全 文 ：甲烷氧化过程中铜的作用研究进展*
苏摇 瑶摇 孔娇艳摇 张摇 萱摇 夏芳芳摇 何摇 若**
(浙江大学环境与资源学院, 杭州 310058)
摘摇 要摇 甲烷生物氧化在全球甲烷平衡和温室效应控制中扮演着重要的角色,而铜是甲烷生
物氧化过程中的重要影响因子.一方面,铜是调控不同类型甲烷单加氧酶表达的主要影响因
子,是组成颗粒性甲烷单加氧酶的必需金属元素;另一方面,在自然环境体系中,铜含量及其
形态的变化对甲烷氧化菌的分布、代谢甲烷和非甲烷类有机化合物的能力以及甲烷氧化菌的
特异性铜捕获系统也会产生较大影响.准确把握铜在甲烷生物氧化过程中发挥的作用将有助
于全面了解甲烷生物氧化过程,进而更好地指导甲烷氧化微生物在温室气体减排及非甲烷有
机物污染修复中的应用.本文主要从铜的角度,概述了铜对甲烷氧化菌的分布和活性的影响,
介绍了铜在调控甲烷单加氧酶的表达和活性以及调节甲烷氧化菌铜捕获系统方面的作用,并
展望了其研究方向.
关键词摇 铜摇 甲烷氧化摇 甲烷氧化菌摇 甲烷单加氧酶摇 甲烷氧化菌素
文章编号摇 1001-9332(2014)04-1221-10摇 中图分类号摇 Q93; X172摇 文献标识码摇 A
Copper in methane oxidation: A review. SU Yao, KONG Jiao鄄yan, ZHANG Xuan, XIA Fang鄄
fang, HE Ruo (College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou
310058, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(4): 1221-1230.
Abstract: Methane bio鄄oxidation plays an important role in the global methane balance and war鄄
ming mitigation, while copper has a crucial function in methane bio鄄oxidation. On one side, copper
is known to be a key factor in regulating the expression of the genes encoding the two forms of meth鄄
ane monooxygenases (MMOs) and is the essential metal element of the particulate methane monooxy鄄
genase (pMMO). On the other side, the content and fractionation of copper in the environment
have great effects on the distribution of methanotrophs and their metabolic capability of methane and
non鄄methane organic compounds, as well as on the copper鄄specific uptake systems in methanotro鄄
phs. Thus, it is meaningful to know the role of copper in methane bio鄄oxidation for comprehensive
understanding of this process and is valuable for guiding the application of methanotrophs in green鄄
house gas removal and pollution remediation. In this paper, the roles of copper in methane oxida鄄
tion were reviewed, including the effect of copper on methanotrophic community structure and activ鄄
ity, the expression and activity of MMOs as well as the copper uptake systems in methanotrophs.
The future studies of copper and methane oxidation were also discussed.
Key words: copper; methane oxidation; methanotrophs; methane monooxygenase; methanobactin.
*国家自然科学基金项目(41001148,51178411 和 41371012)和浙江
省自然科学基金杰出青年项目(LR13E080002)资助.
**通讯作者. E鄄mail: heruo@ zju. edu. cn
2013鄄08鄄01 收稿,2014鄄01鄄19 接受.
摇 摇 CH4是一种重要的温室气体,其温室效应是等
量 CO2的 25 倍,对全球温室效应的潜在贡献率约
15%左右[1] . 目前,全球通过自然源和人为源排放
至大气的甲烷约为 600 Tg·a-1,其中,甲烷氧化菌
可消耗约大气甲烷总量的 10%左右,在全球大气甲
烷平衡中扮演了十分重要的角色[2] .
甲烷氧化菌是一类能利用甲烷为唯一的碳源和
能源进行生长的微生物[3] . 甲烷单加氧酶(methane
monooxygenase, MMO)可催化甲烷氧化为甲醇,是
甲烷生物氧化过程中的重要酶系[3] . MMO有两种存
在形式:一种是与细胞膜结合的具有含铜活性中心
的颗粒性甲烷单加氧酶(particulate methane monoox鄄
ygenase,pMMO),它存在于除甲基孢囊菌属(Methyl鄄
ocella) [4]和 Methyloferula[5]以外的所有已发现的甲
烷氧化菌中,可在高铜离子浓度(约 4 滋mol·L-1)
条件下表达[6-8];另一种是分泌在周质空间中的可
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 4 月摇 第 25 卷摇 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Apr. 2014, 25(4): 1221-1230
溶性甲烷单加氧酶(soluble methane monooxygenase,
sMMO),只有少数 I型甲烷氧化菌和 II 型甲烷氧化
菌如甲基球菌属 (Methylococcus)、甲基单胞菌属
(Methylomonas)、甲基细胞菌属(Methylocella)、甲基
孢囊菌属(Methylocystis)和甲基弯曲菌属(Methylosi鄄
nus) [3,9]在铜离子缺乏(<0. 8 滋mol·L-1)的条件下
可分泌产生[10] . MMO 是一种非特异性酶,相比于
pMMO,sMMO具有更广泛的底物专一性. 除了氧化
甲烷外,sMMO还能氧化烷、烯和芳香族化合物,其
氧化降解这类非甲烷类有机化合物的能力一般强于
pMMO[11] .两种形式的 MMO 的表达都主要受铜含
量的调控[12] .一直以来,探究铜调控 MMO表达的机
制是科学工作者们研究的热点.目前,已在一些甲烷
氧化菌中发现了可高效捕获铜的生理系统,该系统
主要受环境中铜含量及形态的调节和影响[6,13-15] .
全面了解铜在甲烷生物氧化过程中的作用将有助于
解析不同生境中甲烷氧化菌的生态分布,调控其在
生态环境中的甲烷氧化活性,使其在温室气体减排
及其他污染治理中发挥有效作用. 本文着重从铜角
度,综述了铜在影响甲烷氧化菌的分布和活性、调控
MMO的表达和活性以及协调甲烷氧化菌铜捕获系
统方面的作用,并对其今后的研究方向提出了展望.
1摇 甲烷氧化菌的种类及铜对其分布的影响
1郾 1摇 甲烷氧化菌的种类
根据甲烷氧化菌的形态、GC% 、代谢途径、膜结
构、主要磷脂酸成分、16S rRNA 基因序列等系列特
征,变形菌门(Proteobacteria)中甲烷氧化菌可分为 2
种:I型和 II型[3,6] . I型甲烷氧化菌包括甲基杆菌属
(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基
微菌属(Methylomicrobium)、甲基单胞菌属(Methyl鄄
omonas)、甲基暖菌属(Methylocaldum)、甲基盐菌属
(Methylohalobius)、甲基热菌属(Methtyhlothermus)、
甲基八叠球菌属(Methylosarcina)、Methylosoma 和甲
基球形菌属(Methylosphaera),都属于 酌鄄proteobacte鄄
ria,它们利用 5鄄磷酸核酮糖途径(RuMP pathway)同
化甲醛,主要含 16鄄C脂肪酸,胞内膜成束分布[3] .此
外,在细枝发菌属(Clonothrix)和泉发菌属(Creno鄄
thrix)中还发现了一些非常态的丝状的甲烷氧化菌,
其也被归为 I型甲烷氧化菌中[16-18] . 域型甲烷氧化
菌主要包括 Methylosinus、Methylocystis、甲基帽菌属
(Methylocapsa)和 Methylocella 属,属于 琢鄄proteobac鄄
teria. II 型甲烷氧化菌利用丝氨酸途径(serine path鄄
way)代谢碳,主要含 18鄄C 磷酸脂肪酸,胞内膜分布
于细胞壁周围[3] . 近年来研究还发现,疣微菌属
(Verrucomicrobia)在全球甲烷平衡中也扮演了重要
角色[6] .这些微生物虽然是从相距甚远的不同地热
区域分离得到,但它们的 16S rRNA 基因序列具有
显著的相似性,被认为是甲基嗜酸菌 (Methylaci鄄
diphilum)的代表[6] . 这些菌不具任何细胞质膜,但
是通过基因组分析,发现了编码丝氨酸代谢途径的
相关酶的基因,此外,还发现了编码完整的 Calvin鄄
Benson鄄Bassham循环的所有基因[19-20],表明该菌属
在代谢途径上的多样性,但目前对这一类甲烷氧化
菌的了解仍不清楚.
1郾 2摇 铜对甲烷氧化菌分布及活性的影响
研究表明,铜离子浓度在一定程度上对甲烷氧
化菌的分布具有重要影响[21-25] . Graham 等[21]对 I
型(Methylomonas albus BG8)和 II 型 (Methylosinus
trichosporium OB3b)甲烷氧化菌在连续流反应器中
的竞争生长研究表明,在铜离子浓度较低或无铜离
子时,II 型甲烷氧化菌为反应器的优势菌. Gebert
等[22]对填埋场生物滤池中甲烷氧化菌群落的分析
结果显示,在渗滤液铜离子浓度约为 3. 5 滋g·L-1
(相当于 0郾 06 滋mol·L-1)的生物滤池中,II 型甲烷
氧化菌 (Methylosinus 和 Methylocystis)占了很高比
例,是最为主要的菌群.此外,Ha 等[23]研究发现,在
添加不同量铜离子(0郾 1、1郾 0 和 10 滋mol·L-1)的条
件下,均以 II 型甲烷氧化菌为主,且不同铜离子浓
度未造成 II型甲烷氧化菌群组成的显著差异,均以
Methylomonas sp. 为主. 由此可推测,无论是在实验
室规模的反应器中,还是在自然生境中,较低的铜离
子浓度(臆10 滋mol·L-1)可能是导致 II型甲烷氧化
菌占主导的重要因素之一.但不同研究体系中,低铜
离子浓度下占主要的 II 型甲烷氧化菌仍存在差异,
表明在低铜离子浓度条件下,II 型甲烷氧化菌的分
布同时还受其他环境因素的影响,如非甲烷类挥发
性有机物[22]等. 相比于 II 型甲烷氧化菌,大多数 I
型甲烷氧化菌的生长则需要在较高浓度的铜离子条
件下进行,这可能是因为在低铜离子浓度下,sMMO
是主要的 MMO[24],而多数 I 型甲烷氧化菌缺少合
成 sMMO的基因序列信息,这一类的甲烷氧化菌需
要更多的铜离子以保证其 pMMO的生成[3,21,25] .
铜离子除了影响甲烷氧化菌群的分布外,亦会
对其氧化活性产生影响,其影响程度主要与铜离子
浓度有关[26-28] . Ha 等[26]在研究铜离子对混合甲烷
氧化菌群活性的影响中发现,加入 0. 64 mg·L-1(10
滋mol·L-1)铜离子可提高 1. 5 ~ 1. 7 倍的甲烷氧化
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率. Lee等[27]对垃圾填埋场覆盖土的研究结果表明,
当铜的加入量小于或等于 100 mg·kg-1时,铜的加
入对甲烷氧化活性可产生促进作用,而当土样中铜
离子浓度提高到 250 mg·kg-1时,甲烷氧化活性将
受到抑制,但继续添加铜,抑制效果并不会进一步增
强. Lontoh等[28]在研究 M. trichosporium OB3b 的甲
烷和三氯乙烯( trichloroethylene, TCE)降解能力中
发现,当培养基中铜离子浓度从 2. 5 滋mol·L-1增加
至 20 滋mol·L-1时,其最大甲烷氧化速率从 300
nmol·min-1·mg-1蛋白下降至 82 nmol·min-1 ·
mg-1蛋白,但 M. trichosporium OB3b 与 TCE 的亲和
力却随铜离子浓度的增加而有所增加,铜离子浓度
为 2. 5 滋mol·L-1时,未监测到 TCE 的降解,但当铜
离子浓度为 20 滋mol·L-1时,可实现 TCE 的降解.
由此可见,铜离子含量的变化,不仅会改变甲烷氧化
菌菌群的分布及氧化甲烷的活性,还会影响其对非
甲烷类有机物的降解能力. 只有通过系统的原位调
查,才能更全面地把握环境中铜含量与甲烷氧化菌
群的生态分布及其活性之间的关系,进而有助于了
解铜在原位甲烷生物氧化及非甲烷类有机物污染修
复中发挥的作用.
2摇 铜对 MMO表达及活性的影响
2郾 1摇 MMO的结构和编码基因
由于 pMMO为膜结合蛋白,在胞外异常不稳定
且对氧气高度敏感,分离纯化困难,故直到 2005 年
人们才开始对产自 Methylococcus capsulatus (Bath)
的 pMMO的晶体结构有了一定的认识[29-30] .对分离
自 M. capsulatus (Bath)和 M. trichosporium OB3b的
pMMO的研究发现,pMMO呈现三聚体结构,是一个
(琢茁酌) 3多肽聚体,由 1 个亚基的 3 个拷贝排列组
成[31],同时具备 1 个双铜离子中心或 1 个单铜离子
中心,以及 1 个仍需验证的单核锌原子活性中心[6] .
编码 pMMO 的基因簇按 pmoCAB 排列,分别编码
22 kD的 酌 亚基、24 kD 的 茁 亚基和 47 kD 的 琢 亚
基[6] .
在 M. capsulatus ( Bath ) 和 M. trichosporium
OB3b的 pMMO的晶体结构(图 1)中,每个 琢茁酌 单
体都被模拟为在 琢 亚基的膜鄄周质界面上含有 1 个
双核或单核的铜中心[6] . 其中,单核铜中心在 M.
capsulatus(Bath)的 pMMO的 琢亚基的周质区域,但
并未在M. trichosporium OB3b的 pMMO的 琢亚基中
有所发现[32-34] .
双核铜金属中心在 M. trichosporium OB3b 和
M. capsulatus (Bath)中也都得到了鉴定,均存在于
琢亚基上.两个铜原子之间的距离很短,约为2. 6 魡,
两个铜原子都通过 3 个氢键连接[33] .在 pMMO中的
这个铜中心不同于其他双核铜氧化酶,其两个铜原
子是通过 6 个氢键连接的,原子间的距离也相对较
远[35-36] .在另一金属结合区(受来自 PmoA 和 PmoC
的氨基酸的协调)中能同时监测到铜和锌,该区并
不是一个稳定的金属结合区,在体内可以被不同的
金属所占据[29,32] . 现有研究已证实,pMMO 的活性
位点位于双核铜中心所在的 琢 亚基的 N鄄末端可溶
域上[37] .由此可推测,铜不仅是 pMMO 的必需金属
组分,还可能与其活性的发挥密切相关.
相对于 pMMO而言,sMMO更易被纯化,故目前
对 sMMO的结构及基因调控机制的研究也更为详
尽. sMMO是一类不含亚铁血红素的含铁酶,属于非
亚铁血红素双核铁蛋白,是一个由 3 组分构成的酶,
包括羟化酶 A、蛋白 B和蛋白 C[38] .其中,羟化酶 A
(图 2)含有 3 个亚基,分别为 60. 6 kDa 的 琢 亚基、
45. 0 kDa 的 茁 亚基和 19. 8 kDa 的 酌 亚基,形成
(琢茁酌) 2构型,活性中心为 滋鄄氧桥双铁核结构,是催
化甲烷氧化为甲醇的活性场所[39] .调控蛋白 B 协助
电子转运,若其氨基端的氨基水解,会造成其活性的
改变[40] .蛋白 C是一个 39 kDa 的含有 FAD 和依赖
NADH的[2Fe鄄2S]结构的还原酶,可从 NADH 处接
受电子,再将其转移到羟化酶的双铁核区. sMMO 的
基因簇共 5. 5 kb,按 mmoXYBZDC排列,分别编码羟
化酶 琢亚基(MMOH琢)、羟化酶 茁 亚基(MMOH茁)、
调控蛋白 B(MMOB)、羟化酶 酌 亚基 (MMOH酌)、
MMOD(功能尚不确定)和还原酶 C(MMOR) [6] .
2郾 2摇 铜离子对 MMOs表达的调控作用
在两种形式 MMO 都可表达的甲烷氧化菌中,
sMMO只在铜离子浓度较低(<0. 8 滋mol·L-1)的生
长基质中才被表达[10,41];当铜离子浓度约为 4
滋mol·L-1时,pMMO被表达并伴随形成大量的胞内
膜[8,41] . Gilbert 等[42] 发现, pmoCAB 的转录是从
pmoC上游 300 bp 的 滓70启动子开始的,而 pmoCAB
的表达受到铜离子水平的调控. 目前对铜离子调控
pMMO表达提出的假设是:pmo 操纵子的转录可能
与某一调控蛋白有关,这个调控蛋白可与铜发生结
合,结合后可与其他抑制分子相互作用,进而消除抑
制分子对 pMMO合成的抑制[2] .
向 M. trichosporium OB3b 和 M. capsulatus
(Bath)中加入铜离子会减少 sMMO mRNA 的数
量,该结果在一定程度上验证了研究者们提出的
32214 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 苏摇 瑶等: 甲烷氧化过程中铜的作用研究进展摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 Methylococcus capsulatus (Bath) (a)和 Methylosinus trichosporium OB3b (b)的 pMMO 的 琢、茁、酌 亚基的晶体结构及膜方
向[6]
Fig. 1摇 Crystal structure and membrane orientation of the 琢, 茁, 酌 subunis of pMMO from Methylococcus capsulatus (Bath) (a) and
Methylosinus trichosporium OB3b (b) [6] .
紫色代表 琢亚基,绿色代表 茁亚基,深橄榄色代表 酌亚基 Raspberry, chartreuse and deep olive represented 琢, 茁, 酌 monomers, respectively.
在 sMMO 中存在能与铜结合的阻碍蛋白的可能
性[2,43-44] .目前,虽然还未在 sMMO中鉴定到对铜具
有响应的转录抑制子或活化子[12],但对于铜离子对
sMMO 表达的调控机制的研究仍取得了一定的进
展. M. trichosporium OB3b 中调控 sMMO 表达时起
关键性作用的基因主要包括 rpoN(编码 RNA 聚合
酶 滓N)、mmoR(编码 MmoR,一种转录活化子或结合
增强蛋白)以及 mmoG(编码伴侣蛋白 GroEL 的一个
同系物) [45] .其中,MmoR 可将 mmoX 上游的 滓54激
活,而 MmoG则可对 MmoR 和 sMMO 实现一定的调
节[46],当 mmoR、mmoG或 rpoN 发生变异时,都会阻
碍 sMMO的表达[6] .这些在调控 sMMO 基因表达起
关键作用的基因除了在 M. capsulatus (Bath)中被
发现外,基本未在其他 I 型甲烷氧化菌中有所发
现[46] . Iguchi等[46]在从森林土壤中分离得到的一株
新的 I型甲烷氧化菌 Methylovulum miyakonense中也
图 2摇 sMMO羟化酶的晶体结构[38]
Fig. 2摇 Structure of the hydroxylase of sMMO[38] .
红色代表 琢亚基,蓝色代表 茁 亚基,绿色代表 酌 亚基 The 琢鄄subunits
were shown in red, the 茁鄄subunits in blue and the 酌鄄subunits in green.
发现了 mmoG 的存在,这表明 I 型甲烷氧化菌也可
能存有 mmoR,其 sMMO的表达可能也受 MmoRG的
调控. 此外,在 M. capsulatus Bath 的 sMMO 操纵子
下游,还含有一个由 mmoQ 和 mmoS 传感器构成的
调控系统[47],通常认为 M. capsulatus Bath可通过此
系统感知铜含量的水平进而实现对 sMMO 表达的
调控[6] .目前提出的关于铜离子对 sMMO 表达调控
的假设可归纳为:在铜缺失条件下,mmoR 和 mmoG
被表达,生成的 MmoR通过促进与 滓N相连的复合体
的形成,来强化 sMMO 结构基因的转录;当铜大量
存在时,铜会使 MmoR失活而不能有效形成与 滓N相
连的复合体,从而抑制 sMMO操纵子的转录[48] .
图 3 是目前对于铜离子调控 MMOs表达的一种
图 3 摇 Methylosinus trichosporium OB3b 中铜离子调控 MMOs
表达的一种假设机制的模型[2]
Fig. 3摇 Model for the regulation of the genes encoding pMMO
and sMMO in Methylosinus trichosporium OB3b[2] .
a)高铜离子与生物量比 High copper鄄to鄄biomass ratio; b)低铜离子与
生物量比 Low copper鄄to鄄biomass ratio.
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假设机制的模型[2] .当细胞在较高的铜离子与生物
量之比的条件下时,假设的抑制分子(R)会与假设
的可与铜连结的调控分子(copper鄄binding regulator,
CBR)连接,形成复合物 CBR鄄Cu,该复合物又会与活
化子蛋白(activator protein,A)连接,此时,pMMO 将
不会受到抑制剂 R 的阻碍,而连结了 CBR鄄Cu 的活
化子蛋白 A 不再与编码 sMMO 的结构基因序列连
结,进而实现 pMMO 的表达,而不发生 sMMO 的表
达.当细胞处于低的铜离子与生物量之比时,CBR
就不会与铜连结,此时抑制剂分子 R 就会与 pmo 中
的 滓70启动子连结,实现对 pmo 基因转录的抑制;而
游离的活化子蛋白 A 则可与 mmoX 的上游活性序
列连结,促使 RNA 聚合酶形成开放复合物,实现对
编码 sMMO结构基因的转录. 但甲烷氧化菌是如何
通过传感系统对铜含量水平进行感知的尚不清
楚[6,47] .
摇 摇 除了调控两种 MMOs 的表达外,铜离子还参与
调控甲烷氧化菌其他蛋白的表达[11] .在 M. capsula鄄
tus (Bath)中,至少两种甲醛脱氢酶(FalDH)受铜离
子浓度的调控,其中,DL鄄FalDH(dye鄄linked formalde鄄
hyde dehydrogenase)在有铜离子存在下得以表达,而
NAD(P) + 鄄FalDH[NAD(P) + 鄄linked formaldehyde de鄄
hydrogenase]则在铜离子浓度较低条件下表达[49] .
Kao等[24]在不同铜离子浓度条件下对 M. capsulatus
(Bath)的蛋白表达进行了定量分析,结果显示,在较
高铜离子浓度(30 滋mol·L-1)条件下时,含钨的醛
类铁氧化还原蛋白以及在三羧酸循环中涉及的相关
的蛋白酶,包括乙酰辅酶 A 合成酶 琢 和 茁 链、延胡
索酸酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶以及丙酮酸脱氢
酶,以及一些与细胞壁及细胞胶囊合成相关的蛋白
的表达都得到了增强;而在几乎无铜离子存在时,在
与碳水化合物代谢相关的酶系中仅监测到了 sMMO
(包括 MmoX、MmoY、MmoB、MmoC)和葡萄糖激酶
的表达,后者可能与细胞代谢过程中糖元的合成或
糖异生过程有关. 可能具有铜离子传感功能的
MmoS以及对 sMMO 合成表达起一定调控作用的
MmoG也仅在低铜离子浓度条件下有所表达.此外,
一些细胞的信号蛋白和调控蛋白也在未添加铜的试
验组中得到了高度表达,包括转录调控蛋白 zrzR、感
觉框蛋白、LacZ表达调控子等.此外,一些未知功能
的蛋白的表达同样也受到铜离子的调控,如 CorA和
MopE.其中 CorA 是来自 M. albus BG8 的一种膜结
合蛋白,约 28. 5 kDa[50];MopE 是来自 M. capsulatus
(Bath)的一种与细胞表面相关的蛋白[26,51] . CorA的
表达受铜离子的抑制,去除 CorA将会影响细胞的生
长,但不会因补充加入铜离子而得到恢复. MopE 的
表达也受到铜离子的抑制,该蛋白在 M. capsulatus
(Bath)的铜离子摄取中可能发挥了一定作用,但其
序列中并不含有明显的可与铜结合的功能基因片
段[12] .目前,关于铜对于甲烷氧化菌全基因的调控
模式仍较模糊,有待进一步深入的研究.
2郾 3摇 铜离子对 MMOs活性的影响
生长基质中铜离子浓度除了可调控 MMOs 的
表达外, 在很大程度上也会影响 MMOs 的活
性[8,37,41,52-55] .研究表明,pMMO 只有在铜离子浓度
约为 4 滋mol·L-1时才表现活性并伴随大量细胞质
膜的生成[41],对于只表达 pMMO 的甲烷氧化菌而
言,较低的铜离子含量还会对其生长产生抑制作
用[52] .向培养基中加入多于 pMMO表达所需的铜离
子量时,无细胞提取物中的 pMMO 的数量和活性都
将有所增加[53] .崔俊儒等[54]对甲基弯菌(M. tricho鄄
sporium)IMV3011 分泌产生的 pMMO 进行的相关研
究表明,相比于不添加铜的试验组,高铜离子浓度下
(约 200 滋mol·L-1)培养的细胞中 pMMO数量较多
且活性明显增强. Choi等[8]对 M. capsulatus (Bath)
的研究发现,其 pMMO 的 3 个多肽及 pmoA 转录产
物的浓度随生长基质中铜离子浓度的增加而增加,
当铜离子浓度增加至 60 滋mol·L-1,pMMO 的数量
开始有所减少. Yu等[55]的研究结果表明,加入铜离
子试验组的 pMMO在 5 h内的活性约是采用对数期
细胞测得的 pMMO活性的 2 倍. Collins等[52]在研究
铜离子对 M. albus BG8(不能分泌产生 sMMO)的影
响中也发现,铜离子的加入可将 pMMO 的活性从
3郾 16 ~ 7. 73 nmol·min-1·mg-1(铜离子浓度小于
0郾 06 滋mol·L-1)提高至 41. 5 ~ 49. 8 nmol·min-1·
mg-1(铜离子浓度约 10. 6 ~ 10. 8 滋mol·L-1). Bala鄄
subramanian等[37]也通过试验证实了 pMMO 的活性
取决于铜离子的浓度,但他们的试验结果表明,向
100 kDa的 pMMO原体中加入 2 ~ 3 当量的铜,即可
恢复 90%以上的甲烷氧化活性.但当铜的加入量超
过 3 个当量的时候,反而会对 pMMO 的活性产生可
逆的抑制作用.他们认为多余的铜离子可能并不是
实现 pMMO活性所必需的,而这部分多的铜离子很
可能与还原剂作用,生成对 pMMO 具有可逆抑制作
用的 H2O2 . 目前认为,pMMO 活性表达的最适铜离
子浓度范围为 30 ~ 80 滋mol·L-1[8,10,53],过高或过低
的铜离子浓度都不利于 pMMO活性的表达.
对于 sMMO而言,较低的铜离子浓度有利于其
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活性的表达,而高浓度的铜离子则会对其活性产生
抑制[56-57] . 沈润南等[56]考察了不同铜离子浓度对
甲烷氧化菌 GYJ3 菌株 (归属于 Methylomonas)的
MMOs活性的影响,结果表明,当培养液中不含铜离
子时,细胞中的 MMO全部以 sMMO 的形式存在;当
铜离子浓度增至 1. 5 滋mol·L-1时,sMMO 活性达到
最大,占细胞 MMO总活性的 95% ;而继续增加铜离
子浓度,sMMO 的活性将受到抑制. Morton 等[57]采
用标准的无机盐培养基对 M. trichosporium OB3b 进
行培养,结果显示,当培养基中铜离子与生物量之比
大于 5. 64 滋mol·g-1时,sMMO 就会失去活性.相比
于 pMMO,sMMO可以利用更广泛的底物,除了可氧
化甲烷外,还能对卤代烃类、芳香族类等化合物实现
降解[3] . Lee 等[58]对 M. trichosporium OB3b 的研究
结果表明, 当卤代烃化合物浓度在 10 ~ 100
滋mol·L-1时,表达 sMMO 的细胞(低铜离子浓度条
件)对污染物的降解更占优势;但当卤代烃类化合
物浓度高至 100 滋mol·L-1时,高铜离子浓度条件下
表达 pMMO的细胞不仅生长迅速,且能在相对较短
的时间里降解更多的污染物.
因此,根据环境的受污情况和实际条件,合理调
控体系中铜离子的含量,能有效提高 MMOs 氧化甲
烷或非甲烷类物质的活性,进而增强其在温室气体
减排及受污环境生物修复中的作用.
3摇 甲烷氧化菌的铜捕获及甲烷氧化菌素
3郾 1摇 甲烷氧化菌对铜的捕获
尽管相关研究表明,只有在相对较高的铜离子
浓度条件下才能表达 pMMO[41],但是在自然环境
中,生物可利用铜的含量却非常低,土壤中铜含量大
约在 20 mg·kg-1左右,且大多数与有机质或锰和铁
的氧化物紧密结合[59-60],但是在这较低铜离子浓度
的情况下仍监测到了大量 pMMO 的存在[6] . 此外,
在表达 pMMO 的甲烷氧化菌细胞中铜的含量远高
于其他的好氧细菌[59-60] . 学者们由此猜想,在甲烷
氧化菌中可能存在一个高效的铜摄取系统以满足其
对铜的需要.
早在 20 世纪 90 年代,Fitch 等[61]在 M. trichos鄄
porium OB3b铜代谢缺陷突变株(不具备铜吸收能
力)中发现了特异性的铜捕获现象. 他们的结果表
明,菌株即便在铜存在的介质中也只表达 sMMO,而
不表达 pMMO,且该菌株还可向介质分泌一种可与
铜结合的化合物,但在其细胞内膜系统中检测到的
该化合物的量却比正常野生型菌株少了近 20
倍[61],由此作者提出,在铜缺乏的条件下,菌株可分
泌出一种可与铜结合的小分子化合物. 2004 年,Kim
等[14]成功地从 M. trichosporium OB3b 中纯化得到
了与铜具有较高亲和力的化合物,并得到了其晶体
结构,将这种分子命名为甲烷氧化菌素 ( metha鄄
nobactin,mb ). 此后, Choi 等[62] 从 M. capsulatus
(Bath)的铜限制培养基中也分离纯化得到了这类化
合物. Kim等[14]认为甲烷氧化细菌极有可能采用类
似于其他细菌分泌嗜铁素(siderophore)捕获铁的机
制来捕获铜,提出了在甲烷氧化菌中可能的铜捕获
机制:甲烷氧化菌可能向周围环境中释放甲烷氧化
菌素首先将铜捕捉,然后甲烷氧化菌重新收回这个
铜鄄甲烷氧化菌素复合物,将铜富集在细胞内供 pM鄄
MO表达需要,使得细菌可以氧化甲烷并从中获得
能量.
3郾 2摇 甲烷氧化菌素的结构
目前已在 M. trichosporium OB3b、M. capsulatus
(Bath)、M. album BG8、Methylocystis species strain M
和 Methylocystis strain SB2 中发现了 mb,但来自不同
甲烷氧化菌的 mb间是否存在结构和其他性质的差
异尚不清楚[63] . 目前,对铜载甲烷氧化菌素 ( Cu鄄
mb)的结构、光谱和生理特性的研究主要集中于 M.
trichosporium OB3b的 mb[64] . Cu鄄mb是一个 1217 Da
大小的分子,其经验分子式为 C45N12O14H62S5Cu,由
7 个氨基酸和 1 个包含硫酰咪唑生色团的特殊部分
组成. 2 个可结合铜的 4鄄亚硫酰鄄5鄄羟基咪唑基团,通
过 2 个咪唑 N 和 2 个硫酰 S 与铜络合,其中 2 个
Cu鄄N之间的距离分别为 2. 00 和 2. 05 魡,2 个 Cu鄄S
的距离分别为 2. 38 和 2. 39 魡[14,64] . X鄄射线光电子
能谱(XPS)分析结果显示,在 Cu鄄mb 中,铜原子的
氧化态是 Cu ( I),该结果也由 X 射线吸收光谱
(XAS)和电子顺磁共振(EPR)分析得到了证实[13] .
但是,当向甲烷氧化菌素中加入 Cu( II)后,不足
10 min,就监测不到 Cu(II)的 EPR 光谱信号[62],这
些结果表明,mb 自身可实现将 Cu( II)还原为 Cu
(I) [64] .而光谱和动力学试验数据亦显示,mb 首先
与 Cu( II)结合形成二聚物,然后将其还原为 Cu
(I) [15] .实际上,mb并非是铜专一性的,当环境中不
存在铜时,mb 也可与其他金属螯合,这些金属包括
Fe、Ni、Zn、Au、Ag、Pb、Mn、Cd 和 Co[65] . 但是,若在
此之后继续暴露于含铜的条件,除了 Ag、Au 和 Hg
之外,这些金属元素都将被铜置换[6,15] .采用等温量
热分析发现[66],M. trichosporium OB3b 的 mb 可与
铜连结后形成一个四聚体,初始连接常数为(3. 3伊
6221 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
图 4摇 Methylosinus trichosporium OB3b 的载铜甲烷氧化菌素
结构示意图[63]
Fig. 4 摇 Schematic structure of methanobactin of Methylosinus
trichosporium OB3b[63] .
1034依3. 0伊1011)(铜离子与 mb之比小于 0. 2 时),比
mb与其他金属的连结常数高出了约 17 ~ 19 个数量
级;在铜离子与 mb之比在 0. 2 ~ 0. 45 时,铜被结合
为一种二聚物,此时连结常数降低至(2. 6依0. 46) 伊
108;当铜与甲烷氧化菌素之比为 0. 45 ~ 0. 85 时,连
结常数又降低至(1. 4依0. 2) 伊106,此时,铜被结合为
一种单聚物. 由此可知,随铜离子与 mb 比例的升
高,连接常数从高的初始值逐渐减少,这可能与其在
高铜浓度下的解毒作用有一定的关系.
3郾 3摇 甲烷氧化菌素的功能
除了在甲烷氧化菌对铜的摄取中发挥了重要作
用外,mb对甲烷氧化菌的生长及活性也会产生一定
的影响[6,8,53,62-66] . 当 M. trichosporium OB3b 或 M.
capsulatus ( Bath)细胞在铜离子浓度较低 ( < 0. 7
滋mol·L-1)的培养基中生长时,可在培养液中检测
到累积的 mb;当加入铜后,培养液中 mb 的含量有
所减少,部分 mb 可与培养液中的铜结合,形成 Cu鄄
mb[6] . Balasubramanian 等[63]通过荧光标记法证实
了 M. trichosporium OB3b细胞通过直接吸收 Cu鄄mb
进入细胞质中,作为其摄取铜的主要途径.在生长基
质中加入 1 颐 1 的铜和 mb(使培养液中铜离子浓度
从铜限制条件到铜离子浓度达 10 滋mol·L-1 )后,
M. trichosporium OB3b生长的延滞时间出现了显著
缩短,且细胞生长速度得以提高[64] .
Cu鄄mb 对 pMMO 的 活 性 有 一 定 促 进 作
用[8,53,62,65-67] . 向 表 达 pMMO 的 M. capsulatus
(Bath)细胞或 M. capsulatus (Bath)膜组分中加入
M. trichosporium OB3b 的 Cu鄄mb,其 pMMO 的活性
增强了约 35% ,而单独加入铜离子则只能增加约
20% [62] . Dispirito 等[53]的研究结果表明,当 pMMO
上的 Cu鄄mb分解后,pMMO 的活性将发生不可逆的
损失.但也有研究表明,在一些缺失 Cu鄄mb的 pMMO
准备体中也有活性表现[29] . 目前普遍认为,Cu鄄mb
可能是 pMMO 的辅助因子,在 pMMO 的结构模型
中,1 个羟化酶附加有 5 ~ 8 个 Cu鄄mb[8,62],而在没有
Cu鄄mb结合的情况下,pMMO 所具有的活性仅为有
Cu鄄mb的 2% ~25% [65] .除了对已纯化的 pMMO 活
性有影响外,Cu鄄mb 也表现出与膜系统中未被纯化
的 pMMO 存在相互联系. Choi 等[65]在考察 mb 对
pMMO羟化酶的作用的相关试验中,证实了 mb 可
能对 pMMO羟化酶的稳定或协助电子流向 pMMO
羟化酶发挥了一定作用. 此外,细胞分泌 mb 与其
MMOs的表达调控也存在一定的关系. 在铜离子浓
度低于 0. 7 滋mol·L-1的 M. trichosporium OB3b 细
胞培养基中发现了 mb 的累积;而当铜离子浓度提
高至 0. 7 ~ 1. 0 滋mol·L-1时,Cu鄄mb 会迅速被细胞
内在化,同时伴随对 sMMO 表达的抑制和对表达
pMMO的促进作用[66],但目前对于 mb 内在化的机
制还尚未研究清楚[8,53,62],而 Cu鄄mb 是否与某些活
化子蛋白相连结而导致不同类型 MMOs 的表达仍
有待进一步确定.
此外,相关研究也表明 mb 在自然环境中对于
MMOs的表达也存在一定的调控作用[68-69] . Knapp
等[68]选用氯化铜、氧化铁铜和铜硼硅玻璃作为环境
系统模拟物,研究 mb 的加入对其中 MMOs 表达的
影响,结果发现,当铜以可溶性的氯化铜形式存在
时,无论是否加入 mb,都表现为 pmoA数量的增加和
mmoX数量的减少;但对于氧化铁铜和铜硼硅玻璃,
只有加入 mb后才可发现 pmoA数量的增加和 mmoX
数量的减少.据此推测,自然环境中 MMO 的表达可
能主要受固相铜的地球化学性质的影响及与之相关
的 mb的调控.此后,他们还收集了热带地区高度风
化土壤和淋溶土壤以及一种硅酸盐矿石,研究 mb
的加入对这些自然环境土样中铜的释放的影响,结
果表明,mb的加入明显促进了这些矿物质中铜的释
放,促进了 Cu鄄mb 的形成及进入甲烷氧化菌细胞,
进而保障了甲烷氧化菌在生长代谢过程中对铜离子
的需求[69] .
以上结果均表明,mb 在甲烷氧化菌对铜的捕
获,尤其是在自然环境中对铜的捕获过程,以及对其
氧化甲烷的活性确实发挥了重要的作用. 但是,mb
除可与铜特异性结合外,还能与其他金属相结合,因
此,在自然条件下,mb 与不同金属结合的关系究竟
如何还有待探究. 此外,在自然环境中,还存在其他
可与铜发生结合的化合物,mb与这些化合物之间是
否存在对铜的竞争关系,也需要进一步的研究,这些
72214 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 苏摇 瑶等: 甲烷氧化过程中铜的作用研究进展摇 摇 摇 摇 摇
结果对于把握 mb在自然环境中对甲烷生物氧化的
调控作用具有很大的价值和意义.
4摇 展摇 摇 望
铜离子在甲烷生物氧化过程及 MMOs 参与的
烷、烯、芳香族化合物的氧化代谢中都扮演了重要的
角色.尽管大量的研究已表明,铜既是合成 pMMO
的必需金属元素,又是调控 sMMO 或 pMMO 表达的
开关元件,但其对 MMOs 表达的调控机制仍未研究
透彻,因此,铜对甲烷氧化菌氧化甲烷及代谢其他非
甲烷有机化合物的活性的影响也难确定.目前,虽然
已在几株甲烷氧化菌中发现了 mb,但不同甲烷氧化
菌的 mb之间是否存在结构和其他特征的差异还需
进一步探讨.此外,在自然环境中,mb与其他铜结合
化合物之间是否存在竞争关系,其他金属的存在是
否对 mb释放铜产生影响等也都有待进一步研究.
环境中铜含量及形态的差异对甲烷氧化菌生态分布
及其活性的影响也需要更多的原位试验进行探讨.
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作者简介摇 苏摇 瑶,女,1989 年生,博士研究生.主要从事城
市生活垃圾填埋场二次污染的生物控制技术研究. E鄄mail:
11114032@ zju. edu. cn
责任编辑摇 肖摇 红
0321 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷