定图
图4 拟南芥植株转化及T0代种子收取
A：野生型拟南芥在MS培养基上培养；B：野生型拟南芥在Kan+MS培养基；C：为转HaPrxQ基因拟南芥在Kan+MS培养基上筛选
图5 转HaPrxQ基因拟南芥在Kan+MS培养基上的筛选
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甘晓燕等：转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测
M：DL2000 Marker，P：pCAMBIA2300-HaPrxQ质粒（阳性对照），CK：未转化植株（阴性对照），1~13：抗卡那霉素拟南芥PCR鉴定
图6 抗卡那霉素拟南芥植株PCR检测
伤[12-13]。抗氧化酶类基因表达水平的诱导差异使抗氧
化系统灵活的对活性氧进行时空调节。另外细胞的氧
还状态必须维持在合适的水平以确保细胞的正常功
能。在氧化胁迫中基因表达的改变与氧还依赖的调节
有关[14-15]。郭晓黎[2]从盐地碱蓬中分离活动了PrxQ基
因，命名为SsPrxQ，并采用DNA重组技术将其构建到
植物表达载体上，利用花序侵染法将农杆菌携带目标
基因的的表达载体转入拟南芥，该拟南芥在低温和盐
胁迫下生长状况明显好于野生型，在一定程度上提高
了其对胁迫的耐受能力。为了研究HaPrxQ的生理功
能，本研究采用DNA重组技术将梭梭HaPrxQ构建到
植物表达载体 pCAMBIA2300上，获得了重组植物表
达载体 pCAMBIA2300-HaPrxQ，并将其转入农杆菌
GV3101，成功获得了重组菌株，通过花序浸染法转化
拟南芥，成功获得了9株转基因阳性植株，为进一步研
究梭梭HaPrxQ基因功能奠定了基础。
拟南芥的遗传转化采用花序浸染法得到了广泛应
用，因为其操作方便、时间短，避免了组织培养的繁琐
过程。本研究采用OD=0.8~1.0的菌液浓度，每次浸染
时间为 10~20 s，转化效率可以达到 2.5%~3%，与常小
丽[16]的研究结果一致。但在转化过程中一定要考虑到
植株的生长状况，相对于一些长势弱的拟南芥植株应
该适当降低菌液浓度或缩短浸染的时间，否则可能会
造成拟南芥植株的死亡。在合理的抗生素浓度范围下
进行的抗性筛选的过程中，转基因拟南芥可以正常生
长，但在PCR检测中并没有扩增出目的条带，为假阳
性植株。分析原因可能是抗生素的浓度或纯度较低，
可以适当的范围内增加抗生素的浓度来提高阳性植株
筛选效率以减少假阳性植物的数目。本研究对已有的
9份转基因植株继续进行抗性筛选，获得T1、T2代种
子，为验证HaPrxQ基因在拟南芥中稳定遗传奠定了
基础。在今后的研究工作过程中，将通过对转基因拟
南芥进行耐盐性生理生化分析，确定植物中HaPrxQ
在信号转导过程中的作用的可能性，最终为HaPrxQ
基因能否为改良高等植物的耐盐性提供理论依据。
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