全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
蛋白激发子 PeaT1的高密度发酵及生理功能检测
刘权　李广悦　曾洪梅　杨秀芬　邱德文
(中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　PeaT1是从极细链格孢菌 (A lternaria tenuissim a)中提取出的一种植物蛋白激发子 ,具有促进植物生长 ,增强作
物抗逆性的功能。由于该蛋白具有无残留、无毒副作用的优点 ,因此具有发展为生物农药的应用前景。在 100 L发酵罐中利
用分批补料技术对 PeaT1工程菌进行高密度发酵 ,通过 AKTA蛋白纯化仪对发酵产物进行了亲和纯化 ,并检测了纯化所得蛋
白对水稻在 15℃低温下生长的影响。发酵最终菌体密度达 80 g/L,每升菌液纯化得到蛋白 90 mg,纯化所得蛋白能够促进水
稻低温下的生长 ,具有激发子活性。
关键词 : 　蛋白激发子 　PeaT1　高密度发酵 　低温
High Cell Density Fermentation of Prote in Elic itor PeaT1
and Its Physiolog ica l Function Detection
L iu Quan　L i Guangyue　Zeng Hongmei　Yang Xiufen　Q iu Dewen
( S ta te Key Laboratory for B iology of Plant D iseases and Insect Pests, Institu te of
Plant Protection, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　PeaT1 is a p rotein elicitor obtained from A lternaria tenu issim a. Itwas found that this p rotein had the function of p romo2
ting p lant growth and increasing the tolerance of crop s. It could be developed as a biological pesticide without residual, and effect char2
acters. In this paper, the engineering bacteria of PeaT1 was used for high cell density fermentation. The exp ressed p rotein was purified
by affinity chromatography. The final cell density reached 80 g/L and about 90 mg/L purified PeaT1 could be gained. The function as2
say indicated that PeaT1 could p romote rice growth at 15℃ temperature. This research could p romote the development of PeaT1 as bio2
logical pesticide.
Key wo rds: 　Protein elicitor　PeaT1　H igh cell density fermentation　Low temperature
收稿日期 : 2009203206
基金项目 :国家高技术研究发展计划“863”(2006AA10A210) ,中央财政国家重点实验室自主课题专项经费资助项目 ( SKL2007SR14)
作者简介 :刘权 (19822) ,男 ,博士研究生 ,主要从事蛋白质药物工程研究 ; E2mail: L iuquannk@gmail. com
通讯作者 :邱德文 ,男 ,研究员 ,主要从事蛋白质药物工程研究 ; E2mail: dewenqiu@hotmail. com　　激发子 ( elicitor)是一类能够诱导植物产生防卫反应的信号分子 ,能够启动寄主植物的抗性 ,依照其化合物性质可以分为 3大类 :寡糖类、糖蛋白类以及蛋白多肽类 [ 1 ]。蛋白激发子通过与植物的受体结合 ,激发植物一系列早期信号反应 ,如离子流改变、磷酸化和去磷酸化、活性氧爆发等 ,通过信号传递 ,诱发植物防御反应 ,导致程序性细胞死亡或者过敏反应以及系统获得抗性 ,提高植物抗逆性 [ 2～5 ]。蛋白激发子对环境无污染 ,符合新型生物农药的要求 ,因此受到广泛关注。有关蛋白激发子的研究 ,已经在拟南芥、烟草、小麦等多种植物中广泛研究 [ 6～8 ]。 PeaT1是从极细链格孢菌中分离纯化到的一种新的蛋白激发子 ,其编码基因 peaT1已被克隆 ( Gen2Bank登录号 : EF030819) [ 9, 10 ]。经验证 ,该蛋白激发子能够提高作物体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶等保护酶的活性 ,促进作物生长 ,提高产量与品质 [ 10, 11 ]。PeaT1具备了开发为生物农药的条件 ,但并未进行其大规模生产的相关研究。高密度发酵技术是在传统的发酵技术上改进的发酵技术 ,它采用增加对数期的生长时间并相对缩短衰亡时间来提高菌体密度的策略 ,极大地改进了发酵工艺 ,提高了产物的比生产率。该技术不仅减
2009年第 8期 刘权等 :蛋白激发子 PeaT1的高密度发酵及生理功能检测
少了培养体积 ,强化下游分离提取 ,还缩短了生产周
期 ,减少设备投资 ,提高了市场竞争力 [ 12～15 ]。
本研究将蛋白激发子 PeaT1进行了高密度发酵
研究 ,得到了大量表达蛋白 ,经纯化后验证了生理功
能活性 ,为 PeaT1开发为生物农药及其生理功能和
分子作用机理研究打下了基础。
1　材料与方法
111　材料
11111　菌种和试剂 　pET28a2peaT1表达菌株 B l21
(DE3)由本实验室保存。 IPTG、卡那霉素购自天根
生化公司。
11112　培养基 　基础培养基 :蛋白胨 10 g/L ,酵母
粉 1 0 g /L, KH2 PO4 2 g/L , K2 HPO4 4 g/L , Na2 HPO4·
12H2 O 7 g/L , (NH4 ) 2 SO4 112 g/L , NH4 Cl 0. 2 g/L,
MnSO4·5H2O 0. 001 g/L , CoCl2·6H2 O 0. 004 g/L,
Na2MoO4·2H2 O 0. 002 g/L , ZnCl2 0. 002 g/L , CuSO4
·5H2O 0. 001 g/L, H3 BO4 0. 005 g /L , FeSO4·7H2O 0.
02 g/L , CaCl2·2H2 O 0. 02 g/L ,MgSO4·7H2 O 0. 3 g/L,
去泡剂 0. 2 m l/L, pH7. 0, Kan 25μg/m l。补料培养
基 : 甘油 160 g/L ,酵母粉 65 g /L ,蛋白胨 65 g/L,
MgSO4·7H2 O 5. 7 g /L , pH7. 0, Kan 25μg/m l。
11113　仪器 　SGD2100L生物反应器 (常州三高生
物技术工程设备有限公司 ) ,含 pH控制器、溶氧控
制器、温度控制器、搅拌控制器、空气混合气及补料
进样系统等。AKTA Exp lorer蛋白纯化仪 ( GE 公
司 ) ,含 H isTrapTM Chelating HP (5 m l)。
112　方法
11211　PeaT1工程菌的分批补料高密度发酵 　将
基础培养基组分中的蛋白胨、酵母粉溶解后加入发
酵罐 , 121℃灭菌 30 m in。冷却后加入其余灭菌后的
组分。补料培养基同上。将构建好的 PeaT1表达菌
BL21 (DE3)挑取单克隆接种于 100 m l LB液体培养
基中 , 37℃、250 r/m in培养过夜 ,作为一级种子。将
一级种子液以 1%的接种量转接于含 500 m l LB培
养基的 2 L摇瓶中 , 37℃、250 r/m in培养 8 h,作为
接入发酵罐的二级种子。将二级种子液以 4%接种
量接种于含 60 L发酵液的 100 L发酵罐内 , 37℃培
养。4 h后开始流加补料 ,补料速度以 5～10 m l/h
递增 , 14 h后加入终浓度 0. 4 mM的 IPTG,继续补
料 ,并降温到 30℃诱导 4 h。在发酵过程中每小时
测定一次菌体密度 (OD600值 ) ;诱导后 0～4 h内每
小时取样测表达情况 ;发酵过程中流加 30%氨水维
持 pH为 6. 0～7. 0;调节搅拌速度和通气量维持溶
氧在 30%以上。
11212　PeaT1重组蛋白的分离和纯化 　5 000 r/m in
离心 10 m in收集菌体 ,测湿菌重 ,以 1∶10 (W /V )比
例重悬于上样缓冲液 ( 15 mM Na2 HPO4·12H2 O,
5 mM NaH2 PO4·2H2 O , 500 mM NaCl, pH7. 4) ,冰浴
超声破碎。18 000 r/m in离心 40 m in,取上清用 AK2
TA蛋白纯化仪过 H isTrap Chelating柱 ,结合目的蛋
白 ,用平衡缓冲液 ( 15 mM Na2 HPO4·12H2 O, 5 mM
NaH2 PO4·2H2 O, 500 mM NaCl, 75 mM咪唑 , pH7. 4)
充分平衡 ,去除非特异结合的杂蛋白后 ,用洗脱缓冲
液 (15 mM Na2 HPO4·12H2 O , 5 mM NaH2 PO4·2H2 O,
500 mM NaCl, 200 mM咪唑 , pH7. 4)洗脱得到目的
蛋白。用 BCA试剂盒 [ 16 ]测定蛋白浓度 ,计算蛋白
产量。
11213　PeaT1对水稻低温条件下生长的影响 　水
稻种子分别用 2. 5、5、10、20μg/m l的 PeaT1蛋白浸
泡处理 ,用清水作对照。每个处理 20株 ,重复 3次。
发芽后于 15℃生长 , 9 d后调查株高情况。统计分
析数据 ,计算差异显著性。
2　结果与分析
211　PeaT1工程菌的高密度发酵情况
0～4 h细菌处于生长延滞期 ,这个期间菌体的
密度较小 ,消耗培养基量较少 ,溶氧变化不大 ,发酵
罐中的培养基养分充足 ,因此没有流加补料。4～14
h细菌生长旺盛进入对数生长期 ,菌体密度提高较
快 ,消耗培养基量较大 ,溶氧也下降较快 ,这个期间
以 5～10 m l/m in的速度流加补料。为维持 pH稳
定 ,于第 6 h开始流加 30%氨水。为保持溶氧 ,增
大通气量并加大搅拌速度 ,转速由 4 h时的 250 r /
m in逐渐递增到 680 r /m in。14～18 h为诱导期 ,
菌体生长进入平台期。SDS2PAGE比较诱导后 0～
4 h的表达量 ,发现 1～3 h增长较快 , 3～4 h增长
不明显 ,已达最大表达量 ,蛋白表达率占总蛋白量
的 30%左右 (图 1)。发酵过程中的菌体密度变化
情况见图 2。
361
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
M. 蛋白分子量 Marker; 0～4. PeaT1诱导后 0～4 h的表达情况
图 1　PeaT1的诱导 0～4 h的表达情况
图 2　PeaT1高密度发酵中的菌体密度和比生长速率曲线
M. 蛋白分子量 Marker; 1. 经过亲和纯化后的 PeaT1
图 3　PeaT1的 H is2Tag亲和纯化
212　PeaT1工程菌的分离和纯化
菌体离心称重后 ,计算出最终菌体密度为 80 g/
L。经过重悬、超声破碎 ,并用 AKTA蛋白纯化仪通
过 H is柱亲和层析后得到目的蛋白 ,经 SDS2PAGE
检测纯度达到 90%以上 (图 3)。用 BCA法检测浓
度后计算 ,每克湿菌能得到约 1. 15 mg蛋白。因此 ,
每升菌液可得蛋白约 90 mg。
213　PeaT1促进水稻低温条件下的生长
使用 PeaT1处理的水稻植株 ,在 15℃条件下生
长明显好于对照 , 9 d时株高均高于对照 (图 4)。经
统计分析 , PeaT1处理与对照为 1%水平时极显著差
异。株高数据和统计分析结果见表 1。
图 4　PeaT1促进水稻低温条件下的生长
表 1　PeaT1促进水稻植株低温条件下的生长
处理 株高 ( cm)
CK 5. 85 ±1. 52C
PeaT1 (2. 5μg/m l) 8. 40 ±1. 68A
PeaT1 (5μg/m l) 8. 17 ±1. 49A
PeaT1 (10μg/m l) 8. 21 ±1. 65A
PeaT1 (20μg/m l) 7. 56 ±1. 43B
　注 :表中同列数据后不同大写字母表示 1%水平时差异显著
3　讨论
高密度发酵的目标是提高目的蛋白的表达量和
工程菌产量 ,在追求高密度生长的同时确保蛋白质
的高表达效率。受表达的外源基因的性质影响 ,各
种工程菌的发酵没有固定的模式。培养基的组成、
溶氧、pH以及表达条件都是影响发酵效率的重要因
素。在发酵过程中 ,细菌在对数生长期增长迅速 ,溶
氧降低 ,通过增大转速和加大通气量来缓解 ;另外 ,
细菌生长过程中产酸导致 pH降低 ,采用流加补料
和 30%氨水 ,并以甘油为碳源以减少乙酸产生 ,将
pH维持在 6～7之间。由于前期试验表明该蛋白溶
解性比较好 ,不存在形成包涵体的现象 ,因此诱导后
温度稍微降低即可。在诱导后 ,达到最大表达量后
就应及时下罐 ,有利于减少成本和尽快收集保存菌
体。发酵后菌体密度为 80 g/L ,蛋白表达量为 90
mg/L ,达到了高密度发酵的目的。在大规模生产
时 ,诱导剂可以使用乳糖代替 IPTG,以减少发酵成
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2009年第 8期 刘权等 :蛋白激发子 PeaT1的高密度发酵及生理功能检测
本。本试验成功地进行了 PeaT1蛋白的高密度发
酵 ,得到了大量表达的蛋白 ,为生物农药的大规模生
产提供了经验。
作为一种新发现的蛋白激发子 , PeaT1的生理
功能和分子作用机理研究有待进一步深入和完善。
发酵后的蛋白以 H is2Tag做了亲和纯化 ,得到的蛋
白纯度可以满足生理功能研究的需要。在此基础上
检测了纯化蛋白的生理功能 ,结果证明 PeaT1能够
促进低温条件下水稻的生长 ,验证了其蛋白激发子
的功能。另外 ,进一步对该蛋白进行离子交换和分
子筛纯化可以得到纯度更高的蛋白 ,可以用于蛋白
质结构和机理研究 ,也可用于农药审核的标样。
综上所述 ,本研究对 PeaT1蛋白进行了高密度
发酵和纯化以及生理功能检测 ,验证了蛋白的激发
子功能 ,为该蛋白开发为生物农药及其功能和机理
的深入研究奠定了基础。
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(上接第 161页 )
率增加的比较显著 , 2 h基本可以完全脱色 ;对弱酸
蓝的脱色较缓慢 , 2 h的脱色率为 63. 78%。通过对
纯酶 Lac3在两种染料脱色中的研究发现 Phellinus
sp. SYBC2L2所产漆酶具有较好的工业应用前景 ,同
时对今后的研究和工业生产亦提供了一定的理论
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