全 文 ：地表球囊霉诱发番茄抗早疫病的机理*
宋圆圆1,2摇 王瑞龙1,2摇 魏晓晨1,2摇 卢永键1,2摇 唐朝阳1,2摇 吴国昭1,2摇 苏贻娟1,2摇 曾任森1,2**
( 1农业部生态农业重点开放实验室, 广州 510642; 2华南农业大学热带亚热带生态研究所, 广州 510642)
摘摇 要摇 丛枝菌根可以改善植物营养状况,提高宿主植物的抗病性.本文研究了番茄幼苗预
先接种丛枝菌根真菌(AMF)地表球囊霉后对番茄植株保护酶活性和防御反应基因表达,以及
对番茄早疫病抗性的影响.结果表明:被 AMF侵染的番茄植株在接种早疫病病原菌茄链格孢
菌后,其叶片内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性迅速提高.其中 SOD 酶活
性在接种后 18 h达到最高,比只接种地表球囊霉(G)、茄链格孢菌(A)以及未接种 AMF和病
原菌的对照(CK)分别高 28郾 6% 、79郾 2%和 82郾 8% ;POD酶活性在接种后 65 h达到最高,分别
比 G、A处理和 CK高 762% 、18郾 3%和 1710% . 经荧光定量 PCR 检测表明,AMF 侵染后的番
茄植株再接种病原菌,其叶片中 PR1(病程相关蛋白基因)、PR2(茁鄄1,3鄄葡聚糖酶基因)和 PR3
(几丁质酶基因)基因的最高转录水平达到 CK 的 9郾 67、8郾 54 和 13郾 4 倍.与 CK 相比,先接种
地表球囊霉再接种茄链格孢菌的番茄植株(GA)的早疫病发病率和病情指数分别降低了
36郾 3%和 61郾 4% .预先接种 AMF的番茄植株在遇到病原菌袭击时诱导的防御反应强而迅速,
诱发(priming)可能是菌根真菌提高宿主植物抗病性的重要机制.
关键词摇 丛枝菌根真菌摇 番茄摇 诱发摇 早疫病摇 抗病性
*国家自然科学基金项目(30670331,31070388)资助.
**通讯作者. E鄄mail: rszeng@ scau. edu. cn
2011鄄02鄄11 收稿,2011鄄06鄄07 接受.
文章编号摇 1001-9332(2011)09-2316-09摇 中图分类号摇 Q945. 8摇 文献标识码摇 A
Mechanism of tomato plants enhanced disease resistance against early blight primed by ar鄄
buscular mycorrhizal fungus Glomus versiforme. SONG Yuan鄄yuan1,2, WANG Rui鄄long1,2,
WEI Xiao鄄chen1,2, LU Yong鄄jian1,2, TANG Zhao鄄yang1,2, WU Guo鄄zhao1,2, SU Yi鄄juan1,2, ZENG
Ren鄄sen1,2 ( 1Key Laboratory of Ecological Agriculture, Ministry of Agriculture Guangzhou 510642,
China; 2 Institute of Tropical & Subtropical Ecology, South China Agricultural University, Guangzhou
510642, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(9): 2316-2324.
Abstract: Arbuscular mycorrhiza (AM) can not only improve host plants nutrient absorption, but
also enhance their disease resistance. Taking the tomato (Lycopersicon esculentum) seedlings pre鄄
inoculated with arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) Glomus versiforme as test materials, this pa鄄
per studied their protective enzyme activities and defense鄄related genes expression, and their resist鄄
ance against a fungal pathogen Alternaria solani Sorauer which causes early blight. The seedlings
pre鄄inoculated with AMF and later inoculated with A. solani showed significantly higher activities of
superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in leaves. The leaf SOD activity of the dually
inoculated plants reached the maximum 18 h after pathogen inoculation, being 28郾 6% , 79郾 2% ,
and 82郾 8% higher than that of the plants with G. versiforme inoculation alone, pathogen inoculation
alone, and non鄄inoculation, and the leaf POD activity reached the maximum 65 h after pathogen in鄄
oculation, being 762% , 18郾 3% , and 1710% higher, respectively. Real time RT鄄PCR analysis
showed that dual inoculation with G. versiforme and A. solani strongly induced the expression of
three defense鄄related genes. The transcript levels of pathogen鄄related protein (PR1), basic type 茁鄄
1,3鄄glucanase (PR鄄2), and chitinase (PR鄄3) in leaves were 9郾 67鄄, 8郾 54鄄, and 13郾 4鄄fold higher,
as compared with the non鄄inoculation control, respectively. Bioassay showed that the disease inci鄄
dence and disease index of the seedlings pre鄄inoculated with G. versiforme were reduced by 36郾 3%
and 61郾 4% , respectively, as compared with the non鄄mycorrhizal control plants. These findings in鄄
dicated that mycorrhizal colonization could induce stronger and quicker defense responses of host to鄄
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 9 月摇 第 22 卷摇 第 9 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Sep. 2011,22(9): 2316-2324
mato plants, and priming could be an important mechanism of the enhanced disease resistance of
mycorrhizal tomato plants.
Key words: arbuscular mycorrhizal fungus; tomato; priming; early blight; disease resistance.
摇 摇 菌根(mycorrhiza)是土壤中的菌根真菌菌丝与
高等植物营养根系互惠共生形成的一种联合体,在
自然界中分布广泛.目前发现陆地上 80%以上的绿
色植物都形成菌根[1],其中丛枝菌根真菌(arbuscu鄄
lar mycorrhizal fungi,AMF)分布最为广泛,与农业生
产关系也最为密切[2-3] . 菌根既能促进宿主植物对
P、N、K、Cu、Zn等营养元素的吸收[3],又能提高作物
对不良环境(干旱、冷、热、盐、碱、重金属等)的抗
性,还可以直接或间接地影响植物群落的发生、发展
以及生态系统的结构和功能[4] .
自 Safir[5]首次发现 AMF 摩西球囊霉(Glomus
mosseae)能减少洋葱红根腐菌 (Pyrenochaeta teres鄄
tris)对洋葱根系的侵染并能减轻根系红腐病的危害
以来,许多研究证明了 AMF 可以增强植物抗病、耐
病能力,特别是对植物抵抗土传病害发挥重要作
用[6] . Cordier 等[7]通过分根试验证实,摩西球囊霉
可使番茄对寄生疫霉(Phytophthora parasitica) 产生
抗性(包括局部抗性和系统抗性);于汉寿等[8]研究
表明,无论是在盆栽试验人工接种条件下还是田间
自然发病条件下,接种摩西球囊霉对西瓜枯萎病的
相对防效均达 50%以上. 黄京华等[9]研究也发现,
接种摩西球囊霉能明显减轻玉米纹枯病的发病率.
刘润进[10]研究发现,摩西球囊霉和地表球囊霉(G.
versiforme)能减轻棉花黄萎病菌(Verticillium dahli鄄
ae)的危害.李海燕等[11]报道 AMF在大豆胞囊线虫
病害发病初期就体现出明显的抑制作用.
与组成性防御相比,植物的诱导防御( induced
defense)可以在没有病虫袭击的情况下减少防御成
本.然而,植物在遇到病虫袭击要产生有效的诱导防
御需要一段时间,在这段时间里植物可能受到严重
为害.近 10 年来,科学家们对植物的防御诱发(plant
defense priming,PDP)现象予以高度重视[12-13] .英文
中的 “ prime冶作为动词是 “make ready (预先准备
好)冶的意思. 当植物被坏死性病原菌感染、有益微
生物侵染或某些化学物质处理后,会诱发其产生一
种特殊的“准备战斗的冶生理状态,即植物的“诱发
(primed)冶状态[14] . 处于诱发状态的植物本身没有
或者只有微弱的防御反应.然而,处于诱发状态的植
物在受到病虫害袭击时就能产生更迅速、更强烈的
防御反应,提高自身抗性[15-16] .在植物与病原菌、植
物与草食动物的相互作用中,诱发防御已经成为植
物诱导抗性的一个研究热点[15-16] .一些植物在受菌
根真菌侵染后并没有诱导植物产生系统抗性,可能
是已经菌根化的植物一旦遇到病原菌入侵或虫害取
食即刻产生强烈的防御反应. 诱发是不是菌根真菌
诱导宿主植物产生抗病性的重要机制值得深入研
究[17] .
番茄(Lycopersicon esculentum)是一种重要的蔬
菜作物,被列为全世界产量最高的 30 种农作物之
一.番茄的基因组较小、生育期较短,经典遗传学及
基因组学的研究基础好,历来是研究植物与病原微
生物及昆虫相互作用的经典模式植物. 番茄早疫病
是由半知菌亚门链格孢属茄链格孢菌(Alternaria so鄄
lani)引起的一种真菌病害,在我国大部分地区普遍
发生,危害日趋严重,是露地、保护地番茄生产中的
重要病害.该病可以引起落叶、落花、落果和断枝,严
重时可使产量损失 50%以上[18],并导致番茄果实
内含有毒素,使人体患血液病,影响人体健康.因此,
番茄早疫病对生产和人类健康具有不可低估的
影响.
本文通过预先给番茄植株接种丛枝菌根真菌地
表球囊霉,待菌根侵染后用早疫病病原菌茄链格孢
菌侵染番茄叶片,研究菌根诱导的植物防御反应和
抗病性变化,从而从分子水平揭示丛枝菌根真菌诱
发番茄抗早疫病的机理.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
供试番茄品种为金宝,购于广东省农业科学院.
AM菌种为地表球囊霉(Glomus versiforme),由山东
省青岛农业大学菌根生物技术中心刘润进教授提
供.病原菌茄链格孢菌[Alternaria solani (Ellis et G.
Martin) Sorauer ]由华南农业大学真菌研究室周而
勋教授提供.
培养基质为土壤和河砂的混合物(3 颐 1),土壤
取自广州华南农业大学校内农场,过 5 mm 筛,高压
蒸汽湿热灭菌 2 h,以消除土壤中的真菌孢子.河砂
过 2 mm筛,洗净,干热 170 益 ~180 益灭菌 2 h.
1郾 2摇 试验设计
盆栽试验在光照温室中进行.试验设4个处理.
71329 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 地表球囊霉诱发番茄抗早疫病的机理摇 摇 摇 摇 摇 摇
GA处理: 番茄幼苗预先接种地表球囊霉(100 g),
菌根侵染后对番茄叶片接种茄链格孢菌;G 处理:
番茄幼苗只接种地表球囊霉(100 g),未接种茄链格
孢菌的健康番茄植株;A 处理: 番茄幼苗未接种地
表球囊霉,但接种茄链格孢菌的番茄植株;CK处理:
番茄幼苗未接种地表球囊霉也未接种茄链格孢菌的
健康番茄植株.在番茄苗移栽时接种地表球囊霉.番
茄移栽 40 d后接种茄链格孢菌.
1郾 3摇 播种、接种与管理
番茄种子用 8%的 H2O2消毒 10 min、蒸馏水冲
洗数次后置于生物培养箱中催芽. 待番茄种子发芽
生长 10 d后选取长势一致的幼苗移栽到规格为 24
cm伊18 cm 伊12 cm 经 0. 1% KMnO4溶液消毒的塑料
盘中.塑料盘内盛放经高压蒸汽灭菌的土壤和河砂
混合物(3 颐 1)1郾 5 kg,地表球囊霉接种菌剂 100 g,
覆盖 0郾 5 kg经高压蒸汽灭菌的土壤. 每处理设置 3
个重复,随机摆放.番茄植株每 3 d 浇一次 Hoagland
营养液,每天光照 13 h,维持相对湿度在 75% .番茄
植株生长 35 d 后经乳酸酚翠盘蓝染色液染色检测
根系菌根侵染率.第 40 天时用喷雾法接种茄链格孢
菌的分生孢子悬浮液 20 mL(4伊107 cfu·mL-1),对
照以等量的无菌水代替孢子悬液.
1郾 4摇 测定指标与方法
1郾 4郾 1 菌根侵染率的测定摇 番茄苗移栽 35 d后用打
孔器取番茄植株的根系检测.根样用 FAA 溶液(甲
醛 颐 醋酸 颐 50%酒精按 5 颐 5 颐 90 的体积比混合)固
定,10%KOH溶液透明,0郾 05%乳酸酚翠盘蓝染色
液染色,分色后于 Olympus BX51 显微镜下观察 AM
真菌侵染状况[19] .菌根侵染率用根段频率标准法进
行计算[3] .
1郾 4郾 2 发病率及病情指数的测定 摇 在确定 AMF 侵
染番茄植株根系后,在番茄苗移栽 40 d 后,对处理
GA和 A的番茄植株接种茄链格孢菌. 接种病原菌
后第 10 天记录发病率和发病程度(等级). 根据植
株发病的程度计算病情指数. 病情指数调查方法及
病情分级标准参考 Lohithaswa 等[20]的方法,并略有
改动.番茄症状分为 5 级. 0 级: 叶片上无病斑;1
级: 病斑面积占羽状叶的 1 / 4 以下;2 级: 病斑面积
占羽状叶的 1 / 4 ~ 1 / 2;3 级: 病斑面积占羽状叶的
1 / 2 ~ 3 / 4,近一半小叶枯死;4 级: 病斑面积占羽状
叶的 3 / 4 以上,一半以上或全部小叶枯死.
发病率(DP)和病情指数(DI)计算公式为:
DP = (发病叶数 / 叶片总数) 伊 100%
DI =移(病级叶数 伊发病级别) / (发病最重级
数 伊 叶片总数) 伊 100%
1郾 4郾 3 酶活性的测定 摇 称取番茄叶片 0郾 25 g,液氮
研磨成粉末,在液氮未挥发完前转入离心管,加入
2郾 5 mL 0郾 05 mol·L-1磷酸缓冲液( pH 7郾 8,内含
5%聚乙烯基吡咯烷酮 PVPP),涡旋振荡 10 s,12000
伊g 离心 15 min,取上清液,放入 4 益冰箱中保存备
用.超氧化物歧化酶( SOD)活性的测定方法参照
Nishikimi等[21]的方法,以抑制光还原 NBT 50%为
一个酶活性单位.过氧化物酶(POD)活性的测定采
用愈创木酚法[22] .以上测定均重复 3 次.
1郾 4郾 4 植物总 RNA 的提取 摇 对 4 个处理的番茄植
株在茄链格孢菌接种后的 0、18、65、100 和 140 h 进
行叶片取样,液氮研磨,提取总 RNA[23],-80 益冰箱
冷冻贮藏备用.
1郾 4郾 5 cDNA第一条链的合成摇 根据检测结果,调整
RNA用量,进行反转录. cDNA第一条链的合成参照
宋圆圆[2]的方法.
1郾 4郾 6 实时定量 RT鄄PCR 分析 摇 根据已报道基因
(病程相关蛋白基因 PR1、茁鄄1,3鄄葡聚糖酶基因 PR2
和几丁质酶基因 PR3)的序列设计特异引物进行定
量 RT鄄PCR,以 Ubi3 作为内参基因. 扩增引物见表
1.采用 Promega 公司的 M鄄MLV 反转录酶合成第一
链,按照 TOYOBO 公司 SYBR Green Realtime PCR
Master Mix鄄Plus鄄的程序进行荧光定量 PCR 反应. 引
物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完
成.
1郾 4郾 7 目的基因的 RT鄄PCR 扩增 摇 RT鄄PCR 扩增使
用 Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司),反应体系25 滋L,
其中cDNA模板的数量通过内参调整,模板cDNA
表 1摇 RT鄄PCR所用的特异性引物
Table 1摇 Specific primer for real鄄time PCR (RT鄄PCR)
基因
Gene
基摇 因
登陆号
Accession
No.
特异引物序列
Specific primer
基因片段
长度
Gene fragment
length (bp)
PR1 DQ159948 F: 5 爷鄄GCCAAGCTATAACTACGCTAC鄄
CAAC鄄3爷
R: 5爷鄄GCAAGAAATGAACCACCATCC鄄
3爷
139
PR2 M80604 F: 5 爷鄄GGACACCCTTCCGCTACTCTT鄄
3爷
R: 5爷鄄TGTTCCTGCCCCTCCTTTC鄄3爷
81
PR3 Z15140 F: 5爷鄄AACTATGGGCCATGTGGAAGA鄄
3爷
R: 5爷鄄GGCTTTGGGGATTGAGGAG鄄3爷
128
Ubi3 X58253 F: 5爷鄄TCCATCTCGTGCTCCGTCT鄄3爷
R: 5爷鄄GAACCTTTCCAGTGTCATCAACC鄄3爷
144
8132 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
体积上的增减由超纯水调剂. 扩增条件:95 益 3
min,95 益 45 s,退火温度(PR1: 55郾 4 益;PR2: 51郾 5
益;PR3: 58 益;UBI3: 51郾 5 益) 35 s,72 益 1 min,
35 个循环,72 益延伸 7 min. 取 5 滋L RT鄄PCR 产物
在 1. 5%琼脂糖胶上电泳分析.
1郾 4郾 8 重组标准品质粒制备和重组质粒定量标准曲
线的建立
1)目的片断的扩增摇 根据所用引物的 Tm 值及
扩增片断的长度确定退火温度及延伸时间,完成扩
增反应. PCR反应体系为 4 滋L dNTP mixture (预混
合溶液),5 滋L 10伊buffer (缓冲液),0郾 5 滋L rTaq,1
滋L cDNA ,2 滋L primer,ddH2O2(超纯水)补齐至 50
滋L涡旋混匀,待离心后,于 PCR 仪中扩增. 扩增条
件: 95 益 3 min,95 益 1 min,退火温度(PR1: 55郾 4
益;PR2: 51郾 5 益;PR3: 58 益;UBI3: 51郾 5 益)35 s,
72 益 45 s, 34 个循环,72 益 8 min.
2)目的片断的回收 摇 制备 100 滋L 的 PCR 产
物,用 2. 0%琼脂糖凝胶电泳,紫外切割目的片段,
用胶回收试剂盒(TIANgel Mini Purification Kit)回收
目的片段[2] .
3)目的片段与载体的连接 摇 将目的基因片段
与 T载体(pMD18鄄T Vector)(TaKaRa) 按 DNA Liga鄄
tion Kit Ver. 2 说明进行连接反应,目的片段与载体
的摩尔比为 3 颐 1 ~ 10 颐 1,于 16 益反应 3 h. 在 10
滋L总反应体系中按下述条件进行连接反应: 纯化
的目的片段 4 滋L, pMD18鄄T Vector 1 滋L, ligation
mixture (连接混合液)5 滋L,轻轻混匀,短暂离心,16
益反应过夜.
4)重组子的转化及鉴定 根据宋圆圆[2]的方法
制备大肠杆菌感受态细胞与进行大肠杆菌的转化和
重组子的鉴定. 质粒的提取和鉴定选用 TIANGEN
公司的质粒小提试剂盒(离心柱型) TIANprep Mini
Plasmid Kit,操作步骤参照说明书进行.
1郾 4郾 9 重组质粒定量标准曲线的建立摇 将标准品重
组质粒进行 10 倍系列稀释,以系列稀释的质粒为模
板在实时荧光定量 PCR 仪上扩增. 反应体系为 25
滋L体系,反应组分为: Mix 12郾 5 滋L、引物 0郾 4 滋L、
重组质粒 DNA 1 滋L、灭菌双蒸水 11郾 1 滋L. 反应条
件: 94 益 3 min,94 益 45 s,退火温度(PR1: 55郾 4
益;PR2: 51郾 5 益;PR3: 58 益;UBI3: 51郾 5 益)30 s,
72 益 15 s,39 个循环,82 益 1 s.在每个循环内加入
读板步骤,总延伸结束后,加入溶解曲线的制备(65
益 ~95 益,每 0郾 2 益读板 1 次),步骤为 PR1: 55郾 4
益;PR2: 51郾 5 益;PR3: 58 益;UBI3: 51郾 5 益,反应
结束后,以起始模板数的对数为 y轴,循环数为 x 轴
进行回归,建立标准曲线.
1郾 5摇 数据处理
本试验 Real鄄time PCR采用 SYBR Green玉嵌合
荧光法对诱导表达的目标基因进行定量. 定量方法
采用 Bio View的相对定量方法: 分别使用目的基因
X和管家基因 H的 5个浓度梯度标准品,制作标准曲
线,样品与标准品同时进行反应,得到样品基因和管
家基因的浓度,然后用样品基因的浓度除以管家基因
的浓度,得到的相对值即为基因的相对表达水平.
用 SPSS 14. 0 统计分析软件对试验数据进行统
计分析.用 Excel软件作图,同一时间点不同处理之
间的差异显著性用 Tukey post鄄hoc test进行检验.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 番茄 RNA的提取和目的基因片段的扩增
2郾 1郾 1 番茄 RNA 的提取 摇 以番茄叶片为材料提取
番茄叶片总 RNA,经 1%变性琼脂糖凝胶电泳检测.
电泳结果表明,RNA 分子(图 1)保持完整,紫外分
光检测 A260 / A280 在 1郾 8 ~ 2郾 0 之间,纯度也符合
试验要求.
2郾 1郾 2 目的基因片段的扩增 摇 以番茄 cDNA 为模
板,通过 RT鄄PCR扩增,扩增产物用 2. 0%琼脂糖凝
胶电泳,扩增出 139 bp、81 bp、128 bp和 144 bp的产
物,与理论上核苷酸(PR1 139 bp; PR2 81 bp; PR3
128 bp;UBI3 144 bp)大小一致(图 2),说明经 PCR
扩增后得到了正确的目的片段. 扩增片段的特异性
强,无非特异性扩增. 将扩增片段回收,回收后用于
与 T载体(pMD18鄄T Vector)进行连接反应.
2郾 1郾 3 标准曲线的建立 摇 对重组质粒 DNA 的菌液
进行 PCR扩增,产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳,获得
大小不一的片段(PR1 139 bp;PR2 81 bp; PR3 128
bp;UBI3 144 bp),但各片断和组织 mRNA 经 RT鄄
PCR扩增片段大小一致(图 3 和图 4). 说明所插入
的外源基因为目的基因片段,即质粒连接、转化成
功,标准质粒构建成功.
图 1摇 番茄叶片总 RNA
Fig. 1摇 Total RNA of tomato leaves.
91329 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 地表球囊霉诱发番茄抗早疫病的机理摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 UBI3、PR2、 PR3 和 PR1 目的片段回收
Fig. 2摇 Callback of PCR production of UBI3, PR2, PR3 and PR1.
M: 分子量标记 Marker DL鄄2000.下同 The same below. 1)UBI3; 2)PR2;3)PR3; 4)PR1.
图 3摇 PR2 和 PR3 重组子菌液 PCR检测
Fig. 3摇 PCR detection of plasmid and recombinant T鄄easy鄄vectors of PR2 and PR3.
1 ~ 8)PR2; 9 ~ 16)PR3.
图 4摇 UBI3 和 PR1 重组子菌液 PCR检测
Fig. 4摇 PCR detection of plasmid and recombinant T鄄easy鄄vectors of UBI3 and PR1.
1 ~ 5)UBI3; 6 ~ 10)PR1.
2郾 1郾 4 定量标准曲线的构建和回归方程的设定摇 经
鉴定,重组质粒构建成功,将重组标准品质粒进行
10 倍倍比稀释,然后进行实时荧光定量 PCR 扩增.
根据荧光值的变化规律,通过基线设定,系统自动生
成实时定量 PCR重组质粒 DNA标准曲线.
从图 5 可以看出,各引物的扩增产物溶解曲线
只有一个峰值,表明所用引物的自身荧光淬灭性能
较好,无非特异信号产生.
2郾 2摇 地表球囊霉侵染和 /或病原菌侵染对番茄叶片
POD和 SOD酶活性的影响
从图 6 可以看出,只接种地表球囊霉的处理 G,
番茄叶片中 POD活性在 18、65、100 和 140 h均高于
对照 CK.只接种病原菌 A. solani 的处理 A 在 65 h
时 POD活性达到最高水平,为 510 U·h-1·g-1FM,
随后迅速降低.而预先接种地表球囊霉再接种 A. so鄄
lani 的处理 GA,在病原菌接种 18 h 后,POD活性便
显著高于只接种 AM 菌(G)、只接种病原菌(A)和
未接种对照 ( CK ), 65 h 达到最高峰 603郾 33
U·h-1·g-1FM,分别比 G、 A 和 CK 3 个处理高
762% 、18郾 3%和 1710% ,随后迅速降低.处理 GA的
POD 酶活性上升速度和峰值一直明显高于只接种
地表球囊霉或只接种病原菌 A. Solani的处理.
只接种地表球囊霉的处理 G 和只接种病原菌
A. solani 的处理 A,其番茄叶片中 SOD 活性在病菌
接种后 18、65 和 100 h 均高于 CK.而预先接种地表
球囊霉后再接种病原菌 A. solani 的处理 GA,在病原
菌接种后 18、 65 和 100 h, SOD 活性显著高于
处理G、A和CK ,接种后1 8 h达到最高 ( 1283郾 02
0232 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
图 5摇 UBI3、PR3、 PR1 和 PR2 溶解曲线
Fig. 5摇 Melting curves of UBI3, PR3, PR1 and PR2.
图 6摇 地表球囊霉和 /或茄链格孢菌病原菌侵染对番茄叶片
防御性酶活性的影响
Fig. 6摇 Effects of mycorrhizal colonization by Glomus versiforme
and / or pathogen infection by Alternaria solani on defense鄄related
enzymes activities in leaves of tomato plants.
U·h-1·g-1FM),分 别 比 处 理 G、 A 和 CK 高
28郾 6% 、79郾 2%和 82. 8% ,随后迅速降低. 其上升速
度和峰值一直明显高于只接种 AM真菌或只接种病
原菌 A. solani的处理.可见,预先接种 AM真菌地表
球囊霉的番茄植株在遇到病原原菌侵染时,叶片中
防御反应酶的活性能够迅速提高,从而增强了植株
的抗病性.
2郾 3摇 地表球囊霉侵染和 /或病原菌侵染对番茄叶片
防御反应基因表达的影响
荧光定量 PCR检测表明,茄链格孢菌侵染预先
接种地表球囊霉的番茄叶片后(GA),病程相关蛋白
基因(PR1)、茁鄄1,3鄄葡聚糖酶基因(PR2)和几丁质
酶基因(PR3)都被诱导表达,且随着病原菌侵染时
间的延长,PR1 和 PR2 基因的诱导表达量逐渐增
加,并在 140 h达到最高;而 PR3 基因表达量则在病
原菌接种后 65 h 达到最高,随后开始下降. 在病原
菌接种后 65、100 和 140 h,处理 GA 番茄叶片中上
述基因的表达量均高于处理 G、A 和 CK,尤以几丁
质酶基因 PR3诱导表达得更强烈、更迅速(图 7).其
中处理 GA、G以及 A在 140 h 时的病程相关蛋白基
因(PR1)的诱导表达量分别是未接种 CK 的 9郾 67、
3郾 06和5郾 58倍,茁鄄1,3鄄葡聚糖酶基因(PR2)的诱导表
达量分别是未接种CK的8郾 54、1郾 57和5郾 58倍 . 而
12329 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 宋圆圆等: 地表球囊霉诱发番茄抗早疫病的机理摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 7摇 地表球囊霉和 /或茄链格孢菌病原菌侵染对番茄叶片
防御反应基因表达的影响.
Fig. 7摇 Effects of mycorrhizal colonization by Glomus versiforme
and / or pathogen infection by Alternaria solani on expression of
defense鄄related genes in leaves of tomato plants.
不同字母表示处理间差异显著 ( P < 0郾 05) Significant difference at
0郾 05 level among treatments at the same time point was indicated by dif鄄
ferent letters.
GA处理的几丁质酶基因(PR3)的诱导表达量在 65
h达到最高值,是 CK 的 13郾 4 倍. 即使处理 G(只接
种地表球囊霉)和处理 A(只接种茄链格孢菌)也能
诱导上述基因的表达,分别是 CK 的 1郾 27 和 5郾 58
倍,但处理 GA的诱导表达效果更显著.
可见,预先对番茄幼苗接种地表球囊霉使番茄
植株处于一种‘诱发爷状态,当再受到病原菌侵染
时,更快速、强烈地诱导启动了番茄叶片内与抗病防
御相关的 PR1、PR2 和 PR3 基因的表达. 虽然只接
种病原菌或只接种地表球囊霉也能诱导番茄叶片中
防御反应基因(PR1、PR2 和 PR3)的表达,但其诱导
表达量低于 GA处理.
表 2摇 接种地表球囊霉对番茄早疫病的影响与番茄根系的
菌根侵染率
Table 2摇 Effects of mycorrhizal colonization by Glomus ver鄄
siforme on disease infected by Alternaria solani, and root
mycorrhizal colonization rates of tomato plants (%)
接种的菌种
Inoculated
species
发病率
Disease
incidence
病情指数
Disease
index
菌根侵染率
Mycorrhizal
colonization
rate
G. versiforme + A. solani 40. 1依5. 3b 17. 2 依0. 8b 52. 7依2. 3b
G. versiforme 0c 0c 61. 6依2. 9a
A. solani 63依4. 2a 44. 5依2. 6a 0c
对照 CK 0c 0c 0c
同列不同小写字母表示水平差异显著(P<0. 05) Different letters in
the same column meant significant differences at 0. 05 level.
2郾 4摇 地表球囊霉的侵染率与接种地表球囊霉对番
茄早疫病病情的影响
番茄植株根系接种地表球囊霉 35 d 后,GA 和
G处理的根系都有菌根真菌侵染,侵染率分别为
52郾 7%和 61郾 6% ;与单独病原菌侵染(A)相比,菌根
形成后受病原菌侵染(GA)的番茄植株的发病率和
病情指数分别降低了 36郾 3%和 61郾 4% (表 2).
3摇 讨摇 摇 论
在植物鄄病原菌的互作中,病原菌入侵能诱导植
物产生防御反应,诱导与抗病有关的 PR 基因表达,
增强植物抵御病原菌侵染的能力.然而,病原菌自身
诱导的防御反应和抗病性需要较长的时间,诱导的
防御反应也不够强烈,从而不能产生有效的抗病性.
而诱发防御机制是植物预先受到某种生物或化学物
质的刺激,使植物处于‘诱发爷状态. 处于‘诱发爷状
态的植物本身没有强烈的防御反应,可是一旦遭受
到病原菌袭击时,‘诱发爷状态植物就可以产生快速
和强烈的防御反应,从而为植物抵御病原菌的入侵
赢得了时间,产生有效的抗病性. 理论上,诱发防御
节省能量,防御更加有效[13-14] . 例如,预先用 SA 处
理,再给植物接种丁香假单孢菌(Pseudomonas syrin鄄
gae pv. syringae)或伤害处理,能诱发抗性相关基因
非常快速和强烈的表达[24] . 已有研究表明,虫害诱
导植物产生的挥发物可以诱发一些植物产生抗病性
和抗虫性[25] .正常情况下,受损伤植物需要释放足
够量的挥发物(VOCs)才能诱导周围植株产生防御
反应,但 ‘诱发爷状态的植物在低浓度的挥发物
(VOCs) 下便可快速有效地激活植株的防御系
统[26] . Engelberth等[27]研究表明,当玉米植株暴露
在邻近受害植株释放的挥发性物质时,其产生的倍
半萜烯和茉莉酸含量最高. NPR1 ( nonexpressor of
2232 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
pathogenesis related genes 1)是系统获得性抗性途径
中的关键调控基因,诱发抗病与 NPR1 基因的诱导
有关[13] .
本研究表明,预先接种地表球囊霉的番茄植株
在遭受茄链格孢菌侵染时可以诱发叶片中保护酶活
性的迅速提高和病程相关蛋白基因的快速表达(图
6 和图 7). Pozo 等[28]研究发现,番茄形成菌根后可
以对寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)产生系统
抗性,只有菌根化的番茄植株在病菌入侵周围通过
胶质和胼胝质累积形成乳状突起,并累积 PR1a 和
茁鄄1,3鄄葡聚糖酶. 而只接种地表球囊霉和只被茄链
格孢菌侵染的番茄植株防御反应慢,防御酶和基因
表达水平低.说明预先对番茄幼苗接种地表球囊霉
使该植物处于诱发状态,当菌根化的番茄再遇到病
菌侵染时,番茄的防御反应即迅速被激活,从而提高
了植株的抗病性. Pozo等[17]也证明了摩西球囊霉和
根内球囊霉(G. intraradices)侵染番茄根系后外源施
加茉莉酸、水杨酸和乙烯能在短时间内快速启动相
关酶活性和基因的表达. 菌根化的胡萝卜根系对镰
刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi)的侵
染可以做出更强的防御反应[29] .菌根侵染也增强了
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)感染的马铃薯植株
内植物抗毒素日齐素和莎草酮的累积,而菌根化的
马铃薯并没有累积这些抗性化合物[30] . 可见,菌根
可以诱发植物产生抗病性,已经形成菌根的植物可
以对病原菌的二次入侵产生快速而强烈的防御反
应,激活防御反应基因和提高抗性酶的活性,进而抵
抗病原菌的进一步入侵.
丛枝菌根真菌地表球囊霉能诱发宿主植物产生
防御反应和抗病性具有重要的生态学意义. 因为丛
枝菌根真菌可与 80%以上的高等植物形成共生关
系,形成的菌根有多种功能,这种共生关系在自然界
中能自然形成,且十分稳定.阐明菌根真菌诱发宿主
植物的抗病机理将为利用有益微生物菌根真菌进行
病害的生物防治提供理论基础.
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作者简介摇 宋圆圆,女,1982 年生,博士.主要从事化学生态
学研究,发表论文 10 篇. E鄄mail: yyuansong@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
4232 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷