全 文 ：＊收稿日期:2007-12-28
作者简介:王爱业 ,硕士研究生, 从事环境生物技术研究;张清敏
(通讯作者),教授 ,从事环境生物技术研究, bio-zhang
@nankai.edu.cn。
基金 项 目:国家 重 点 基础 研 究 发展 规 划 (973)项 目
(2002BC412301);天-南大合作基金项目(AJ0013)
文章编号:1009-6094(2008)04-0012-04
亚硝态氮对铜绿微囊藻和
四尾栅藻生长的影响＊
王爱业 , 吉雪莹 , 陈卫民 , 张清敏 , 戴树桂 , 庄源益
(南开大学环境科学与工程学院 ,天津 300071)
摘 要:采用室内培养法 ,将铜绿微囊藻和四尾栅藻分别置于 5种含
不同质量浓度亚硝态氮(NO-2-N)(0.5 mg/ L、1.0 mg/ L、2.0 mg/ L、4.0
mg/ L和 8.0 mg/ L)的培养液中 , 培养 10 d ,测定不同质量浓度NO-2-N
对铜绿微囊藻和四尾栅藻生长的影响。结果表明 , 0.5～ 8.0 mg/ L的
NO-2-N 可激活铜绿微囊藻的亚硝酸氧化酶和亚硝酸还原酶 ,进而促
进铜绿微囊藻的生长。四尾栅藻因仅具有亚硝酸还原酶,因此只能利
用 0.5～ 2.0 mg/ L的 NO-2-N ,其利用能力远没有铜绿微囊藻强。培养
8 d后 ,铜绿微囊藻培养液中NH+4-N 和NO-2-N 的质量浓度明显升高 ,
而 NO-3-N质量浓度的变化不大;四尾栅藻培养液中 NH+4-N 、NO-2-N
和 NO-3-N质量浓度的变化不大。研究表明 ,低于 8.0mg/ L的 NO-2-N
可促进铜绿微囊藻的生长 ,高于 2.0 mg/ L的NO -2-N抑制四尾栅藻的
生长。
关键词:环境生态学;亚硝态氮;亚硝酸还原酶;亚硝酸氧化酶;铜
绿微囊藻(Microcystis aeruginosa Kǜ tz);四尾栅藻(Scenedesmus
quadricauda Breb)
中图分类号:X524 文献标识码:A
0 引 言
目前 ,水体富营养化是世界各国都面临的水污染问题之
一[ 1 , 2] 。随着水体富营养化的日益严重 , 水华暴发已成为许
多湖泊和其他水体面临的挑战[ 3 , 4] 。 近年来 , 太湖 、巢湖和滇
池相继发生了大面积蓝藻暴发 , 这不仅使水体失去景观生态
价值 ,同时也会直接危及周边地区的饮用水安全 , 造成巨大经
济损失。氮浓度是影响藻类生长的重要因素 ,尤其是水溶性
铵态氮(NH+4-N)、亚硝态氮(NO-2-N)和硝态氮(NO-3-N)的变
化会直接影响藻类生长[ 5-7] 。多数藻类可直接利用环境中的
NH+4-N , 而对NO-3-N的利用是先通过一系列酶将 NO-3-N还
原成NO-2-N ,再还原为 NH+4-N[ 8] 。大多数藻类一般不能直接
利用NO-2-N ,并且一定浓度的 NO-2-N会诱发其 DNA 损伤[ 9] 。
铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是夏季湖泊水华的优
势藻之一 , 也是一种具有代表性的蓝藻[ 10-12] ;四尾栅藻
(Scenedesmus quadricauda)则是常见的绿藻优势种之一[ 10 , 11] 。
对太湖(无锡)水-沉积物交界层微生态系统的研究发现 , 春
末夏初时富营养化湖泊水域的水-沉积物交界层的NO-2-N浓
度较高 ,此时铜绿微囊藻也处于该交界层 , 这表明铜绿微囊藻
等水华藻必须有特殊的酶才能适应含较高浓度 NO-2-N 的水
环境。对湖泊蓝藻暴发的研究大多集中在总氮和总磷超标的
问题 , 而未注意不同形态的氮 、磷对蓝藻暴发的不同影响。水
溶态“三氮“(NH+4-N、NO-2-N 和 NO-3-N)中的 NO-2-N是硝化
-反硝化的中间产物 , 也是反映水-沉积物交界层生态系统
状态的关键成分。
本文研究不同浓度 NO-2-N对铜绿微囊藻和四尾栅藻生
长的影响 , 这对湖泊水华形成的机理研究以及及时采取相应
措施减少水华灾害都具有重要的生态学和环境科学意义。
1 材料与方法
1.1 仪 器
TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂);UV755B
紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);BX51T
型显微镜(日本奥林巴斯株式会社);血球计数板(上海精密
仪器仪表有限公司);LRH -800-GS 型人工气候箱(广东省
医疗器械厂);LDZX-40BZ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器
(上海申安医疗器械厂)。
1.2 藻种和培养基
铜绿微囊藻和四尾栅藻均购于中科院武汉水生生物研究
所。 A5溶液的制备:将 0.286 g 硼酸 、0.181 g 氯化锰 、0.022 g
硫酸锌 、0.002 g三氧化钼 、0.008 g硫酸铜和 0.001 g 氯化钴溶
于 100 mL去离子水。 BG11基础培养基的制备:将 1.500 g 硝
酸钠 、0.403 g 磷酸氢二钾 、0.074 g 硫酸镁 、0.037 g 氯化钙 、
0.006 g 柠檬酸 、0.157 g 柠檬酸铁铵和 0.011 g 乙二胺四乙酸
二钠溶于 1 L去离子水 , 加入 10 mL A5 溶液后用质量分数为
25%的 NaOH 溶液将其 pH值调节至 8.0。
向培养基中加入NaNO2 作为藻体培养液 ,使其NO-2-N最
终质量浓度分别为 0.5 mg/ L、1.0 mg/L、2.0 mg/ L、4.0 mg/ L和
8.0 mg/ L, 每个质量浓度设 3 个平行。实际藻培养液体积为
150 mL、藻体接种量为 7%, 同时设 3 个不接藻的培养液作为
对照。采用人工气候箱培养 , 使温度为(24±2)℃、光照强度
为(2 200±0.1)lx、光周期为 14 h∶10 h。每天定时振摇 1次 ,
培养周期为 10 d。
1.3 藻体细胞密度的测定
分光光度法[ 13] 。将藻液摇匀 , 以蒸馏水为参比(用培养
液作参比时获得的藻液吸光度与用蒸馏水作参比得到的数值
几乎相同),用分光光度计在最大吸收波长 680 nm 下测定藻
液吸光度(X);每 2 d测定 1 次。
试验进行前先做预试验 , 即每隔 1 d 用血球计数板显微
计数法测量藻细胞数量[ 14] , 并同时在680 nm 波长下测定藻液
的吸光度。通过预试验得到藻体密度 Y(104/ L)与藻液在 680
nm 波长下的吸光度 X 的关系。
对铜绿微囊藻
Y=4046.2X+6.7393 (1)
对四尾栅藻
Y=301.63X+11.263 (2)
1.4 亚硝酸还原酶和亚硝酸氧化酶活性的测定
将 15 mL藻液放入离心管中 ,离心(5 000 r/ min , 室温)10
min 后 ,弃去上清液;分别向离心管中加入 5 mL PBS 缓冲液
(pH=8.0 , 0.8 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na2HPO4·7H2O , 0.2 g
KH2PO4和 1 000 mL蒸馏水),洗涤 2～ 3 次;向洗涤后的藻体
中加入纤维素酶溶液 100 μL(10 mg/mL, pH=7.2)及蜗牛酶溶
液 100 μL(10 mg/mL , pH=7.2),在 37 ℃下反应 1 h 后再加入
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第 8卷第 4 期
2008年 8 月
安 全 与 环 境 学 报
Journal of Safety and Environment
Vol.8 No.4 Aug , 2008
300 μL 浓硫酸(ρ=1.84 g/mL)以终止反应。离心(5 000
r/min , 室温)10 min , 取上清液(约 500 μL)并用双蒸水稀释至
10 mL;加入质量分数为 10%的 ZnSO4 0.15 mL 后用 25%的
NaOH溶液将其 pH 值调节至 8.0 ～ 10.0。絮凝 30 min 后离心
(5 000 r/min , 室温)10 min , 取上清液在室温下分别测定藻体
内亚硝酸还原酶活性和亚硝酸氧化酶活性。
采用纳氏试剂分光光度法测定亚硝酸还原酶活性[ 15] , 以
培养 48 h 藻体内氨氮(NH+4-N)的含量(mg/ L)表示。
采用紫外分光光度法测定亚硝酸氧化酶活性[ 15] , 以培养
48 h藻体内硝酸盐氮(NO-3-N)的含量(mg/L)表示。
1.5 培养液中亚硝酸盐氮 、硝酸盐氮和氨氮的测定
样品的预处理。将 15 mL 藻液离心(5 000 r/min , 室温)10
min后取上清液 , 加入 10%的 ZnSO4 0.15 mL 后用 25%的
NaOH溶液调节其 pH 值至 8.5。絮凝沉淀后 , 离心(5 000
r/min , 室温), 取上清液在室温下测定亚硝酸盐氮(NO-2 -N)、
NO-3-N和 NH+4-N。其中 , NO -2-N采用 N-(1-萘基)-乙二
胺分光光度法测定;NO-3 -N 采用紫外分光光度法测定;
NH+4-N采用纳氏试剂分光光度法测定[ 15] 。
2 结果与讨论
2.1 NO-2-N浓度对铜绿微囊藻和四尾栅藻生长的影响
NO-2-N对铜绿微囊藻和四尾栅藻生长的影响见图 1 和
2。不同质量浓度 NO-2-N(0.5 ～ 8.0 mg/L)作用下 , 铜绿微囊
藻均在第 6 d都进入对数增长期(图 1),可见 , NO-2-N 是促进
铜绿微囊藻生长的重要生态因子。
当NO-2-N 质量浓度为 0.5 mg/ L、1.0 mg/ L和 2.0 mg/L
时 ,四尾栅藻在第 4 d 开始进入对数增长期 , 这表明低浓度
NO-2-N对四尾栅藻的生长有一定促进作用;而当 NO-2-N质
量浓度为4.0 mg/ L和8.0 mg/L时 , 在第10 d 仍未能出现明显
的对数增长期。 这表明随着 NO-2-N 质量浓度的增加(大于
2.0 mg/ L), NO-2-N对四尾栅藻的生长有抑制作用。
2.2 不同浓度 NO-2-N 对藻体内亚硝酸还原酶活性的影响
由图 3可以看出 , 不同质量浓度 NO-2-N 对铜绿微囊藻亚
硝酸还原酶活性的影响呈先激活后抑制的趋势。质量浓度为
2.0 mg/ L和 4.0 mg/ L的NO-2-N对铜绿微囊藻亚硝酸还原酶
活性的影响最明显 ,培养前 2 ～ 6 d的酶活性逐渐增强;6 d后
酶活性开始减弱 , 但到第 10 d 仍能保持一定活性。 但是 , 质
量浓度为 0.5 mg/L、1.0 mg/ L和 8.0 mg/ L时 , NO-2-N 对铜绿
微囊藻亚硝酸还原酶活性的影响不明显 , 酶活性随着 NO-2-N
质量浓度的增大而增强 , 但是酶活性的波动范围不大。这表
明 2.0～ 4.0 mg/ L的 NO-2-N适宜铜绿微囊藻进行反硝化 , 并
能促进铜绿微囊藻利用 NO-3-N 进行生长代谢。
由图 4 可以看出 , 培养前 6 d 四尾栅藻体内亚硝酸还原
酶活性在不同质量浓度 NO-2-N 影响下逐渐增强;6 d 后迅速
下降 ,而第 8 d 时已检测不到亚硝酸还原酶的活性。这表明
四尾栅藻在 NO-2 -N 影响下能激活亚硝酸还原酶并促进
NO-3-N的转化利用 ,但很快亚硝酸还原酶会受到 NH+4-N的抑
制而失活。可见 , 四尾栅藻只能在低质量浓度 NO-2-N(0.5～
2.0 mg/ L)环境中生长 , 当NO-2-N质量浓度大于 2.0 mg/ L时 ,
其体内亚硝酸还原酶的活性会受到抑制。
图 1 不同质量浓度NO-2-N对铜绿微囊藻生长的影响
Fig.1 Effects of the different mass concentrations of NO-2-N on the
growth of Microcystis aeruginosa
图 2 不同质量浓度NO -2-N对四尾栅藻生长的影响
Fig.2 Effects of the different mass concentrations of NO-2-N on the
growth of Scenedesmus quadricauda
图 3 不同质量浓度 NO-2-N对铜绿微囊藻亚硝酸还原酶活性的影响
Fig.3 Effects of the different mass concentrations of NO-2-N on the
activities of the nitrite reductase of Microcystis aeruginosa
图 4 不同质量浓度 NO-2-N对四尾栅藻亚硝酸还原酶活性的影响
Fig.4 Effects of the different mass concentrations of NO-2-N on the activities
of the nitrite reductase of Scenedesmus quadricauda
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2008 年 8月 王爱业 ,等:亚硝态氮对铜绿微囊藻和四尾栅藻生长的影响 Aug , 2008
图 5 不同质量浓度 NO-2-N对铜绿微囊藻亚硝酸氧化酶活性的影响
Fig.5 Effects of the different mass concentrations of NO-2-N on the
activities of the nitrite oxidase of Microcystis aeruginosa
图 6 铜绿微囊藻培养液中NO-2-N 质量浓度的变化
Fig.6 Variations of NO-2-N mass concentration in the culture
medium of Microcystis aeruginosa
图 7 铜绿微囊藻培养液中NH+4-N 质量浓度的变化
Fig.7 Variations of NH+4-N mass concentration in the culture medium
of Microcystis aeruginosa
2.3 不同浓度 NO-2-N 对铜绿微囊藻体内亚硝酸氧化酶活
性的影响
不同质量浓度 NO-2-N 下 ,铜绿微囊藻亚硝酸氧化酶在培
养前 8 d逐渐被激活 ,而第 8 d后又受到抑制(图 5)。 这主要
是由于培养液中NH+4-N质量浓度的升高。 当培养液中
NH+4-N质量浓度超过 0.1 mg/ L时 , NH+4 -N 首先作为氮源被
利用 ,从而抑制了亚硝酸氧化酶的活性。
2.4 培养液中水溶性“三氮”浓度的变化
培养液中水溶性“三氮”(NH+4-N、NO-2-N 和 NO-3-N)质
量浓度的变化见图 6和 7。藻体内亚硝酸还原酶和亚硝酸氧
化酶的作用必然引起培养液中“三氮”质量浓度的变化。培养
8 d 后 ,铜绿微囊藻培养液中NH+4-N 和NO-2-N的质量浓度明
显升高 ,而 NO-3-N质量浓度的变化不大。这主要是因为藻体
内发生了产铵异化硝酸盐还原(DNRA , Dissimilatory Nitrate Re-
duction to Ammonia), 使NO-3-N异化还原为NH+4-N 或NO-2-N ,
同时由于亚硝酸还原酶的作用 , NO-2-N转化为 NH+4-N[ 16] 。
四尾栅藻仅具有亚硝酸还原酶 , 试验测定结果表明其培
养液中“三氮”质量浓度的变化不大。
3 结 论
NO-2-N 是藻体生长代谢过程中进行 NH+4 -N 氧化和
NO-3-N还原的中间产物 , 因此 , 生态环境中 NO-2-N的浓度会
直接影响藻类的生长代谢。铜绿微囊藻不仅具有促进NO-2-N
转化为NO-3-N的亚硝酸氧化酶 , 也具有促进 NO-2-N 转化为
NH
+
4-N的亚硝酸还原酶。NO-2-N质量浓度为 0.5 ～ 8.0 mg/L
时能促进铜绿微囊藻的生长 , 最适宜铜绿微囊藻生长的
NO-2-N质量浓度为 2.0～ 4.0 mg/ L。春末夏初时气温较低 ,富
营养化水体的水-沉积物交界层中较高浓度的 NO-2-N 使其
他藻类难以快速增长 ,这可能是铜绿微囊藻在春末夏初形成
优势藻群的重要条件。
四尾栅藻仅具有亚硝酸还原酶 , 只能在含低质量浓度
NO-2-N(0.5 ～ 2.0 mg/ L)的环境中生长;当 NO-2-N质量浓度
大于 2.0 mg/ L时 , 其生长受到抑制。 因此 , 四尾栅藻只能在
气温升高 、水-沉积物交界层中 NO-2-N浓度降低后才能形成
优势藻群。
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The effect of the nitrite nitrogen on the growth
of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus
quadricauda
WANG Ai-ye , JI Xue-ying , CHEN Wei-min , ZHANG Qing-min ,
DAI Shu-gui , ZHUANG Yuan-yi
(College of Environmental Science and Engineering , Nankai Univer-
sity , Tianjin 300071 , China)
Abstract:The present paper is concerned about our experimental re-
sults of the effect of the nitrite nitrogen on the growth of Microcystis
aeruginosa Kǜtz and Scenedesmus quadricauda Breb.As can be
seen , in our research experiments , Microcystis aeruginosa and
Scenedesmus quadricauda were let to be exposed to the environment at
five different mass concentrations of the nitrite nitrogen(that is , 0.5
mg/L , 1.0 mg/L , 2.0 mg/ L , 4.0 mg/ L and 8.0 mg/L)to study
the effect of the different mass concentrations of the nitrite nitrogen on
the growth of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus quadricauda.
The results of our experiments have shown that the nitrite reductase
and the nitrite oxidase of Microcystis aeruginosa could be activated in
the environmental mass concentration of the nitrite nitrogen (0.5-
8.0 mg/ L) so that it can help the nitrite nitrogen lower than 8.0
mg/ L to grow.However , Scenedesmus quadricauda only had the ni-
trite reductase and was able to use the nitrite nitrogen of 0.5-2.0
mg/ L for its activation , so that the nitrite nitrogen could be used far
less than that of Microcystis aeruginos.Thus , it can be seen that ,
except that the nitrite nitrogen and ammonia nitrogen in the culture
medium of Microcystis aeruginosa may turn to be noticeably higher af-
ter the eighth day , no remarkable change would happen to the nitrate
nitrogen, neither the ammonia nitrogen , nitrite nitrogen and nitrate
nitrogen in the culture medium of Scenedesmus quadricauda.
Key words:environmental ecology;nitrite nitrogen;nitrite reduc-
tase;nitrite oxidase;Microcystis aeruginosa Kǜtz;
Scenedesmus quadricauda Breb
CLC number:X524 Document code:A
Article ID:1009-6094(2008)04-0012-04
＊收稿日期:2007-11-10
作者简介:杨晓为 ,博士研究生 ,从事农药残留与环境修复研究;
杨晓云(通讯作者), 副教授 , 博士 ,从事农药残留与环
境毒理研究 , yxyhyxy@scau.edu.cn。
基金项目:国家自然科学基金项目(20377015)
文章编号:1009-6094(2008)04-0015-04
鱼藤酮在不同类型土壤中的降解＊
杨晓为1 , 王 芳2 , 杨晓云2 , 王立世3 , 党 志1
(1 华南理工大学环境科学与工程学院 ,广州 510640;
2 华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室 ,
广州 510642;3 华南理工大学化学科学学院 ,广州 510640)
摘 要:利用高效液相色谱法(HPLC)研究鱼藤酮在不同类型土壤
(稻田土 、菜田土和果园土)中的降解 ,并探讨土壤微生物 、土壤含水
量 、紫外光照和土壤理化性质等因子对鱼藤酮降解的影响。结果表
明 ,鱼藤酮在不同类型土壤中的降解符合一级动力学方程。避光条件
下 ,鱼藤酮在稻田土(pH=5.5)、菜田土(pH =5.64)和果园土(pH =
4.78)中的降解速率常数分别为 0.164 5 、0.147 8和 0.120 3;鱼藤酮在
灭菌菜田土中的半衰期为 10.51 d ,而在未灭菌菜田土中的降解半衰
期为 4.76 d。避光条件下 , 鱼藤酮在烘干的土壤中稳定 , 其半衰期为
15.16 d;土壤含水量为田间饱和含水量的 60%时 ,鱼藤酮半衰期为
4.03 d;厌氧条件下 ,鱼藤酮半衰期为 3.51 d。紫外光照也是加速鱼
藤酮降解的重要因素 ,未接受紫外照射的土壤中的鱼藤酮半衰期为
67.28 h ,接受照射时仅为 10.51 h。研究表明 ,鱼藤酮在土壤中的降解
受微生物 、紫外光照及土壤含水量的影响较大;土壤 pH 值越小 ,鱼藤
酮滞留时间越长;此外 ,土壤理化性质也是影响鱼藤酮在土壤中滞留
性的重要因子。本研究为正确评估鱼藤酮的环境安全性提供了依据。
关键词:环境化学;鱼藤酮;土壤;降解
中图分类号:X131.3 文献标识码:A
0 引 言
鱼藤酮是从鱼藤属植物中提取 、分离出的植物性杀虫剂 ,
是 3 大植物性杀虫剂(鱼藤酮 、除虫菊和烟草)之一[ 1] 。鱼藤
酮大量存在于自然界中 , 且因其毒性小 、残留时间短等特点 ,
自 20 世纪 40年代后一直广泛用于农作物杀虫 、杀螨和鱼塘
清理 , 被视为最安全有效的杀虫剂和杀螨剂[ 2] 。目前 , 鱼藤酮
因大量使用所造成的环境污染和危害已日益受到关注。鱼藤
酮的脂溶性很强 , 对血脑屏障有较好的穿透能力 , 进入中枢后
能够与神经细胞很快结合 , 并选择性地抑制线粒体电子传递
链中 NADH 脱氢酶的活性[ 3] 。Mangum 等[ 4] 研究表明 , 鱼藤酮
对河流中的大型无脊椎生物群有明显影响 , 某些种类还会因
鱼藤酮而无法存活。 Betarbet 等[ 5]连续几周对大鼠进行大剂
量鱼藤酮静脉灌注发现 ,这些老鼠和患有帕金森病的病人一
样 , 逐渐失去了用于传递多巴胺(DA)的神经细胞并伴有震颤
和细胞蛋白沉淀 , 这表明鱼藤酮可能是导致帕金森综合征的
罪恶魁首 , 该研究成果受到了广泛关注[ 6 ,7] 。一些研究表明 ,
小剂量鱼藤酮的持续暴露会使大鼠血浆和脑组织中的 NO 含
量明显升高 、NOS 活性显著增强 , 从而损伤中枢 DA 神经功
能[ 8] 。可见 , 曾普遍认为无公害 、低毒的植物性农药鱼藤酮的
环境行为及环境危害性应受到重视 , 但目前国内外有关鱼藤
酮在环境中行为动态的研究还未见报道。
15
第 8卷第 4 期
2008年 8 月
安 全 与 环 境 学 报
Journal of Safety and Environment
Vol.8 No.4 Aug , 2008