全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 3期，第 451-455页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 451-455
研究报告
Research Report
AtTPS03基因 RNA干扰载体的构建及拟南芥转化
杜培粉 1,2 伍林涛 2 姚远颋 1,2 尹峰 1,2 阮颖 1,2* 刘春林 2*
1湖南农业大学生物科学技术学院,长沙, 410128; 2作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙, 410128
*通讯作者, Yingruan@hotmail.com; liucl@hunau.net
摘 要 本研究以拟南芥 DNA为模板，将罗勒烯合成酶 AtTPS03基因的一个目的片段克隆到 T-载体上。
对克隆片段测序后，进行 Blast比对，结果目的片段的序列与 GenBank上报道的序列同源性达到 100%。根据
RNA干扰的基本原理，将目的片段正反向连到干扰载体 pFGC5941查尔酮内含子的两侧，经限制性酶切和
PCR扩增检测，证明已成功构建了干扰载体 P-2AT03。利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥。收获的种子在
含草丁膦的培养基上筛选抗性苗，通过对抗性苗的 PCR检测，已成功获得了 12株转基因苗。这些转基因苗
为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础。
关键词 AtTPS03基因, RNA干扰,拟南芥转化
Construction of the RNAi Vector of AtTPSO3 Gene and Arabidopsis Trans-
formation
Du Peifen 1,2 Wu Lintao 2 Yao Yuanting 1,2 Yin Feng 1,2 Ruan Ying 1,2* Liu Chunlin 2*
1 College of BioScience and Biotechnology of Hunan Agriculture University, Changsha, 410128; 2 Pre-State Key Laboratory for Germplasm Innova-
tion and Resource Utilization of Crop, Changsha, 410128
* Corresponding authors, Yingruan@hotmail.com; liucl@hunau.net
DOI: 10.3969/mpb.007.000451
Abstract In this study, we have cloned a goal fragment of ocimene synthase AtTPS03 gene to the T-vector with
Arabidopsis thaliana DNA as template. After the sequencing and blasting in GenBank, the identification between
our cloned sequence and published sequence is 100%. According to the basic principles of RNA interference, the
fragment was inserted to both sides of CHS intron of pFGC5941 in forwards and reverse way. The interference
vector P-2AT03 was constructed successfully by restriction endonuclease analysis and PCR test. Arabidopsis
thaliana was transformed by Agrobacterium tumefaciens-mediated and the recoverd seeds were screened on MS
containing glufisinate ammonium. After PCR detection, 12 transgenic seedlings were obtained, which lays a good
foundation for further study on the function of ocimene and ocimene synthase.
Keywords AtTPS03 gene, RNA interference, Arabidopsis thaliana transformation
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基金项目：本研究由湖南省自然科学基金项目(05FJ4020)资助
Pare 和 Tumlinson (1999)研究发现 β- 罗勒烯
(β-ocimene)是一种单萜挥发性有机物，当植物，如拟
南芥、利玛豆、棉花、马铃薯、烟草、玉米，被取食或者
机械损伤后，受害植株的叶片会散发出来罗勒烯信
号分子。Kessler和 Baldwin (2001)认为罗勒烯作为
一种气传信号分子，在不同的植物个体之间的化学
通讯中起着重要作用。F觀ldt等(2003)发现 AtTPS03
是 AtTPS基因家族中一种编码单萜合酶的基因，这
种单萜合酶能高特异性催化香叶基二磷酸形成罗勒
烯。此外，罗勒烯诱导能激发植物防御基因的表达。
刘春林等(2004, 科学通报 , 49(22): 2373-2374)发现
β-罗勒烯能诱导完整植物中与水杨酸和茉莉酸有关
防御基因的表达，解除水杨酸和茉莉酸的拮抗作用。
Napoli等(1990)研究认为 RNA干扰(RNA inter-
ference, RNAi)作用是生物体内的一种通过双链 RNA
(double-stranded RNA, dsRNA)分子在 mRNA水平上
关闭特异性序列的基因表达或使其沉默的过程，即
序列特异性转录后基因沉默(post-transcriptional gene
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Molecular Plant Breeding
silencing, PIGS)，Wassenegger等(1994)报道 RNAi技
术具有高效性和高度特异性，作为一种敲除基因的新
技术，已成为基因功能研究中快速、简便的新方法。
本研究根据转录后基因沉默的机制，构建
AtTPS03基因 RNA干扰载体，将目的表达框转入拟
南芥，使细胞中相同序列的 mRNA被降解，以实现
使 AtTPS03基因其沉默的目的。靶基因的表达受到
干扰后，β-罗勒烯的合成减少，从而可探讨AtTPS03
基因完全沉默或低表达情况下，对植物的生长发育
和抗性的影响。
1材料与方法
1.1材料
由湖南农业大学植物代谢调控研究组提供的哥
伦比亚野生型 (Arabidopsis thaliana Col-0)拟南芥；
菌株 DH5α 和 LBA4404 为湖南农业大学植物代谢
调控研究组保存菌种；载体与质粒为 pMD18-T载体
购自 TaKaRa公司，pFGC5941干扰载体为湖南农业
大学植物代谢调控研究组保存质粒。
1.2拟南芥总 DNA的提取
以 Col-0 幼叶为材料，参照吕金海和伍贤进
(2005)报道的 CTAB法制备，并作修改，主要是省略
了水浴保温的步骤。
1.3引物设计及 AtTPS03基因片段的克隆
登陆网站 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，
根据 GenBank上的基因序列(AY151086)，采用引物
设计软件 Primer primer5.0设计引物，扩增 AtTPS03
基因片段总长为 373 bp，并根据表达载体 pFGC5941
的限制性内切酶酶切位点，在上游和下游引物的 5
端分别加入AscⅠ/BamHⅠ和NcoⅠ/XbaⅠ位点。引物序
列如下：OF2：5-GGCGCGCCGGATCCATGTTTTTG-
ACGGAAATATTGGAGT-3 (AscⅠ/BamHⅠ)；OR2：
5-CCATGGTCTAGACTAGAGAGGGATTTGAGC-
TCGTCTT-3 (NcoⅠ/XbaⅠ)。
PCR 反应体系为 50 μL，反应条件：94℃预变
4min，94℃变性 40 s，64℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，
4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行
回收纯化，用于下一步反应。
1.4 PCR产物的克隆与测序
由高保真 Pfu聚合酶扩增得到的 PCR产物纯化
后，用 A-Tailing试剂盒加 A尾与 pMD18-T载体连
接成 pMD18-T+AtTPS03，参照《分子克隆实验指南》
第三版所述的热激法将此连接质粒转化到大肠杆菌
DH5α感受态细胞中，重组子经鉴定后送上海英俊公
司测序。
1.5反向插入 AtTPS03基因片段
用 BamHⅠ和 XbaⅠ对 pMD18-T+AtTPS03 和
pFGC5941质粒分别进行双酶切，目的片段和载体用
切胶回收试剂盒回收，按 3:1的连接体系进行过夜连
接，将切下的 AtTPS03片段插入 pFGC5941的相应位
点，构建成 pFGC5941 (AtTPS03)质粒，简称 P-AT03。
1.6正向插入 AtTPS03基因片段
用 AscⅠ和 NcoⅠ对 pMD18-T +AtTPS03 和
P-AT03质粒进行酶切，目的片段和载体用切胶回收试
剂盒回收，按 3:1的连接体系进行过夜连接，将切下的
AtTPS03 片段插入 P-AT03 质粒，构建成 P-AT03-
AtTPS03质粒，简称 P-2AT03质粒，即 AtTPS03基因
RNA干扰载体。
1.7遗传转化
采用Maliga等(2000)中的冻融法将构建好的干
扰载体 P-2AT03转化至根癌农杆菌 LBA4404感受
态细胞中，把菌液涂布于含有卡那霉素的 YEB固体
培养基上，于 28℃条件下培养 2 d，挑取单菌落进行
PCR检测。然后进行农杆菌的扩大培养，利用浸染法
转化拟南芥。
1.8草丁膦浓度筛选
用草丁膦(glufosinate, PPT)对哥伦比亚野生型拟
南芥种子进行浓度梯度筛选，运用等差数列，公差为
0.2，浓度范围为 0~1 mg/L，共设 6个梯度，然后再缩小
浓度筛选范围。最后确定 PPT筛选浓度为 0.7mg/L，用
此浓度筛选转化子。
1.9 PCR检测
根据pFGC5941上的 CHS内含子序列和终止子
序列设计两条正反向引物，引物序列为：Intron-B：
5-CACTCCAAAGAAAGAGAAACTGACA-3；Poly
AR：5-CTCAGGTTTTTTACAACGTGCACAA-3。用
这对引物对筛选出的抗性苗进行 PCR检测。
2结果与分析
2.1目的片段的克隆和测序
根据合成的引物的退火温度，设计温度梯度
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PCR，确定最佳的退火温度为 64℃。然后以 64℃为
退火温度做 PCR扩增，扩增结果如图 1，从电泳图可
以发现扩增出了 370 bp左右的亮带，扩增片段的大
小与我们预期的结果一致。回收 PCR产物，连接到
pMD18-T载体上，用热激法转化大肠杆菌 DH5α的
感受态细胞，取 100 μL涂到 LB固体培养基上(氨苄
青霉素 50 μg/mL)。选取阳性克隆送往公司测序，测
序结果表明扩增产物长度为 399 bp (包括酶切位点
序列)，将克隆的 AtTPS03基因片段在 GenBank上进
行 Blast分析，克隆的基因片段与登录的 AtTPS03基
因 AY151086.1同源性最高，达到了 100%。这表明测
序结果与已发表的序列一致，所克隆的序列是正确
的基因扩增片段。
2.2 RNA干扰载体的酶切验证
用 BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切 pMD18-T-AtTPS03
(图 2)，得到 370 bp左右的条带，与我们的目的要求
相符，回收小片段，反向插入到表达载体 pFGC5941
上；双酶切验证结果如图 3，也同样得到 370 bp左右
的条带，这说明 AtTPS03基因片段已成功插入到了
质粒 pFGC5941上。而正向片段的插入是先用 AscⅠ
和 NcoⅠ对 pMD18-T+AtTPS03进行双酶切，同时
AscⅠ和 NcoⅠ分别单酶切干扰载体 P-AT03，再将双
酶切得到的目标产物连到两次单酶切后的 P-AT03上，
构建成 P-2AT03；用 AscⅠ和 NcoⅠ两次单酶切验证
图 2质粒 pMD18T+AtTPS03中目的片段
注: M: 1 kb DNA LadderⅡ; 1~4:双酶切片段(BamHⅠ和 XbaⅠ)
Figure 2 pMD18T+AtTPS03 digested by BamHⅠand XbaⅠ
Note: M: 1 kb DNA LadderⅡ; 1~4: Fragments by BamHⅠand
XbaⅠ
图 4单酶切 P-2AT03 (AscⅠ)
注: M: 1 kb DNA Ladder; 1:单酶切; 2:为对照
Figure 4 P-2AT03 digested by AscⅠ
Note: M: 1 kb DNA Ladder; 1: product by AscⅠ; 2: Control
图 5单酶切 P-2AT03 (NcolⅠ)
注: M: 1 kb DNA LadderⅡ; 1,2:单酶切片段
Figure 5 P-2AT03 digested by NcoⅠ
Note: M: 1 kb DNA LadderⅡ; 1,2: Products by NcoⅠ
AtTPS03基因 RNA干扰载体的构建及拟南芥转化
Construction of the RNAi Vector of AtTPSO3 Gene and Arabidopsis Transformation
图 1 AtTPS03目标片段的 PCR产物
注: M: 1 kb DNA Ladder; 1: PCR产物
Figure 1 PCR test of AtTPS03 fragment
Note: M: 1 kb DNA Ladder; 1: PCR product
如图 4，图 5，最终得到了 370 bp左右的带，符合我们
的目的要求，这说明我们成功的构建了 RNA干扰载
体 P-2AT03。
2.3 PPT浓度梯度筛选
先用 PPT筛选哥伦比亚野生型种子，首先选取
0、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L PPT的 6个
梯度浓度，确定筛选浓度的大致范围在 0~1 mg/L之
间；然后在此之间选取公差为 0.2，进行筛选，筛选结果
如图 6A，从图上可以看出从 PPT浓度为 0.8mg/L开始
就出现黄花苗，因此再设 0.6 mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L
共 3个梯度，筛选结果如图 6B，因此可以确定筛选浓
度为 0.7 mg/L。
图 3 P-AT03的双酶切(BamHⅠ和 XbaⅠ)
注: M: 1 kb DNA Ladder; 1,3:双酶切; 2,4:对照
Figure 3 P-AT03 digested by BamHⅠ and XbaⅠ
Note:M: 1 kbDNALadder; 1,3: Fragments byBamHⅠ, XbaⅠ; 2,4:
Control
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分子植物育种
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图 6 PPT浓度筛选
注: A: 1~6的 PPT浓度分别为 0, 0.2 mg/L, 0.4 mg/L, 0.6 mg/L,
0.8 mg/L, 1 mg/L (15 DAG); B: 7~10 的 PPT 浓度分别是 0,
0.6 mg/L, 0.7 mg/L, 0.8 mg/L (10 DAG)
Figure 6 The density screening of PPT
Note: A: PPT density of 1~6 are 0, 0.2 mg/L, 0.4 mg/L, 0.6 mg/L,
0.8 mg/L, 1 mg/L (15 DAG), respectively; B: PPT density of 7~10
are 0, 0.6 mg/L, 0.7 mg/L, 0.8 mg/L (10 DAG), respectively
2.4用筛选浓度筛选转化种子
将浸染转化得到的种子，经消毒灭菌后，铺到
PPT浓度为 0.7 mg/L的 MS培养基上，经 4℃春化
48 h后，放在组培室中生长 15 d筛选抗性苗(图 7)，
图中生长茁壮，叶片绿根系发达的即为抗性苗。
2.5抗性苗的 PCR检测结果
用 CTAB法提取抗性苗叶片的 DNA，再以其为
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模板，Intron-B为正向引物，poly AR为正反向引物，
进行 PCR扩增，电泳结果如图 8，从电泳图上可以看
出得到了 750 bp左右的带，这与我们的要求一致，从
而说明干扰载体 P-2AT03上的目标片段已转到拟南
芥中，目前共得到 12株转基因苗，移栽后各时期的
生长如图 9。
图 8抗性苗的 PCR检测
注: 1: DNA marker 15 000+2 000; 2: 阴性对照; 3: 阳性对照;
4~17:转化苗DNA PCR结果
Figure 8 PCR detection of resistant seeding
Note: 1: DNA marker 15 000+2 000; 2: Negative control; 3: Posi-
tive control; 4~17: PCR result of transforming plant DNA
图 9转基因苗各生长期
注: A: 25天; B: 30天; C: 35天; D: 40天
Figure 9 Every growing period of transgenic plant
Note: A: 25 d; B: 30 d; C: 35 d; D: 40 d
图 7转化子的筛选
注:叶片绿根系发达的即为抗性苗
Figure 7 The screening of transformants
Note: The resistant seedlings have green leaf and well-developed
root system
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3讨论
在构建干扰载体的时候，要在启动子的下游插入
正向与反向基因片段，而且必须在两者之间有适当长
度的内含子序列，以便在转入拟南芥后形成发夹结
构，由发夹结构形成 20 bp左右的 siRNA，由 siRNA
干扰 AtTPS03基因的表达，而质粒 pFGC5941在启动
子的下游恰好有一个 1 400 bp的内含子序列，十分符
合用来构建干扰载体的条件。另外还牵涉到插入正反
向片段的先后问题，一般而言，先插入正向片段或者
先插入反向片段并没有什么区别，但是仔细分析
pFGC5941及干扰片段的酶切位点我们发现，一旦
AtTPS03基因片段两端的酶切位点确定以后，插入的
先后就已经确定下来了(图 10;图 11)。我们是以图 11
在 AtTPS03基因片段两端引入酶切位点，那么就只能
首先在 pFGC5941上插入反向片段。如果先插入正向
基因片段，那么在插入正向基因片段后，为了下一步
插入反向基因片段，用 BamHⅠ和XbaⅠ酶切载体
pFGC5941+AT03，那么在 pFGC5941内含子下游切
开一个切口的同时，会把已经插入到 pFGC5941上的
正向片段也切断，所以我们的酶切位点设计决定了
先插反向，再插正向(设启动子的方向为正向)。
参考文献
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图 11引入酶切位点的方式
Figure 11 The style of restriction endonuclease order
图 10质粒 pFGC5941的酶切位点
Figure 10 The restriction endonuclease of pFGC5941
AtTPS03基因 RNA干扰载体的构建及拟南芥转化
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