全 文 ：山 东 农 业 科 学 2011，6:10 ～ 13 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2011 －01 －27
基金项目:济南市高校院所自主创新计划“优良城市园林绿化树种香樟转基因抗寒新种质选育”和山东省农业良种工程“国槐、香樟
耐盐抗旱抗寒转基因新品种选育”课题资助。
作者简介:田华英(1975 －) ，女，在读硕士研究生，专业:植物学。E － mail:tianhy0312@ 163. com
* 通讯作者
尾穗苋凝集素(ACA)基因植物表达载体的构建
田华英1，庞彩红2，夏 阳2* ，包 颖1，咸 洋2，李双云2，李 丽2，
刘翠兰2，毛秀红2，燕丽萍2
(1．曲阜师范大学生命科学学院，山东 曲阜 273165;
2. 山东省林木遗传改良重点实验室 /山东省林业科学院，山东 济南 250014)
摘 要:尾穗苋凝集素(Amaranthus caudatus agglutinin，ACA)是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白，属
苋菜凝集素家族，对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体 pCAMBIA2300 －
35S － OCS带有 35S启动子及终止序列、卡那霉素(Kan)抗性基因 NPTⅡ。载体 pGEMT － ACA含有 ACA基因，
通过 PCR扩增出 ACA基因。把植物表达载体 pCAMBIA2300 － 35S － OCS和扩增后的 ACA基因用 KpnⅠ和 Sal
Ⅰ双酶切后经连接酶连接，得到植物表达载体 pCAMBIA2300 － ACA。将该载体分别导入农杆菌 GV3101 和
LBA4404 进行保存。
关键词:ACA基因;植物表达载体;构建
中图分类号:Q782 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2011)06 －0010 －04
Construction of Plant Expression Vector of Amaranthus
caudatus Agglutinin Gene (ACA)
TIAN Hua － ying1，PANG Cai － hong2，XIA Yang2* ，BAO Ying1，XIAN Yang2，
LI Shuang － yun2，LI Li2，LIU Cui － lan2，MAO Xiu － hong2，YAN Li － ping2
(1． College of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China;2． Shandong Provincial Key
Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement / Shandong Academy of Forestry，Jinan 250014，China)
Abstract Amaranthus caudatus agglutinin (ACA) ，a kind of storage protein existed in the seeds of Am-
aranthus caudatus，belonged to amaranth lectin family and had lethal effect to homopteran pests such as a-
phid，Nilaparvata lugens and leafhopper． The vector pCAMBIA2300 － 35S － OCS contained the 35S promoter
and its termination sequence，kanamycin (Kan)resistant gene NPT Ⅱ，and the vector pGEMT － ACA con-
tained the ACA gene． The ACA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR)from the vector． After
cleavage by KpnⅠand SalⅠand linkage by ligase，the plant expression vector pCAMBIA2300 － ACA was con-
structed． Then the vector was transformed into the Agrobactrium tumefaciens GV3101 and LBA4404 for preser-
vation．
Key words ACA gene;Plant expression vector;Construction
蚜虫，隶属于同翅目，包括球蚜总科和蚜总
科，具有分布广、种类多、寄主杂、危害大等特点。
蚜虫虽体小柔软却危害巨大，是世界著名的农林
害虫之一。蚜虫常聚集在植株的芽、花蕾、嫩叶或
嫩枝上，以尖利的口器刺吸植物汁液，轻者引起植
物营养恶化、生长缓慢、生长畸形、落叶、萎蔫及次
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2011.06.009
生植物病毒虫害，严重时可导致植物枯死［1］。
防治蚜虫的方法主要有喷洒药物、人工防治
和利用保护性天敌。喷洒农药会影响人体健康，
而人工防治和利用保护性天敌的效果不佳。如果
转入抗虫基因，不仅可以提高植物的抗虫性，还能
减少农药对人体和环境的危害。已有研究表明，
一些植物凝集素对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶
蝉等有明显的致死作用，而且在相关的转基因实
验中也显示出了良好的抗虫效果，ACA (Amaran-
thus caudatus agglutinin)和 GNA(Galanthus nivalis
agglutinin)基因就是其中两个非常典型的代
表［5］。尾穗苋凝集素(ACA)是一种存在于尾穗
苋种子中的贮藏蛋白，属苋菜凝集素家族［4］。本
研究即构建了带有卡那筛选标记的 pCAM-
BIA2300 － ACA植物表达载体，为携带抗虫基因的
植物遗传育种提供载体。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 菌株 大肠杆菌 DH5α，根癌农杆菌
GV3101、LBA4404。
1. 1. 2 载体 植物表达载体 pCAMBIA2300 －
35S － OCS，全长 9 494 bp，带有 35S启动子及终止
序列、卡那霉素(Kan)抗性基因 NPTⅡ，由中国科
学院遗传育种所王义琴老师惠赠。pGEMT －
ACA，含有基因 ACA，由中国科学院微生物研究所
吴家和老师惠赠。
1. 1. 3 药品及培养基 限制性内切酶、混合酶、
T4 连接酶均购自大连宝生物工程有限公司;回收
试剂盒购自北京博大科技公司;PCR 引物由博尚
生物技术有限公司合成。
LB培养基:酵母浸膏 5 g /L，细菌蛋白胨 10
g /L，NaCl 10 g /L，固体培养基加琼脂 15 g /L。
YEB培养基:蛋白胨 5 g /L，酵母浸膏 1 g /L，
牛肉浸膏 5 g /L，MgSO4·7H2O 0. 493 g /L，固体
培养基加琼脂 15 g /L。
抗生素:卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)。
1. 2 pCAMBIA2300 － ACA载体的构建
1. 2. 1 ACA基因扩增 以 pGEMT － ACA 为模板
扩增 ACA 基因，设计上游引物:ACA4F 5 － CGC
GGTACC ATTGGAAGATCTACCATGGCAGG － 3
(划线处为 KpnⅠ酶切位点) ，下游引物 ACA4R
5 － CGCGTCGACTTAGTTGTTGGATCCC － 3(划
线处为 SalⅠ酶切位点)。
PCR反应体系 20 μl:上、下游引物各 1 μl，模
板 0. 5 μl，dNTP 5 μl，缓冲液 5 μl，Proybest 0. 25
μl，用无菌双蒸水补足体系。扩增程序:94℃预变
性 1. 5 min;94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延
伸 1. 5 min，循环 30 次;最后 72℃延伸 10 min。退
火温度和延伸时间根据引物及目的基因情况可作
适当调整。获得约 1. 0 kb 目的条带，电泳后回
收。
1. 2. 2 ACA 基因与 pCAMBIA2300 连接 用
KpnⅠ和 SalⅠ分别双酶切 ACA 扩增产物和质粒
pCAMBIA2300 － 35S － OCS 4 h，酶切体系均为 50
μl，含 SalⅠ 1. 5 μl，KpnⅠ 1. 5 μl，1. 5 × T － buffer
7. 5 μl，ACA 扩增产物及 pCAMBIA2300 － 35S －
OCS分别为 16 μl 和 4 μl，用无菌双蒸水补足体
系。
将酶切产物电泳回收后 16℃过夜连接。连
接体系 10 μl:T4 连接酶 1 μl，缓冲液 1 μl，ACA酶
切产物 7 μl，pCAMBIA2300 1 μl。
1. 2. 3 转化 将连接产物 pCAMBIA2300 － ACA
导入大肠杆菌 DH5α感受态细胞中进行转化。
1. 2. 4 单克隆的筛选 ①菌落 PCR:用灭菌后
的牙签挑取平板上长出的单菌落，在另一平板上
划板，选取典型的单菌落为模板进行 PCR。扩增
体系 15 μl:2 × Taq PCR Master Mix 8 μl，引物 1、2
分别为 1 μl，模板 0. 1 μl，用无菌双蒸水补足体
系。扩增程序同 1. 2. 1。
②双酶切鉴定:将阳性菌落提取质粒［3］，双
酶切鉴定重组质粒 pCAMBIA2300 － ACA，酶切检
测正确的单克隆进行测序。
1. 2. 5 导入农杆菌 将植物表达载体 pCAM-
BIA2300 － ACA 分别导入农杆菌 GV3101 和
LBA4404［3］。
1. 2. 6 菌种的保存 吸 500 μl菌液至 1. 5 ml无
菌离心管中，再加入 40%甘油(高温高压灭菌)
500 μl，用石蜡膜封口，写明菌种及保存日期于
－ 70℃保存。
2 结果与分析
2. 1 ACA基因的扩增
以质粒 pGEMT － ACA为模板，通过 PCR扩增
11第 6 期 田华英等:尾穗苋凝集素(ACA)基因植物表达载体的构建
21 山 东 农 业 科 学 2011 年
SalⅠ双酶切重组质粒，获得两条目的条带，分别
约为 10. 0 kb和 1. 0 kb(图 8)。
M，DL 15000 Marker;A，重组质粒
图 8 重组质粒的双酶切检测
2. 3. 4 测序 对酶切检测正确的单克隆进行测
序，结果显示插入序列为目的基因的正确序列。
2. 4 导入农杆菌
将测序正确的质粒 pCAMBIA2300 － ACA 导
入农杆菌 GV3101 和 LBA4404 中，随机挑取单菌
落进行 PCR 检测，结果如图 9、图 10。将农杆菌
GV3101 阳性结果中的 A、B 和农杆菌 LBA4404 阳
性结果中的 D、E、F菌种保存备用。
M:DL 15000 Marker;A ～ C:转化 GV3101;
D:阳性对照;E:阴性对照。
图 9 pCAMBIA2300 － ACA质粒转化
农杆菌 GV3101 的 PCR检测
M:DL 15000 Marker;A ～ R:转化 LBA4404;
S:阳性对照;T:阴性对照。
图 10 pCAMBIA2300 － ACA质粒转化
农杆菌 LBA4404 的 PCR检测
3 讨论
植物抗虫基因工程为控制害虫的危害提供了
新途径。抗虫基因在植物中具有应用价值的有:
苏云金杆菌毒蛋白基因、外源凝集素基因、蛋白酶
抑制剂基因、昆虫毒素基因和其它类型的抗虫基
因等［4，5］。植物凝集素对鳞翅目特别是同翅目蚜
虫、飞虱、叶蝉等刺吸式口器害虫及一些微生物有
一定防效，且具有对环境无污染、稳定性好及对高
等动物相对安全等优点，成为目前的重要研究对
象。在正常情况下，植物凝集素仅作为储存蛋白
而不表现任何特异活性;一旦植物受到微生物、昆
虫等的危害，植物凝集素就会从受害细胞中释放
出来，与特定的糖结合引发毒性影响营养物质的
消化吸收;与此同时，它还能在昆虫消化道内诱发
病灶，使害虫得病甚至死亡［4，6 ～ 8］。尤其是当 ACA
与 2 －乙酰氨基 － 2 －脱氧 － D 半乳糖专一结合
时，虽然浓度只有 GNA 的一半，但蚜虫的死亡率
却提高了一倍［7］。
本研究构建了含 ACA 基因的植物表达载体
pCAMBIA2300 － ACA，含有 CaMV35S 启动子 －
ACA基因 －终止子表达单元及一个 CaMV35S 启
动子驱动的 NPTⅡ筛选基因。该载体具备在双子
叶植物中表达的条件，NPTⅡ抗性筛选基因也符
合对转基因植物安全性的要求［9］。经过 SalⅠ和
KpnⅠ双酶切、电泳和测序鉴定，构建的载体与预
期结果完全一致。
参 考 文 献:
［1］ 曹良俊，祝勇武 . 蚜虫的危害及防治［J］．浙江林业，2009，
6:33 － 33．
［2］ 刘召华，张振山，郭洪年，等．两种凝集素基因在转基因烟草
中表达的研究［J］．遗传学报，2005，32 (7) :758 － 763．
［3］ 刘召华，郭洪年，郑光宇，等． ACA 基因启动子的克隆及功
能初探［J］. 生物工程学报，2005，21(1) :139 － 143．
［4］ 杜 丽 . 香樟体胚发生途径的植株再生体系的建立以及农
杆菌介导遗传转化的研究［D］. 武汉:华中农业大学，
2005.
［5］ 周兆澜，朱 帧 . 植物抗虫基因工程研究进展［J］. 生物工
程进展，1994，14:18 － 24．
［6］ 高 瑛，瞿礼嘉 . 植物凝集素的分子生物学研究［J］. 生物
技术通报，2000，5:18 － 22．
［7］ 王志斌，李学勇 . 植物凝集素与抗虫基因工程［J］. 生物技
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［8］ 潘 科，黄炳球，侯学文 . 植物凝集素在病虫害防治中的研
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［9］ 庞彩红，咸 洋，夏 阳，等．磷脂酰肌醇合成酶 PIS基因植
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译．分子克隆实验指南(第二版)．北京:科学出版社，1999．
31第 6 期 田华英等:尾穗苋凝集素(ACA)基因植物表达载体的构建