全 文 :山 东 农 业 科 学 2011,6:10 ~ 13 Shandong Agricultural Sciences
收稿日期:2011 -01 -27
基金项目:济南市高校院所自主创新计划“优良城市园林绿化树种香樟转基因抗寒新种质选育”和山东省农业良种工程“国槐、香樟
耐盐抗旱抗寒转基因新品种选育”课题资助。
作者简介:田华英(1975 -) ,女,在读硕士研究生,专业:植物学。E - mail:tianhy0312@ 163. com
* 通讯作者
尾穗苋凝集素(ACA)基因植物表达载体的构建
田华英1,庞彩红2,夏 阳2* ,包 颖1,咸 洋2,李双云2,李 丽2,
刘翠兰2,毛秀红2,燕丽萍2
(1.曲阜师范大学生命科学学院,山东 曲阜 273165;
2. 山东省林木遗传改良重点实验室 /山东省林业科学院,山东 济南 250014)
摘 要:尾穗苋凝集素(Amaranthus caudatus agglutinin,ACA)是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白,属
苋菜凝集素家族,对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体 pCAMBIA2300 -
35S - OCS带有 35S启动子及终止序列、卡那霉素(Kan)抗性基因 NPTⅡ。载体 pGEMT - ACA含有 ACA基因,
通过 PCR扩增出 ACA基因。把植物表达载体 pCAMBIA2300 - 35S - OCS和扩增后的 ACA基因用 KpnⅠ和 Sal
Ⅰ双酶切后经连接酶连接,得到植物表达载体 pCAMBIA2300 - ACA。将该载体分别导入农杆菌 GV3101 和
LBA4404 进行保存。
关键词:ACA基因;植物表达载体;构建
中图分类号:Q782 文献标识号:A 文章编号:1001 -4942(2011)06 -0010 -04
Construction of Plant Expression Vector of Amaranthus
caudatus Agglutinin Gene (ACA)
TIAN Hua - ying1,PANG Cai - hong2,XIA Yang2* ,BAO Ying1,XIAN Yang2,
LI Shuang - yun2,LI Li2,LIU Cui - lan2,MAO Xiu - hong2,YAN Li - ping2
(1. College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China;2. Shandong Provincial Key
Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement / Shandong Academy of Forestry,Jinan 250014,China)
Abstract Amaranthus caudatus agglutinin (ACA) ,a kind of storage protein existed in the seeds of Am-
aranthus caudatus,belonged to amaranth lectin family and had lethal effect to homopteran pests such as a-
phid,Nilaparvata lugens and leafhopper. The vector pCAMBIA2300 - 35S - OCS contained the 35S promoter
and its termination sequence,kanamycin (Kan)resistant gene NPT Ⅱ,and the vector pGEMT - ACA con-
tained the ACA gene. The ACA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR)from the vector. After
cleavage by KpnⅠand SalⅠand linkage by ligase,the plant expression vector pCAMBIA2300 - ACA was con-
structed. Then the vector was transformed into the Agrobactrium tumefaciens GV3101 and LBA4404 for preser-
vation.
Key words ACA gene;Plant expression vector;Construction
蚜虫,隶属于同翅目,包括球蚜总科和蚜总
科,具有分布广、种类多、寄主杂、危害大等特点。
蚜虫虽体小柔软却危害巨大,是世界著名的农林
害虫之一。蚜虫常聚集在植株的芽、花蕾、嫩叶或
嫩枝上,以尖利的口器刺吸植物汁液,轻者引起植
物营养恶化、生长缓慢、生长畸形、落叶、萎蔫及次
DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2011.06.009
生植物病毒虫害,严重时可导致植物枯死[1]。
防治蚜虫的方法主要有喷洒药物、人工防治
和利用保护性天敌。喷洒农药会影响人体健康,
而人工防治和利用保护性天敌的效果不佳。如果
转入抗虫基因,不仅可以提高植物的抗虫性,还能
减少农药对人体和环境的危害。已有研究表明,
一些植物凝集素对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶
蝉等有明显的致死作用,而且在相关的转基因实
验中也显示出了良好的抗虫效果,ACA (Amaran-
thus caudatus agglutinin)和 GNA(Galanthus nivalis
agglutinin)基因就是其中两个非常典型的代
表[5]。尾穗苋凝集素(ACA)是一种存在于尾穗
苋种子中的贮藏蛋白,属苋菜凝集素家族[4]。本
研究即构建了带有卡那筛选标记的 pCAM-
BIA2300 - ACA植物表达载体,为携带抗虫基因的
植物遗传育种提供载体。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 菌株 大肠杆菌 DH5α,根癌农杆菌
GV3101、LBA4404。
1. 1. 2 载体 植物表达载体 pCAMBIA2300 -
35S - OCS,全长 9 494 bp,带有 35S启动子及终止
序列、卡那霉素(Kan)抗性基因 NPTⅡ,由中国科
学院遗传育种所王义琴老师惠赠。pGEMT -
ACA,含有基因 ACA,由中国科学院微生物研究所
吴家和老师惠赠。
1. 1. 3 药品及培养基 限制性内切酶、混合酶、
T4 连接酶均购自大连宝生物工程有限公司;回收
试剂盒购自北京博大科技公司;PCR 引物由博尚
生物技术有限公司合成。
LB培养基:酵母浸膏 5 g /L,细菌蛋白胨 10
g /L,NaCl 10 g /L,固体培养基加琼脂 15 g /L。
YEB培养基:蛋白胨 5 g /L,酵母浸膏 1 g /L,
牛肉浸膏 5 g /L,MgSO4·7H2O 0. 493 g /L,固体
培养基加琼脂 15 g /L。
抗生素:卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)。
1. 2 pCAMBIA2300 - ACA载体的构建
1. 2. 1 ACA基因扩增 以 pGEMT - ACA 为模板
扩增 ACA 基因,设计上游引物:ACA4F 5 - CGC
GGTACC ATTGGAAGATCTACCATGGCAGG - 3
(划线处为 KpnⅠ酶切位点) ,下游引物 ACA4R
5 - CGCGTCGACTTAGTTGTTGGATCCC - 3(划
线处为 SalⅠ酶切位点)。
PCR反应体系 20 μl:上、下游引物各 1 μl,模
板 0. 5 μl,dNTP 5 μl,缓冲液 5 μl,Proybest 0. 25
μl,用无菌双蒸水补足体系。扩增程序:94℃预变
性 1. 5 min;94℃变性 30 s,50℃退火 30 s,72℃延
伸 1. 5 min,循环 30 次;最后 72℃延伸 10 min。退
火温度和延伸时间根据引物及目的基因情况可作
适当调整。获得约 1. 0 kb 目的条带,电泳后回
收。
1. 2. 2 ACA 基因与 pCAMBIA2300 连接 用
KpnⅠ和 SalⅠ分别双酶切 ACA 扩增产物和质粒
pCAMBIA2300 - 35S - OCS 4 h,酶切体系均为 50
μl,含 SalⅠ 1. 5 μl,KpnⅠ 1. 5 μl,1. 5 × T - buffer
7. 5 μl,ACA 扩增产物及 pCAMBIA2300 - 35S -
OCS分别为 16 μl 和 4 μl,用无菌双蒸水补足体
系。
将酶切产物电泳回收后 16℃过夜连接。连
接体系 10 μl:T4 连接酶 1 μl,缓冲液 1 μl,ACA酶
切产物 7 μl,pCAMBIA2300 1 μl。
1. 2. 3 转化 将连接产物 pCAMBIA2300 - ACA
导入大肠杆菌 DH5α感受态细胞中进行转化。
1. 2. 4 单克隆的筛选 ①菌落 PCR:用灭菌后
的牙签挑取平板上长出的单菌落,在另一平板上
划板,选取典型的单菌落为模板进行 PCR。扩增
体系 15 μl:2 × Taq PCR Master Mix 8 μl,引物 1、2
分别为 1 μl,模板 0. 1 μl,用无菌双蒸水补足体
系。扩增程序同 1. 2. 1。
②双酶切鉴定:将阳性菌落提取质粒[3],双
酶切鉴定重组质粒 pCAMBIA2300 - ACA,酶切检
测正确的单克隆进行测序。
1. 2. 5 导入农杆菌 将植物表达载体 pCAM-
BIA2300 - ACA 分别导入农杆菌 GV3101 和
LBA4404[3]。
1. 2. 6 菌种的保存 吸 500 μl菌液至 1. 5 ml无
菌离心管中,再加入 40%甘油(高温高压灭菌)
500 μl,用石蜡膜封口,写明菌种及保存日期于
- 70℃保存。
2 结果与分析
2. 1 ACA基因的扩增
以质粒 pGEMT - ACA为模板,通过 PCR扩增
11第 6 期 田华英等:尾穗苋凝集素(ACA)基因植物表达载体的构建
21 山 东 农 业 科 学 2011 年
SalⅠ双酶切重组质粒,获得两条目的条带,分别
约为 10. 0 kb和 1. 0 kb(图 8)。
M,DL 15000 Marker;A,重组质粒
图 8 重组质粒的双酶切检测
2. 3. 4 测序 对酶切检测正确的单克隆进行测
序,结果显示插入序列为目的基因的正确序列。
2. 4 导入农杆菌
将测序正确的质粒 pCAMBIA2300 - ACA 导
入农杆菌 GV3101 和 LBA4404 中,随机挑取单菌
落进行 PCR 检测,结果如图 9、图 10。将农杆菌
GV3101 阳性结果中的 A、B 和农杆菌 LBA4404 阳
性结果中的 D、E、F菌种保存备用。
M:DL 15000 Marker;A ~ C:转化 GV3101;
D:阳性对照;E:阴性对照。
图 9 pCAMBIA2300 - ACA质粒转化
农杆菌 GV3101 的 PCR检测
M:DL 15000 Marker;A ~ R:转化 LBA4404;
S:阳性对照;T:阴性对照。
图 10 pCAMBIA2300 - ACA质粒转化
农杆菌 LBA4404 的 PCR检测
3 讨论
植物抗虫基因工程为控制害虫的危害提供了
新途径。抗虫基因在植物中具有应用价值的有:
苏云金杆菌毒蛋白基因、外源凝集素基因、蛋白酶
抑制剂基因、昆虫毒素基因和其它类型的抗虫基
因等[4,5]。植物凝集素对鳞翅目特别是同翅目蚜
虫、飞虱、叶蝉等刺吸式口器害虫及一些微生物有
一定防效,且具有对环境无污染、稳定性好及对高
等动物相对安全等优点,成为目前的重要研究对
象。在正常情况下,植物凝集素仅作为储存蛋白
而不表现任何特异活性;一旦植物受到微生物、昆
虫等的危害,植物凝集素就会从受害细胞中释放
出来,与特定的糖结合引发毒性影响营养物质的
消化吸收;与此同时,它还能在昆虫消化道内诱发
病灶,使害虫得病甚至死亡[4,6 ~ 8]。尤其是当 ACA
与 2 -乙酰氨基 - 2 -脱氧 - D 半乳糖专一结合
时,虽然浓度只有 GNA 的一半,但蚜虫的死亡率
却提高了一倍[7]。
本研究构建了含 ACA 基因的植物表达载体
pCAMBIA2300 - ACA,含有 CaMV35S 启动子 -
ACA基因 -终止子表达单元及一个 CaMV35S 启
动子驱动的 NPTⅡ筛选基因。该载体具备在双子
叶植物中表达的条件,NPTⅡ抗性筛选基因也符
合对转基因植物安全性的要求[9]。经过 SalⅠ和
KpnⅠ双酶切、电泳和测序鉴定,构建的载体与预
期结果完全一致。
参 考 文 献:
[1] 曹良俊,祝勇武 . 蚜虫的危害及防治[J].浙江林业,2009,
6:33 - 33.
[2] 刘召华,张振山,郭洪年,等.两种凝集素基因在转基因烟草
中表达的研究[J].遗传学报,2005,32 (7) :758 - 763.
[3] 刘召华,郭洪年,郑光宇,等. ACA 基因启动子的克隆及功
能初探[J]. 生物工程学报,2005,21(1) :139 - 143.
[4] 杜 丽 . 香樟体胚发生途径的植株再生体系的建立以及农
杆菌介导遗传转化的研究[D]. 武汉:华中农业大学,
2005.
[5] 周兆澜,朱 帧 . 植物抗虫基因工程研究进展[J]. 生物工
程进展,1994,14:18 - 24.
[6] 高 瑛,瞿礼嘉 . 植物凝集素的分子生物学研究[J]. 生物
技术通报,2000,5:18 - 22.
[7] 王志斌,李学勇 . 植物凝集素与抗虫基因工程[J]. 生物技
术通报,1998,2:5 - 10.
[8] 潘 科,黄炳球,侯学文 . 植物凝集素在病虫害防治中的研
究进展[J]. 植物保护,2002,4:42 - 45.
[9] 庞彩红,咸 洋,夏 阳,等.磷脂酰肌醇合成酶 PIS基因植
物表达载体的构建[J].山东林业科技,2010,189(4) :6 -
10.
[10] J. 萨姆布鲁克,E. F. 费里奇,T. 曼尼阿蒂斯著 . 金冬雁等
译.分子克隆实验指南(第二版).北京:科学出版社,1999.
31第 6 期 田华英等:尾穗苋凝集素(ACA)基因植物表达载体的构建