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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-08
基金项目 : 转基因重大专项（2008ZX08010-004, 2009EX08001-018B）
作者简介 : 唐宏琨 , 博士 , 研究方向 : 蛋白激发子基因转化植物 ; E-mail:thk03@sina.com
通讯作者 : 邱德文 , 研究员 , 研究方向 : 新型蛋白生物农药 ; E-mail:qiudewen@caas.net.cn
蛋白激发子基因 peaT1 转基因棉花的获得及初步鉴定
唐宏琨 曾洪梅 杨秀芬 李国媛 盛德鹏 袁京京 邱德文
（中国农业科学院植物保护研究所 生物防治农业部重点开放实验室，北京 100081）
摘 要： 将来源于极细链格孢菌的蛋白激发子基因 peaT1 克隆到植物表达载体 pCAMBIA2300 上，成功构建了含有增强子和
多联终止子的植物表达载体 pCAMBIA2300-G4AS-peaT1。通过花粉管通道法转化棉花，经卡那霉素抗性筛选、PCR 和 RT-PCR 检
测获得一株转基因棉花植株，其植株茎粗和成铃数均高于非转基因对照株。
关键词： 蛋白激发子 peaT1 花粉管通道 棉花
Identification of Transgenic Cotton with a Protein
Elicitor-encoding Gene peaT1
Tang Hongkun Zeng Hongmei Yang Xiufen Li Guoyuan Sheng Depeng Yuan Jingjing Qiu Dewen
（Key Laboratory for Biological Control of Ministry of Agriculture, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081）
Abstract: The protein elicitor-encoding gene peaT1 obtained from Alternaria tenuissima was inserted to pCAMBIA2300 to construct the
plant expressive vector pCAMBIA2300-G4AS-peaT1 which contains enhancer and poly-terminator. Then, the resulting vector was transferred
into cotton by pollen-tube pathway method. The positive transgenic line was screened with kanamycin resistance,PCR, and RT-PCR. The
resultant plant got more cotton bolls and the stem diameter was higher compared with the control.
Key words: Protein elicitor peaT1 Pollen tube pathway Cotton
自 1987 年 美 国 Agracetus 公 司 获 得 了 首 例 转
Bt 基因的抗虫棉以来，棉花的转基因研究迅速发
展，我国成为继美国之后第二个拥有自主知识产权
并成功研制抗虫棉的国家。中国农业部于 1997 年
批准了转基因棉花的商业化种植，我国转基因棉花
已占棉花种植面积的 60% 以上，产生了显著的经济、
生态和社会效益。花粉管通道法是我国科学家周光
宇首先提出的一种植物转基因技术，由于其简单易
行，具有不依赖植物组织培养、纯合速度快、变异
广泛，以及供受体植物范围广等优点，已被国内近
百家实验室大量应用，并在水稻、棉花、小麦、大
豆及玉米等多种作物中获得新品种或品系［1,2］。棉
花因花器大和繁殖系数高，更适合采用花粉管通道
法进行外源 DNA 导入，而且可避开植株再生的障
碍，该项技术已越来越多地用于棉花抗病抗虫的新
品种培育［3,4］。
激发子是一类能够诱导植物产生防卫反应的信
号分子，在植物与病原菌的互作中起重要作用。当
诱导抗性的蛋白激发子与植物接触后，作用于植物
表面受体，激发植物体内信号传导，诱导植物产生
乙烯、水杨酸、茉莉酸、植保素和病程相关蛋白等，
调节植物的新陈代谢，激活植物的免疫系统和生长
系统，最终表现为植物抗病虫能力的提高和增产［5-7］。
目前已有关于蛋白激发子转基因植物的报道并展现
出较好的应用前景［8-10］。PeaT1 是一种从极细链格
孢菌（Alternaria tenuissima）中分离出来的蛋白激发
子 , 具有诱导多种植物产生系统抗性 , 促进植物生长 ,
改善作物品质等功能［11-13］。在大肠杆菌和毕赤酵母
2012年第1期 61唐宏琨等 ：蛋白激发子基因 peaT1 转基因棉花的获得及初步鉴定
中表达的 PeaT1 蛋白仍具有诱导抗旱、促进根系生
长等生物活性［14,15］，本研究利用花粉管通道法开展
激发子基因 peaT1 的转基因棉花研究，为获得抗病
虫、高产优质的棉花品种提供新材料。
1 材料与方法
1.1 材料
蛋白激发子基因 peaT1 是本实验室科研人员
从极细链格孢菌克隆获得的（GenBank 登录号为
EF030819）；含有增强子和多联终止子序列的中间载
体 pG4AS-cup 由中国生物技术所郭三堆研究员惠赠；
植物表达载体 pCAMBIA2300 本实验室保存 ；基因转
化受体棉花品种湘杂 F15 由湖南省棉花科学研究所
提供。
ExTaq DNA 聚 合 酶、T4 DNA 连 接 酶、 限 制 性
内切酶、DNA Marker、pMD18-T Simple 测序载体和
DNA 片段回收试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司 ；大
肠杆菌感受态细胞 DH5α 和反转录试剂盒 EasyScript
First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 购自北京全式金
生物技术有限公司 ；柱式植物 RNAout 试剂盒购自
天恩泽生物公司 ；高纯度质粒大提试剂盒购自天根
生化科技有限公司 ；卡那霉素购自 AMRESCO 公司 ；
其他化学试剂为国产分析纯产品。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体构建及制备 设计引物扩增蛋
白激发子 peaT1 全长基因，上游引物 P1-peaT1:5-TAC
TGCAGATGGCCAACCCCCGCATTGAAGAG-3, 下游
引物 P2-peaT1: 5-CGCTCGAGCTATATGCTCAGCGCC
ATGATGGA-3。上下游引物分别设置 Pst Ⅰ和 Xho Ⅰ
酶 切 位 点， 并 用 Pst Ⅰ 和 Xho Ⅰ 分 别 双 酶 切 PCR
扩 增 产 物 的 重 组 质 粒 和 中 间 载 体 pG4AS-cup， 将
回收的目的片段连接构建中间载体 pG4AS-peaT1。
用 Hind Ⅲ 和 EcoR Ⅰ 分 别 双 酶 切 pG4AS-peaT1 和
pCAMBIA2300，分别回收目的片段连接构建植物表
达 载 体 pCAMBIA2300-G4AS-peaT1，PCR 检 测 目 的
基因是否成功插入表达载体中。
参照全式金感受态细胞 DH5α 热激转化方法，
将植物表达载体 pCAMBIA2300-G4AS-peaT1 转化大
肠杆菌感受态细胞 DH5α，参照天根生化高纯度质
粒大提试剂盒方法大量提取质粒，测量 OD260 值，
根据 OD260 =1.0 相当于 DNA 50 mg/mL 计算质粒浓度，
将质粒浓度稀释到 20 μg/mL 备用。
1.2.2 花粉管通道法转化棉花 选择第二天即将开
放的花蕾进行自交，从第 2 果台至第 6 果台中选择
开花 20 h 左右、花冠颜色呈浅粉色的花朵作为转基
因操作的对象。用左手食指与中指夹住花柄底端 , 并
用拇指、食指及中指固定在花萼部分 , 使整朵花不会
由于用力而折断 , 然后用右手指尖将花冠自子房基
部拉脱 , 抹平花柱 , 使柱头在子房上部形成一个平整
的界面。使用 50 μL 微量注射器从抹平花柱处沿子
房的纵轴方向进针 , 先进入到约子房长度的 2/3 处 ,
然后再退至约 1/3 处开始注射 , 质粒浓度 20 μg/mL，
注射量为 10 μL，注射时注意不要损伤幼嫩子房的表
皮层。注射完成后 , 在铃柄的基部涂抹 40 mg/L 的赤
霉素溶液 , 摘除该花所在果枝的顶心和该果枝上的
其他幼蕾，以防止注射铃脱落，挂牌标记，注意预
防受体材料病虫害［16］。
1.2.3 转基因棉花的筛选
1.2.3.1 卡那霉素抗性连续筛选 将部分收获的棉
花种子在北京进行田间种植，种植密度为 25 棵 /m2。
待棉苗第二片真叶展开时进行卡那霉素的第一次筛
选，检测浓度为 2 500 mg/L，一周后观察结果。拔
除卡那霉素呈阳性即叶片表面出现黄色斑点的棉株，
剩余的棉株进行下一轮检测，后三轮浓度分别为
2 500 mg/L、3 000 mg/L 和 4 000 mg/L，将卡那霉素
检测呈阴性的棉株挂牌标记。
1.2.3.2 PCR 检测 取卡那霉素检测呈阴性的棉株
幼嫩叶片，参照 CTAB 法提取叶片总 DNA，设计如
下引物进行 PCR 检测目的基因 peaT1 和标记基因
npt Ⅱ。引物分别为 :
P3-peaT1 ：5-ATGGCCAACCCCCGCATTGAAGAG
C-3；P4-peaT1：5-CTATATGCTCAGCGCCATGATGGA
G-3 ；P5-nptⅡ: 5-ATGATTGAACAAGATGGATTGC
ACG-3 ；P6-nptⅡ: 5-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA
GGCGA-3。
1.2.3.3 RT-PCR 检 测 参 照 天 恩 泽 柱 式 植 物
RNAout 试剂盒方法，提取经 PCR 检测呈阳性棉花
植株叶片总 RNA，反转录合成 cDNA，进行 RT-PCR
检测。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期62
1.2.4 转基因植株性状统计
1.2.4.1 植株茎粗 分别测量挂牌标记的 2 号转基
因棉花植株和 20 株无卡那抗性对照棉株的茎粗，测
量地上部分主茎距地面 5 cm 处的外茎粗，每株测量
3 次取其平均值，最后计算 20 株平均值。
1.2.4.2 成铃数 分别统计挂牌标记的 2 号转基因
棉株和 20 株无卡那抗性对照棉株的成铃数，并计算
对照株成铃数平均值。
2 结果
2.1 植物表达载体的构建及制备
回收经 Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ分别双酶切的中间载
体 pG4AS-peaT1 和 pCAMBIA2300 目的片段，连接构
建的植物表达载体命名为 pCAMBIA2300-G4AS-peaT1，
该载体含有增强子元件和多联终止密码子序列的表
达盒。PCR 检测扩增出大小为 624 bp 的目的片段，
如图 1 所示，表明目的基因 peaT1 已成功插入植物
表达载体中。质粒 pCAMBIA2300-G4AS-peaT1 转化
感受态细胞 DH5α 后，经天根高纯度质粒大提试剂
盒制备了大量含有目的基因 peaT1 的表达载体质粒，
将质粒浓度稀释到 20 μg/mL 以备转化棉花。
测。结果（图 2）显示，2 号植株可以扩增出与目的
基因 peaT1 和标记基因 npt Ⅱ大小一致的条带。1 号
植株、3 号植株、对照株和空白对照均未扩增出条带，
质粒阳性对照条带明显。PCR 检测结果表明标记的
2 号植株导入了目的基因 peaT1，而 1 号和 3 号植株
虽然表现出卡那霉素抗性，但并未扩增出相应条带。
M. DNA Marker; 1. 载体 ; 2. 阳性对照 ; 3. 空白对照
图 1 构建载体的 PCR 鉴定
2.2 花粉管通道法转化棉花
冬季在海南三亚共转化约 8 000 朵花，成铃率
19.8%，共收获种子 2.05 kg。注射目的基因后立即
在铃柄基部涂抹 40 mg/L 的赤霉素溶液，且摘除该
花所在果枝的顶心和其他幼蕾，保证了成铃个数。
2.3 转基因棉花的筛选
2.3.1 卡那霉素抗性筛选 取收获的部分种子在北
京种植，共成苗 1 852 株，经 4 次卡那霉素连续筛选，
共得到 3 株卡那霉素抗性棉苗。
2.3.2 PCR 检测 以提取的 3 株卡那霉素抗性棉花
叶片总 DNA 为模板 , 设计的两对引物进行 PCR 检
M. DNA Marker; 1,2、3,4、5,6、7,8、9,10、11,12 分别是 1 号株、2 号
株、3 号株、野生株、阳性对照和空白对照扩增结果，奇数列是 P3 和
P4 扩增结果，偶数列是 P5 和 P6 扩增结果
图 2 转基因植株的 PCR 分析
2.3.3 RT-PCR 检测 从经 PCR 检测的阳性株叶片
中 提 取 总 RNA, 合 成 第 一 链 cDNA， 用 引 物 P3 和
P4 扩增第二链。结果（图 3）显示，RT-PCR 结果
表明目的基因 peaT1 插入 2 号棉株基因组中，并成
功实现转录。
M. DNA Marker; 1. 2 号株 ; 2. 阳性对照 ; 3. 空白对照
图 3 2 号棉株的 RT-PCR 鉴定
2.4 转基因植株性状统计
2.4.1 茎粗 统计 20 株无卡那抗性对照株和 2 号转
基因植株的茎粗，结果（图 4）显示，2 号棉株的外
茎粗为 2.42 cm，明显大于对照株的平均值 1.41 cm，
表明 2 号转基因阳性株的生长状况好于对照株。
2.4.2 成铃数 如图 5 所示，2 号转基因棉株共形
成棉铃 33 个，20 株无卡那抗性对照株的成铃数平
均值为 8.1 个，2 号转基因棉株成铃数明显高于对
照株。
3 讨论
虽然花粉管通道法受到棉花自然花期的限制，
2012年第1期 63唐宏琨等 ：蛋白激发子基因 peaT1 转基因棉花的获得及初步鉴定
图 4 棉株茎粗分析
转基因水稻白叶枯病菌的生长受到明显抑制。蒋冬
花［19, 20］将隐地蛋白 Cry 基因整合到烟草基因组中，
抗病性检测结果表明转化植株对烟草黑胫病菌、赤
星病菌和野火病菌的抗性均有提高。邱德文等［21］
也报道了蛋白激发子基因 PemG1 转化水稻可以提高
水稻抗病性、改善作物品质。本研究通过花粉管通
道法得到的一株转基因阳性株，与对照棉株相比，
不仅外径明显粗壮，且成铃个数较多，这与此前报
道的蛋白激发子 PeaT1 能促进棉花生长、提高棉花
产量相吻合［22］。初步推测蛋白激发子基因 peaT1 的
表达可能启动了植物信号传导，激活了棉花生长系
统从而表现出促进植物生长。本试验中对照株的成
铃数明显少于转基因阳性株，且成铃数不多，主要
是由于田间虫害严重，对照株棉花叶片被大量蚕食，
影响了棉株的正常生长发育 ；而转基因阳性株棉花
叶片生长正常，成铃数较多，表现出抗虫性（结果
拟另文发表）。
本研究获得的转基因阳性材料较少，而且仅进
行了 T1 代部分农艺性状的统计分析，还需要进一步
分析转基因材料后代的遗传稳定性及铃重、衣指、
子指、衣分和麦克隆值等多项指标，综合分析和验
证转基因植株后代的抗病性和抗虫性，期望能从转
基因后代中筛选出抗病虫、高产优质的棉花新品种。
参 考 文 献
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图 5 棉株成铃数分析
在田间操作易受自然环境影响，但与其他转基因技
术比较 , 其操作简便易掌握且转化成本低，不受棉
花基因型限制，可进行大规模转化。另外，花粉管
通道法有效地利用了植物生殖受精过程 , 避开了组
织培养植株再生的难题 , 可以直接获得转基因棉花
种子。花粉管通道法运用中的主要问题是棉花成铃
率较低，如何降低落铃数是保证转化率的关键。我
们发现冬季在海南转化的成铃率高于夏季内地的转
化，可能海南冬季温度和相对湿度适中，更有利于
花粉管通道法转化。操作过程中除了要注意适当稀
植、保证供体 DNA 的纯度和浓度、选择合适的花朵
作为基因转化对象、注射时不要损伤子房外，还需
谨记注射完成后在铃柄基部涂抹赤霉素溶液 , 并摘
除该花所在果枝的顶心，促进营养集中，以降低落
铃率［4］。
蛋白激发子能诱导植物产生抗性、促进植物生
长的特点在生产实践中已得到了广泛的应用，其转
基因植物的研究也取得了较大进展。马玲莉等［17］
将 hrf2 基因导入油菜基因组中，转基因植株叶片上
油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。邵敏等［18］
将来自水稻白叶枯病菌的 hrfAXoo 基因转化水稻，
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（责任编辑 狄艳红）