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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
蛋白激发子能激活植物免疫系统，诱导植物广
谱抗性，成为现代植物保护新的研究方向。蛋白激
发子激发植物防御反应主要包括植物对激发子的识
别（与植物靶标结合）、信号传导以及防卫基因表达
调控等［1-3］，其中与植物靶标结合是蛋白激发子诱
导植物抗性的开关［4，5］，也是揭示激发子诱导植物
抗性机制的关键。尽管已经分离了众多的微生物激
发子（效应子），但只鉴定了少数激发子的靶标，主
要是寡糖激发子和细菌、卵菌激发子，其中研究比
收稿日期 ：2014-02-20
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31272086）
作者简介 ：唐小丽，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：tangxiaoli200845@163.com
通讯作者 ：杨秀芬，研究员，研究方向 ：蛋白激发子诱导植物抗病性作用机理 ；E-mail ：yangxiufen@caas.cn
真菌蛋白激发子 PevD1 互作蛋白的酵母双杂交筛选及
融合蛋白的原核表达
唐小丽  伍文宪  韩磊  杨秀芬 
（中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100081）
摘 要 ： PevD1 是大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）发酵液中分离纯化的一种新蛋白激发子，能激发烟草和棉花的免疫防御
反应，提高抗病性。旨在深入研究 PevD1 的作用机理，利用酵母双杂交系统，以 PevD1 为诱饵蛋白，筛选拟南芥中 PevD1 的互作
蛋白，经复筛、回转验证得到 3 个候选互作蛋白基因 R1，R2 和 R4。利用同源克隆技术获得烟草中互作蛋白编码基因 NR1、NR2
和 NR4 ；经酵母双杂交验证其中的 NR2 蛋白能与 PevD1 特异性结合。利用原核表达系统，成功构建了重组表达载体 pMAL-C2X-
NR2 并转化大肠杆菌细胞，经 IPTG 诱导获得了可溶性表达的 NR2 融合蛋白。
关键词 ： 蛋白激发子 互作蛋白 酵母双杂交 原核表达
Screening of Interacting Proteins with Fungal Elicitor PevD1 by Yeast
Two Hybrid System and High Expression of Recombinant in E. coli
Tang Xiaoli Wu Wenxian Han Lei Yang Xiufen
（The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of
Agricultural Science，Beijing 100081）
Abstract: PevD1, a fungal protein elicitor, was secreted from Verticillium dahliae and could induce hypersensitive responses（HR）and
systemic acquired resistances（SAR）in tobacco plant. In this study, we screened its interaction partners using yeast two hybrid system with
Arabidopsis thaliana cDNA library. Three potential interacting proteins were obtained. Homologous genes NR1, NR2 and NR4 in Nicotiana
tobacum were cloned. Yeast two-hybrid binding assays confirmed NR2 protein strangely binding with PevD1. The entire coding region of NR2
gene was cloned into the bacterial expression vectors pMAL-C2X. After IPTG induction and SDS-PAGE analysis showed that the target protein
was expressed at a high level in bacterial cells.
Key words: Fungal elicitor PevD1 Interacting protein Yeast two hybrid system Protein expression
较清楚的是细菌鞭毛效应蛋白 flg22 的受体 FLS2 和
延伸因子 Tu（Elongation factor Tu，EF-Tu）的受体
EFR［6-8］。细菌激发子（效应子）通过分泌通道进入
植物并与植物靶标蛋白互作，但目前真菌效应子（激
发子）进入植物细胞的分子机制尚不清楚，而且这
些激发子与植物互作蛋白的研究也比较缓慢。
PevD1 是本实验室从大丽轮枝菌（Verticillium
dahliae）发酵液中分离到的一个新蛋白激发子，前
期研究证明，该蛋白激发子能够激活烟草早期防御
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期114
信号事件的发生（叶片 H2O2 的积累、细胞活性氧
的爆发、胞外碱化以及 NO 的产生和积累）；引起防
御物质（胼胝质、酚类和木质素）的产生和积累 ；
诱 导 烟 草 叶 片 的 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶（L-phenylalanin
ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（Polyphenol oxid-
ase，PPO）等防御酶活性的提高，激发烟草产生系统
获得抗性（Systemic aquired resistance，SAR）［9，10］。
但烟草如何识别 PevD1 而激发烟草抗病反应目前尚
不清楚。本研究用酵母双杂交系统筛选 PevD1 互作
蛋白，利用植物识别激发子的蛋白序列具有保守性
的特点，同源克隆 PevD1 在烟草中的互作蛋白，同
时建立该互作蛋白的大肠杆菌表达体系，以期为深
入研究 PevD 的功能以及二者在植物细胞体内和体外
结合验证研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
三生烟（Nicotiana tabacum var. Sumsun NN）种
子由本实验室保藏。酵母双杂交系统中的拟南芥
cDNA 文库，酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）Y2H-
gold，pGADT7（AD）和 pGBKT7（BD）质粒，培养
基 ：SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-Trp/-Leu（DDO），SD/-
His/-Trp/-Leu（TDO），SD/Ade/-His/-Trp/-Leu（QDO），
SD/Ade/-His/-Trp/-Leu/x-α-gal 等 购 于 Clontech 公 司。
大肠杆菌感受态 Trans5α 购自北京全式金公司 ；原
核表达载体 pMAL-C2X 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 诱饵载体的构建 质粒提取、双酶切、连接
及转化等参照试剂说明书和相关的分子生物学方法
手册［10］。简要操作步骤如下 ：PCR 扩增得到 PevD1
全 长 序 列， 将 PevD1 全 长 序 列 和 提 取 的 BD 载 体
进行双酶切，再连接形成 BD-PevD1 重组载体，在
ADH1 启动子驱动下表达 GAL4 BD-PevD1 的融合蛋
白并测序验证。
1.2.2 诱饵蛋白 PevD1 在酵母细胞中的表达及自激
活的检测 采用 PEG/LiAc 法将上述构建的 BD-PevD1
载 体 转 化 酵 母 Y2HGold， 然 后 用 菌 落 PCR 和
Western blot 检测验证 PevD1 在酵母细胞中的表达。
虽然 PevD1 是一个真菌激发子，在酵母细胞中也具
有潜在的激活基因转录的活性，所以在进行酵母双
杂交试验前，先检测 BD-PevD1 能否自激活双杂交宿
主菌 Y2Hgold 的报告基因。将分别转化 BD-PevD1+
AD 和 BD+AD 组合质粒的酵母细胞涂于 DDO 和 QDO
平板，30℃倒置培养 3 d，观察酵母菌的生长情况。
1.2.3 PevD1 在 拟 南 芥 中 互 作 蛋 白 的 筛 选 将 转
入 BD-PevD1 的酵母悬浮细胞（浓度大于 1×108 个
细胞 /mL）5 mL 与 1 mL 文库细胞混合，加入含有
50 μg/mL 的卡那霉素培养基中培养 20-24 h（30℃，
30-50 r/min）。1 000 r/min 离心 10 min，收集菌体，
然后用 10 mL 0.5×YPDA 重悬。取细胞悬浮液 200
μL 涂 于 TDO 和 QDO 平 板（ 共 50-55 个 ），30℃，
倒置培养 3-8 d。在 QDO 平板上得到的阳性克隆，
再划线于 QDO+X-α-Gal 平板，30℃恒温培养 3-5 d
观察是否变蓝［11］。排除明显的假阳性克隆后，用酵
母 PCR 检测试剂盒进行菌落 PCR，琼脂糖电泳分离
后进行胶回收、测序。通过美国国家生物技术信息
中心（NCBI）数据库中的 BLAST 进行同源性比较，
剔除非编码序列及移码蛋白，以确认与 PevD1 相互
作用的候选蛋白。
1.2.4 酵母双杂交阳性克隆的鉴定 将从文库中
筛选到的阳性克隆连接到诱饵载体 BD 上，同时将
PevD1 克隆到 AD 载体上，然后将两种质粒共转化
酵母细胞 Y2Hgold。将共转酵母细胞涂于 DDO 和
QDO 平板，30℃，恒温培养 3-5 d。在 QDO 平板上
生长的菌落，划线于 QDO+x-α-gal 平板，30℃恒温
培养 3-5 d 观察是否变蓝［12］。
1.2.5 PevD1 在烟草中互作蛋白基因的同源克隆
在 NCBI 数据库中查找与 R1、R2 和 R4 同源的烟草
基因序列 NR1、NR2 和 NR4，用植物组织 RNA 提取
试剂盒（北京全式金公司）提取三生烟总 RNA，取
2 μg mRNA 用于 cDNA 第一链的合成（具体方法参
见北京全式金公司反转录试剂盒说明书）。根据从数
据库中获得的 NR1、NR2 和 NR4 基因序列设计特异
引物，通过 PCR 扩增目的基因 ：94℃预变性 2 min ；
94℃变性 30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸 1 min，30
个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。目的条带经胶回收
纯化后连接到 pMD18-T 载体中，转化至大肠杆菌感
受态细胞 Trans5α，由北京华大公司完成测序。
1.2.6 互作蛋白 NR2 的原核表达 提取原核表达载
体 pMAL-C2X 以及测序正确的 pMD18-T-NR2 质粒，
2014年第10期 115唐小丽等：真菌蛋白激发子 PevD1 互作蛋白的酵母双杂交筛选及融合蛋白的原核表达
用限制性内切酶 EcoR I 和 BamH I 双酶切并回收载
体片段及目的基因片段，22℃连接 15 min 后转化至
表达宿主菌 E.coli BL21（DE3）中，28℃过夜培养，
待长出单菌落，以单菌落为模板进行菌落 PCR，筛
选出阳性转化子后送公司测序。挑取 pMAL-C2X-
NR2 和 pMAL-C2X 空载体的单菌落，分别接种于 50
mL 含 Amp（终浓度为 100 μg/mL）的液体 LB 培养
基中，37℃，220 r/m 振荡培养 6-7 h，再按 1∶100
的比例稀释到 1 L 含 Amp（100 μg/mL）新鲜液体 LB
培养基中，37℃，220 r/min 振荡培养 4 h，温度调至
16℃，转速调至 200 r/min，待温度降至 16℃后，加
入终浓度为 0.1 mmol/L IPTG 诱导培养过夜，次日将
菌液分别移入离心管中，4℃，5 000 r/min 离心 15
min，弃上清，然后用 40-50 mL pH8.0 的 Tris 缓冲
液重悬沉淀菌体，超声破碎后的破碎液 12 000 r/min
离心 50 min，取上清，将上清液先后通过麦芽糖结
合蛋白亲和层析和镍柱亲和层析进行纯化，最后用
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。
2 结果
2.1 诱饵载体构建与鉴定
PCR 扩 增 PevD1 基 因 全 长 为 468 bp， 构 建 含
BD 结构域的诱饵载体 BD-PevD1，形成在 ADH1 启
动子驱动下表达的 GAL4 BD-PevD1 融合蛋白。融
合蛋白表达载体转化酵母细胞后，通过菌液 PCR 鉴
定证明，PevD1 已经转入酵母细胞中（图 1-A），用
PCR 鉴定的阳性克隆培养液进行 Western blot 分析，
结果（图 1-B）显示，PevD1 在酵母中能正确地表达。
2.2 诱饵蛋白PevD1的自激活检测
共转 BD+AD 和 BD-PevD1+AD 组合质粒的酵母
菌均能在 DDO 平板上正常生长，菌落直径一般都＞
2 mm，说明该组合质粒均成功转入，而且 BD-PevD1
表达的融合蛋白对 Y2Hgold 酵母细胞生长无毒性、
无抑制作用。转化 BD-PevD1 的酵母细胞在 QDO 平
板未生长，说明诱饵载体 BD-PevD1 自身不具有转
录激活活性，可进行 PevD1 互作蛋白筛选（图 2）。
2.3 酵母双杂交筛选PevD1拟南芥中互作蛋白
通过多次筛选，在 QDO 平板上得到 108 个阳性
结果（菌落 >3 mm），再次将菌落划线于 QDO+X-α-
Gal 平板培养 3 d 后菌落变蓝的为阳性。提取阳性克
隆质粒并进行测序，将测序结果在拟南芥基因库进
行序列比对，经过对测序的 108 个克隆分析，剔除
一些假阳性结果，从中挑选 15 个与植物的发育、凋
亡、抗逆、抗菌的相关基因克隆到 BD 载体，同时
将 PevD1 基因克隆到 AD 载体，进行酵母双杂交的
回转验证，最终得到 4 个阳性结果（图 3），其中两
个基因与植物的发育与死亡相关（分别命名为 R1，
R2），一个与细胞凋亡调节相关（R3），另一个与植
物的抗菌相关（R4）。但其中转有 R1、R2 和 R4 基
因的转化子在加有 X-α-Gal 的 QDO 平板上生长非常
旺盛（图 3-1，3-2，3-4），而且均在 2-3 d 变蓝。而
图 3-3 显示，R3 在加有 x-α-gal 的 QDO 平板上生长
较弱，而且变蓝需要时间长。所以最终确定 R1、R2
和 R4 为 PevD1 在拟南芥中的候选互作蛋白。
2.4 PevD1候选互作蛋白基因的同源克隆
通过 PCR 扩增获得三生烟中的 3 个候选互作蛋
468
PevD1
BD-PevD1
+ 750
bpA
B
bp
500
M 1 2
A ：菌落 PCR 验证阳性克隆转化子 ；M ：DNA Marker ；1，2 ：克隆转化子。
B ：免疫印迹鉴定 PevD1 基因在酵母细胞中的表达 ；+ ：PevD1 克隆转化子 ；
- ：转有 BD 和 AD 空质粒的阴性对照克隆
图 1 PevD1 基因在酵母细胞 Y2Hgold 中的表达鉴定
DDO
BD-PevD1+AD
BD+AD
QDO
左边 ：Y2Hgold 转化子能在 DDO 培养基生长，说明 AD+BD，BD-PevD1+AD
质粒已转入酵母细胞，同时 pGBKT7-PevD1 表达的融合蛋白对 Y2Hgold 酵母
细胞生长无毒性 ；右边 ：转有 AD+BD 和 BD-PevD1+AD 质粒的转化子不能
在 QDO 平板上生长，说明 BD-PevD1 不能自激活 HIS3 报告基因
图 2 诱饵蛋白 PevD1 的自激活检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期116
1
4
2
3
1 ：R1 ；2 ：R2 ；3 ：R3 ；4 ：R4
图 3 酵母双杂交筛选拟南芥 cDNA 文库互作蛋白
白基因，分别命名 NR1（PUT-173a-Nicotiana_tabac-
um-115714）、NR2（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-64-
888） 和 NR4（PUT-173a-Nicotiana_tabacum-29571），
大小为 891、951 和 774 bp。在 NCBI 数据库比对，
NR1、NR2 和 NR4 与拟南芥同源基因的氨基酸序列
一致性分别达到 68.98%、51.27% 和 40.84%。
750
bp
1000
750
bp
1000
M1 1 2 3 M2
M1 ：DNA Marker1 ；1 ：NR4 基因 774 bp ；2 ：NR1 基因 891 bp ；
3 ：NR2 基因 951 bp ；M2 ：DNA Marker2
图 4 烟草同源基因 NR1、NR2 和 NR4 的克隆
2.5 烟草中PevD1候选互作蛋白的酵母双杂交验证
利用上述的酵母双杂交系统，将 3 个候选互
作蛋白基因构建到 AD 载体并与上述已构建的 BD-
PevD1 载体共转酵母细胞进行验证，结果（图 5-1，
5-2）表明组合质粒已成功共转入酵母细胞，其中
AD-NR1+BD、AD-NR2+BD 和 AD-NR4+BD 转 化 子
在 QDO 平板上不生长，说明这 3 个蛋白均无自激
活活性（图 5-3）。能在加入 AbA 和 X-α-Gal 的 QDO
培养基上生长且在 2-3 d 之内形成菌落的只有 AD-
NR2+BD-PevD1 转化子（图 5-4），说明只有 NR2 与
PevD1 特异性结合。
2.6 候选互作蛋白NR2生物信息学分析
通过 SMART 在线预测蛋白二级结构软件预测
分析，NR2 含有 335 个氨基酸残基，在 N 端 1-199 aa
DDOᒣᶯ
1 2 3 4
AD-NR4
AD-NR2
AD-NR1
AD
QDO/X/Aᒣᶯ
左边 ：Y2Hgold 转化子能在 DDO 培养基生长，说明组合质粒共转入酵母细
胞中，同时 pGBKT7-PevD1，AD-NR1，AD-NR2 和 AD-NR4 表达的融合蛋白
对 Y2Hgold 酵母细胞生长无毒性 ；右边 ：只有 AD-NR2+BD-PevD1 组合质粒
的转化子能在加有 x-α-gal 和 AbA 的 QDO 平板上生长并 2 d 菌落变蓝，说明
NR2 与 PevD1 在酵母细胞中特异性结合并能激活 HIS3，ADE2，AUR1-C 和
MEL1 报告基因
图 5 PevD1 在烟草中候选互作蛋白酵母双杂交验证
形成 4 个低复杂区域，在 C 端有一段包含 130 aa 的
非常保守的氨基酸序列，命名为生长发育与细胞死
亡（Development and cell death，DCD） 结 构 域。 根
据预测 DCD 功能结构域在蛋白中的位置，NbR2 属
于含 DCD 结构域蛋白家族的 I 亚组，目前已报道
的有 4 类蛋白，包括 B2 蛋白、Gda1 蛋白、天门冬
酰 胺 丰 富 蛋 白（N-rich protein，NRP） 和 GDA2 蛋
白（AJ491856.1）。这些蛋白与植物发育、细胞死
亡、植物对病原菌和非生物胁迫的早期反应均有直
接或者间接的关系。系统发育树（图 6）显示，NR2
与胡萝卜的 B2 蛋白和大豆的 N-rich 蛋白聚类为一
类。推测 NR2 可能与 B2 和 N-rich 蛋白具有相似的
功能。
0.1
99
99
100
86
70
69 B2 protein[Daucus carrot]
NR2[Nicotiana tabaccum]
N-rich proteinl[Glycine max]
N-rich protein[Zea mays]
Gda-1[Zea mays]
GDA2[Pisum sativum]
gda-1putative[Arabidopsis thaliana]
gda1[Pisum sativum]
N-rich protein[Oryza sativa Indica Group]
图 6 通过邻接法构建的 NR2 与包含 DCD 结构域的蛋白构
建的系统发育树
2014年第10期 117唐小丽等：真菌蛋白激发子 PevD1 互作蛋白的酵母双杂交筛选及融合蛋白的原核表达
2.7 候选互作蛋白的原核表达
为了进一步研究候选互作蛋白的功能，需要
获得可溶性表达的蛋白。通过原核表达载体的筛
选，pMAL-C2X 适于 NR2 蛋白表达，该表达载体可
以提高目标蛋白的可溶性。为了便于表达蛋白的纯
化，设计引物时在蛋白的 C 端引入 6 个组氨酸密码
子的 HIS 标签。将构建的重组原核表达载体 pMAL-
C2X-NR2 和空白对照质粒 pMAL-C2X 分别转化大肠
杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导后 SDS-PAGE 凝胶
电泳检测，目标蛋白可以可溶性表达。由于所克隆
的 NR2 基因为 951 bp，其编码蛋白分子量约为 38
kD，pMAL-C2X 上的 MBP 标签蛋白为 40 kD，因此
pMAL-C2X-NR2 融合蛋白的分子量约为 78 kD。SDS-
PAGE（图 7）分析显示，与 pMAL-C2X 空载体表达
产物相比，在 70 kD 左右多了一条比较明显的蛋白
条带。将 pMAL-C2X-NR2 破碎的菌液经过镍柱和麦
芽糖结合蛋白亲和层析之后得到单一的蛋白条带，
分子量为 78 kD 左右。说明 pMAL-C2X-NR2 在大肠
杆菌中成功表达，经过亲和层析纯化，得到了纯化
的融合表达蛋白。
生的激发子，通过特有的信号传导途径，调控防御
基因的表达和防御物质的形成，使植物获得免疫特
性。基于蛋白质的相互作用来研究蛋白激发子与植
物互作机理是当前植物病理学的热点领域，也是揭
示激发子诱导植物抗性机制的重要基础，对人类有
效控制植物病害具有非常重要的指导作用［14］。
许多植物可以通过程序性细胞死亡或称过敏反
应（Hypersensitive response，HR）的形式识别病原
微生物或其产生的激发子。死亡细胞产生信号激发
植物免疫系统，使受刺激的周围细胞乃至整株植株
产生防卫反应以限制病原微生物的扩展［15］。本研究
的蛋白激发子 PevD1 是大丽轮枝菌分泌蛋白，引起
烟草的 HR、激发烟草免疫反应，而 HR 反应之后
的免疫分子机制尚不清楚。NR2 属于含 DCD 结构域
蛋白家族的 I 亚组，该家族蛋白参与植物发育、细
胞死亡、植物对病原菌和非生物胁迫的早期反应等，
但 NR2 在烟草中的功能尚未见报道。本研究用酵母
双杂交系统筛选并验证获得了蛋白激发子 PevD1 互
作蛋白 NR2，该蛋白含有非常保守的 DCD 结构域。
2001 年 Ludwig 和 Tenhaken［16］首次发现了大豆 HR
反应强烈诱导了含 DCD 结构域的天门冬酰胺丰富蛋
白（N-rich protein，NRP），其定位于细胞壁［16］，此
后又陆续发现了胡萝卜 B2 蛋白［17］，豌豆 Gda1 蛋
白［18］ 都 包 含 DCD 结 构 域。DCD 是 一 个 约 130 个
氨基酸的长链，包含了几个保守的基序，如Ｎ端的
FGLP 和 LFL 基序、Ｃ端的 PAQV 和 PLxE 基序。目
前只在植物中发现了含有 DCD 结构域的蛋白，随着
对该类蛋白研究的不断深入，已证明含有 DCD 结
构域的蛋白参与由臭氧和病原菌引起的程序性植物
细胞死亡、对病原菌刺激的早期反应以及抗逆反应
等［16，18，19］。蛋白间的相互作用对于生物学功能的
发挥是非常重要的，本研究利用酵母双杂交技术筛
选出 108 个 PevD1 拟南芥文库的候选互作蛋白，通
过理论分析和酵母双杂交回转验证，最终确定烟草
NR2 与 PevD1 特异结合。可以假设 PevD1 可能是通
过识别烟草中的 NR2 后引起烟草的过敏反应，继
而激发了一系列的信号传递通路，最终引起烟草对
TMV 的免疫反应，但这些假设需要今后深入探讨。
为了进一步验证 NR2 与 PevD1 的体外互作，需
要获得可溶性的表达蛋白。本研究曾筛选多种表达
M
78
10
15
35
40
55
70
100
130
170
kD kD
1 2 3 4 5
M ：蛋白 Marker ；1 ：pMAL-C2X-NR2 表达产物 ；2 ：pMAL-C2X 空载体表达
产物 ；3 ：经镍柱亲和层析纯化的 pMAL-C2X- NR2 产物 ；4 ：将 3 纯化的产
物再用麦芽糖结合蛋白亲和层析纯化的产物 ；5 ：将 3 纯化的产物再用麦芽
糖结合蛋白亲和层析纯化的废弃液
图 7 pMAL-C2X-NR2 原核表达和纯化 SDS-PAGE 电泳
分析
3 讨论
植物在长期抵御生物和非生物逆境因子过程中
逐渐形成了先天免疫系统，该系统包含复杂的识别
机制，使植物通过感知“非我”分子来启动防卫反
应抵抗外来入侵者［13］。植物与病原真菌互作是通过
激发子或效应子来实现的，植物细胞接受微生物产
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期118
NR2 的载体，但均未能得到理想的蛋白表达。原核
表达载体 pMAL-C2X 能提高目标蛋白的可溶性，经
诱导表达条件优化，获得了正确表达的可溶性蛋白，
并通过在表达载体上加组氨酸标签和自身带有 MBP
标签进行亲和层析纯化得到了一定纯度和一定浓度
的目的蛋白，为候选互作蛋白的功能研究和体外结
合验证研究奠定了基础。
4 结论
本研究以蛋白激发子 PevD1 为诱饵蛋白，从拟
南芥 cDNA 文库中筛选到 R1、R2 和 R4 三个互作蛋
白。利用同源克隆技术获得了烟草中的 3 个同源基
因，其蛋白分别命名为 NR1、NR2 和 NR4。用酵母
双杂交技术验证了只有 NR2 与 PevD1 特异性结合，
确定了 NR2 是 PevD1 在烟草细胞中的结合蛋白。将
NR2 蛋白基因构建于原核表达载体 pMAL-C2X 上并
转化大肠杆菌中，经诱导表达得到大量可溶性重组
蛋白，通过麦芽糖结合蛋白标签和组氨酸标签亲和
层析技术获得了纯度较高、性质稳定的 MBP-NR2 融
合表达蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）