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Effects of continuous application of bio-organic fertilizer on banana production and cultural microflora of bulk soil in orchard with serious disease incidence.

生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤可培养微生物区系的影响


以连续种植香蕉12年的枯萎病高发病蕉园为试验点,通过平板计数和可培养微生物群落变性凝胶电泳(CD PCR-DGGE)等方法研究田间条件下连续两年施用化肥、牛粪、猪粪和生物有机肥对香蕉枯萎病的抑制作用,以及对香蕉产量、品质和土壤中可培养微生物区系的影响.结果表明: 相比于其他处理,连续两年施用生物有机肥能够有效降低香蕉枯萎病发病率,显著提高大田香蕉单株质量、小区产量、果实可溶性糖含量及可溶性糖与可滴定酸的比值(糖酸比).可培养微生物区系分析结果表明,施用生物有机肥能够显著提高土壤微生物生物量,增加可培养细菌、芽孢杆菌和放线菌数量及细菌与真菌比值,降低尖孢镰刀菌数量.CD PCR-DGGE聚类分析表明,连续两年施用生物有机肥明显改变了土壤可培养细菌群落结构,增加了其丰度和多样性.切胶测序结果表明,连续两年施用生物有机肥的香蕉园土壤增加了类芽孢杆菌、伯克氏菌、未培养疣微菌及Bacillus aryabhattai的丰度,降低了青枯菌、粘金黄杆菌、Fluviicola taffensis、肠杆菌及巨大芽孢杆菌的丰度.表明连续施用生物有机肥能够优化连作蕉园土壤可培养微生物群落结构,防控香蕉枯萎病的发生,提高香蕉产量并改善果实品质.

A field experiment was conducted for two years to investigate the effects of different fertilization applications on the suppression of banana fusarium wilt disease, crop yield, fruit quality and culturable microflora in a banana orchard which has been monocultured with banana for 12 years and suffered serious banana fusarium wilt disease. The fertilizers included chemical fertilizer (CF), cow manure compost (CM), pig manure compost (PM) and bio-organic fertilizer (BIO). The banana soil microflora was invested using platecounting method and culture-dependent polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis method (CD PCR-DGGE). Results showed that, compared with  the other treatments, 2-year consecutive application of BIO significantly reduced the banana fusarium wilt disease incidence, and improved the banana mass per tree, crop yield, total soluble sugar content and the ratio of total soluble sugar to titratable acidity of fruits (sugar/acid ratio). Moreover, the analysis of culturable microflora showed that BIO application significantly increased the soil microbial biomass, soil culturable bacteria, bacillus and actinomycetes, and the ratio of bacteria to fungi (B/F), while decreased the Fusarium oxysporum. Based on the CD PCR-DGGE results, the BIO application significantly altered the soil culturable bacterial structure and showed highest richness and diversity after 2 years of BIO application. The phylogenetic analysis of the selected bands showed that BIO application enriched the soil with the species of Paenibacillus sp., Burkholderia sp., uncultured Verrucomicrobia sp. and Bacillus aryabhattai, and depressed the species of Ralstonia sp., Chryseobacterium gleum, Fluviicola taffensis, Enterobacter sp. and Bacillus megaterium. These results confirmed that the continuous application of BIO effectively controlled the fusarium wilt disease, improved the crop yield and fruit quality, and modulated the soil culturable microflora under field condition.


全 文 :生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤
可培养微生物区系的影响∗
钟书堂1  沈宗专1  孙逸飞1  吕娜娜1  阮云泽2  李  荣1∗∗  沈其荣1
( 1南京农业大学资源与环境学院, 南京 210095; 2海南大学农学院, 海口 570228)
摘  要  以连续种植香蕉 12年的枯萎病高发病蕉园为试验点,通过平板计数和可培养微生
物群落变性凝胶电泳(CD PCR⁃DGGE)等方法研究田间条件下连续两年施用化肥、牛粪、猪粪
和生物有机肥对香蕉枯萎病的抑制作用,以及对香蕉产量、品质和土壤中可培养微生物区系
的影响.结果表明: 相比于其他处理,连续两年施用生物有机肥能够有效降低香蕉枯萎病发病
率,显著提高大田香蕉单株质量、小区产量、果实可溶性糖含量及可溶性糖与可滴定酸的比值
(糖酸比) .可培养微生物区系分析结果表明,施用生物有机肥能够显著提高土壤微生物生物
量,增加可培养细菌、芽孢杆菌和放线菌数量及细菌与真菌比值,降低尖孢镰刀菌数量. CD
PCR⁃DGGE聚类分析表明,连续两年施用生物有机肥明显改变了土壤可培养细菌群落结构,
增加了其丰度和多样性.切胶测序结果表明,连续两年施用生物有机肥的香蕉园土壤增加了
类芽孢杆菌、伯克氏菌、未培养疣微菌及 Bacillus aryabhattai的丰度,降低了青枯菌、粘金黄杆
菌、Fluviicola taffensis、肠杆菌及巨大芽孢杆菌的丰度.表明连续施用生物有机肥能够优化连作
蕉园土壤可培养微生物群落结构,防控香蕉枯萎病的发生,提高香蕉产量并改善果实品质.
关键词  生物有机肥; 香蕉枯萎病; 产量; 品质; 可培养微生物区系
∗国家自然科学基金项目 ( 41101231, 31372142)、海南省应用技术研发与示范推广专项 ( ZDXM2014038)、海南省重大科技项目
(ZDZX2013023)和教育部博士点新教师基金(20110097120001)资助.
∗∗通讯作者. E⁃mail: lirong@ njau.edu.cn
2014⁃05⁃09收稿,2014⁃11⁃03接受.
文章编号  1001-9332(2015)02-0481-09  中图分类号  S59  文献标识码  A
Effects of continuous application of bio⁃organic fertilizer on banana production and cultural
microflora of bulk soil in orchard with serious disease incidence. ZHONG Shu⁃tang1, SHEN
Zong⁃zhuan1, SUN Yi⁃fei1, LYU Na⁃na1, RUAN Yun⁃ze2, LI Rong1, SHEN Qi⁃rong1 ( 1College of
Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China) . ⁃Chin. J. Appl. Ecol., 2015,
26(2): 481-489.
Abstract: A field experiment was conducted for two years to investigate the effects of different ferti⁃
lization applications on the suppression of banana fusarium wilt disease, crop yield, fruit quality and
culturable microflora in a banana orchard which has been monocultured with banana for 12 years
and suffered serious banana fusarium wilt disease. The fertilizers included chemical fertilizer (CF),
cow manure compost (CM), pig manure compost (PM) and bio⁃organic fertilizer (BIO). The ba⁃
nana soil microflora was invested using plate⁃counting method and culture⁃dependent polymerase
chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis method (CD PCR⁃DGGE). Results showed
that, compared with the other treatments, 2⁃year consecutive application of BIO significantly re⁃
duced the banana fusarium wilt disease incidence, and improved the banana mass per tree, crop
yield, total soluble sugar content and the ratio of total soluble sugar to titratable acidity of fruits
( sugar / acid ratio) . Moreover, the analysis of culturable microflora showed that BIO application sig⁃
nificantly increased the soil microbial biomass, soil culturable bacteria, bacillus and actinomycetes,
and the ratio of bacteria to fungi (B / F), while decreased the Fusarium oxysporum. Based on the
CD PCR⁃DGGE results, the BIO application significantly altered the soil culturable bacterial struc⁃
ture and showed highest richness and diversity after 2 years of BIO application. The phylogenetic
应 用 生 态 学 报  2015年 2月  第 26卷  第 2期                                                         
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2015, 26(2): 481-489
analysis of the selected bands showed that BIO application enriched the soil with the species of
Paenibacillus sp., Burkholderia sp., uncultured Verrucomicrobia sp. and Bacillus aryabhattai, and
depressed the species of Ralstonia sp., Chryseobacterium gleum, Fluviicola taffensis, Enterobacter
sp. and Bacillus megaterium. These results confirmed that the continuous application of BIO effec⁃
tively controlled the fusarium wilt disease, improved the crop yield and fruit quality, and modulated
the soil culturable microflora under field condition.
Key words: bio⁃organic fertilizer; banana fusarium wilt disease; crop yield; fruit quality; cultu⁃
rable microflora.
    香蕉是热带亚热带地区的重要经济作物,我国
第 4大宗水果[1] .然而,由尖孢镰刀菌古巴专化型 4
号小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4)侵
染维管束引起的香蕉枯萎病,导致了许多蕉园毁灭,
严重威胁我国香蕉产业的发展[2] .近年来更有加重
的趋势,发病率为 10% ~ 40%,严重时高达 90%以
上[3-4],适宜种植香蕉的区域正在逐渐减少[5] .由于
气候条件的限制,我国可种植香蕉的耕地面积原本
就小,若再不采取有效的防治措施,我国香蕉产业将
面临严峻形势[6] .
目前,防治香蕉枯萎病的方法中轮作经济效益
较低;香蕉抗病品种育种周期长,短期内难以见效;
传统化学防治如使用杀菌剂,防治效果并不理
想[7-8] .生物防治是一种安全、环保、经济效益高且长
效的防治措施[9-11],但在不添加有机物料的条件下,
直接向土壤中施用生防菌剂由于缺乏营养而影响其
作用发挥[12] .许多研究已报道,由生防菌剂结合有
机物料发酵而制成的生物有机肥(BIO)能够增加功
能微生物的活力[13-15] .施用该类功能型肥料不仅能
有效抑制土壤病原菌,还能促进植物生长[16],目前
许多生防菌株均在盆栽试验及温室中展现出了良好
的抑病能力,但田间试验才是检验生防菌剂抗病能
力的最终也是必须步骤[17] .然而,目前有关生物有
机肥施用对高发病蕉园香蕉枯萎病防控的研究仍旧
很少.
土壤健康是农业系统中作物生长最重要的必需
条件之一,土壤微生物对土壤健康和病害防控极其
关键[18] .其中,细菌对驱动陆地生态系统的土壤生
物、化学和物理过程非常重要,并对土传病害的防控
有着重要影响[19] .由于土壤中只有少部分细菌能够
在实验室条件下培养,不依赖于培养的方法,近年来
被广泛应用于微生物生态研究[20] .然而,只有能够
被培养出来的细菌,其在自然环境中的生态功能才
能够被评估[21] .此外,有研究指出,土壤中容易培养
的细菌具有更高的生物量和代谢活性,是土壤中起
主要生态功能的贡献者,因此可培养微生物菌群的
变化可以提供与生态功能紧密相关的信息[22] .因
此,对土壤中可培养微生物的研究显得同样重要.同
时,许多研究者只关注于施用不同有机肥后可培养
细菌数量或总细菌群落结构的组成和多样性[23-24],
对于不同有机肥施用后香蕉园土壤可培养细菌群落
结构的研究还未见报道.
本研究通过田间试验,研究连续施用生物有机
肥两年对香蕉枯萎病的防控效果及对产量和品质的
影响.同时通过平板计数和可培养微生物群落 PCR⁃
DGGE 等方法研究高发病蕉园连续两年施用化肥、
牛粪、猪粪和生物有机肥对土壤可培养微生物区系
的影响,以期为生物有机肥对香蕉连作障碍土壤的
修复及香蕉生长的促进提供科学依据.
1  材料与方法
1􀆰 1  供试材料
供试香蕉品种为农科 1 号(中感巴西蕉),由海
南万钟实业有限公司提供.
供试猪粪有机肥购自江苏田娘农业科技有限
公司,含氮(N) 1.02%,磷(P 2O5) 2.55%,钾(K2O)
0􀆰 93%;牛粪有机肥购自江阴联业生物科技有限
公司,含氮(N) 1.28%,磷(P 2O5) 2.19%,钾(K2O)
1􀆰 25%;BIO生物有机肥由本实验室研制,将筛选到
的对香蕉枯萎病病原菌有显著拮抗作用的菌种解淀
粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens NJN⁃6)接种
到腐熟猪粪堆肥和菜粕混合物中(60%猪粪和 40%
菜粕),经二次固体发酵制成,含氮(N) 3. 38%,磷
(P 2O5)2􀆰 80%,钾(K2O)1.21%.
供试土壤为由燥红土发育形成的沙壤,连作香
蕉 12年,pH 6.58,有机质含量 7.43 g·kg-1,全氮含
量 1.27 g·kg-1,速效磷和速效钾的含量分别为 70.6
和 373 mg·kg-1 .
1􀆰 2  田间试验设计
试验于 2010年 5月至 2012年 6月在海南省万
钟实业有限公司万亩蕉园中进行,供试田块已连续
种植香蕉12年,香蕉枯萎病发病率>60%.试验共设
284 应  用  生  态  学  报                                      26卷
表 1  堆肥施用量及各处理添加的化肥用量
Table 1  Amounts of compost and chemical fertilizer used in each treatment
处理
Treatment
肥料施用量 Amount of fertilizer (kg·667 m-2)
新植茬 Re⁃planted crop year (2010-2011)
堆肥 Compost N P K
留芽茬 Ratoon crop year (2011-2012)
堆肥 Compost N P K
CM 600 31 7 68 400 21 4 46
PM 600 33 6 70 400 22 4 47
BIO 600 19 5 68 400 13 3 46
CF 0 39 12 74 0 26 8 50
CM: 牛粪有机肥 Cattle manure compost; PM: 猪粪有机肥 Pig manure compost; BIO: 生物有机肥 Bio⁃organic fertilizer; CF: 化肥 Chemical fertili⁃
zer. 下同 The same below.
4个处理:1)生物有机肥处理(BIO);2)牛粪有机肥
(CM);3)猪粪有机肥(PM);4)对照(CF),不施有
机肥,只施化肥.每处理 3 个重复,每个重复小区面
积为 667 m2,各处理用化肥补齐养分,具体肥料用
量见表 1.肥料分 3 次施用,种苗前施入总量的 2 / 3
作为基肥,剩余的 1 / 3 用量于营养期和蕾期分 2 次
施用.各小区于 2010 年 5 月种植 170 棵香蕉组培
苗,在第一茬香蕉收获 2个月后,于 2011年 7 月,每
株选取 1个最好的吸芽苗进行第二茬种植.
1􀆰 3  测定项目与方法
1􀆰 3􀆰 1香蕉枯萎病发病率测定   自 2011 年 7 月开
始留芽,3个月后开始逐月根据黄叶、维管束堵塞坏
死及叶片下垂等枯萎病发病的典型症状判断植株发
病与否[25],于香蕉枯萎病发病率稳定时,用发病株
数与总株数的比例表示发病率.(处理发病率-对照
发病率) /对照发病率的绝对值为防病效果.
1􀆰 3􀆰 2香蕉产量及品质测定   于 2012 年 6 月留芽
茬香蕉收获期对各小区随机标注 30 株健康香蕉果
实,在采收时记录单株质量,取其均值.依据各小区
单株质量和能收获的健康香蕉株数估算各小区香蕉
果实的总质量并换算为香蕉产量.香蕉果实的可滴
定酸、可溶性糖及糖酸比的测定参考文献[26],可
滴定酸的测定结果以 g苹果酸每 100 g 鲜质量表示
(g·100 g-1 FM),而可溶性糖以 g 葡萄糖每 100 g
干质量(g·100 g-1 DM)表示.
1􀆰 3􀆰 3土样采集  试验采集了 4 个处理小区的土壤
样品,每处理 3 个重复.于 2012 年 6 月留芽茬香蕉
收获时,各重复小区随机选择 5株健康香蕉,用土钻
于植株滴水线附近随机选取 3点钻取距地表约 10~
15 cm处土样,每个重复小区土样混合后放入自封
袋于实验室 4 ℃保存备用.
1􀆰 3􀆰 4土壤微生物碳量的测定  采用氯仿熏蒸浸提
法测定土壤微生物量碳.称取鲜土 20.0 g 于 25 mL
烧杯中,置烧杯于真空干燥器,并抽真空至干燥器底
部烧杯中氯仿沸腾 5 min,将干燥器移置黑暗条件下
25 ℃熏蒸土壤 24 h,再反复抽真空至完全去除土壤
中的氯仿.用 K2SO4提取液浸提熏蒸后土壤,过滤.用
K2Cr2O7和浓硫酸于 175 ℃磷酸浴中消煮 10 min,冷
却后全量转移并加水稀释至 80 mL,最后用 0. 05
mol·L-1 FeSO4滴定至砖红色.每处理重复测定3次.
1􀆰 3􀆰 5土壤中可培养微生物数量的测定  采用平板
稀释涂布法测定土壤可培养微生物的数量.吸取 100
μL土壤稀释液至相应平板,均匀涂布.总细菌采用
R2A培养基,真菌采用马丁氏培养基,放线菌采用
高氏 1 号培养基,尖孢镰刀菌采用 Komada 培养基,
假单胞菌采用 King⁃B 培养基,芽孢杆菌则采用 LB
培养基.芽孢杆菌涂布前,将稀释液于 80 ℃水浴 15
min.将每 g 干土形成的菌落数(colony forming unit,
CFU),取对数值,以lg(CFU·g-1干土)表示.各样品
中每 g干土的细菌菌落数比真菌的菌落数,即为可
培养细菌与真菌的比值(B / F).
1􀆰 3􀆰 6土壤可培养细菌群落结构分析   采用 PCR⁃
DGGE分析可培养细菌群落结构.用无菌水快速洗
脱 R2A培养基上培养 14 d后的菌落并均匀混合.取
2 mL菌液,采用 CTAB法提取细菌基因组 DNA,保存
于-20 ℃备用.PCR扩增采用 16S rDNA引物 Eub338 /
Eub518 (5′⁃GC clamp⁃ACTCCTACGGGAGGCAGCAG⁃
3′ / 5′⁃ATTACCGCGGCTGCTGG⁃3′),其中, GC clamp
为 5′⁃CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGC⁃
CCCCGCCCC⁃3′.PCR 扩增反应体系:10×PCR 缓冲
液(无 Mg2+)5 μL,Mg2+(25 mmol·L-1)4 μL,dNTPs
(各 2.5 mmol·L-1)4 μL,引物(10 μmol·L-1)各 1
μL,模板 DNA 1 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)
0.3 μL,加入超纯水(ddH2O)补足 50 μL. PCR扩增
条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,
循环 32 次;72 ℃ 10 min.采用 D⁃Code点突变检测系
统(D⁃code universal mutation detection system, BIO⁃
RAD,USA)对 PCR产物进行 DGGE 分析.聚丙烯酰
胺凝胶浓度为 8%,变性剂梯度为 40% ~60%(100%
的变性剂为 7 mol·L-1尿素和 40%去离子甲酰胺的
3842期                    钟书堂等: 生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤可培养微生物区系的影响       
混合物).电泳条件:80 V电压、60 ℃恒温电泳 16 h,
电泳结束后银染胶片并扫描保存.分析 DGGE 胶片
上生物有机肥处理消失与增加条带及一些共有条带
的强度差异,切割回收特异条带并测序.
1􀆰 4  数据处理
DGGE 电泳图谱采用 Quantity One 4.4.0 软件进
行条带检测和强度分析.非加权组平均法(UPGMA)
进行集群分析. Shannon 多样性指数(H)计算公式
为: H =- ∑P i lnP i ,式中: P i =Ni / N.其中:P i为特
异性个体群落数占总群落数的比例,Ni为个体条带
强度,N为测出的所有条带强度总和.数据统计分析
使用 Excel 2007和 SPSS 13.0 软件,通过 Duncan 新
复极差法检验处理间差异的显著性水平(α= 0􀆰 05).
2  结果与分析
2􀆰 1  不同施肥模式对香蕉枯萎病发病率的影响
田间试验结果表明,在连作多年且高发枯萎病
的香蕉园土壤上连续两年施用生物有机肥能够有效
降低枯萎病的发病率(图 1).尽管再次连作两年后
生物有机肥处理发病率达到 40%,但与化肥及其他
处理相比,生物有机肥处理的枯萎病发病率下降了
约 30%,防控率约达到 42%.
2􀆰 2  不同施肥模式对香蕉产量及品质的影响
由图 2可以看出,连续施用 2 年肥料后,BIO 处
理的大田产量为 2568 kg·667 m-2,显著高于猪粪、
牛粪处理及化肥对照.与猪粪、牛粪处理及化肥对照
相比,生物有机肥处理分别增产 1170、1214 和 1517
kg·667 m-2,增产率分别达到 83%、90%和 145%.
图 1  不同施肥模式对香蕉枯萎病发病率的影响
Fig.1  Effects of different practices of fertilization on fusarium
wilt disease incidences.
CM: 牛粪有机肥 Cattle manure compost; PM: 猪粪有机肥 Pig manure
compost; BIO: 生物有机肥 Bio⁃organic fertilizer; CF: 化肥 Chemical
fertilizer. 不同字母表示处理间差异显著( P < 0. 05) Different letters
meant significant difference at 0.05 level. 下同 The same below.
图 2  不同施肥模式对香蕉大田产量的影响
Fig. 2   Effects of different practices of fertilization on banana
crop yield.
    由表 2可以看出,连续两年施用 BIO后,香蕉果
实的可溶性糖含量显著高于猪粪、牛粪处理及化肥
对照,而后三者间无显著差异;香蕉果实的可滴定酸
含量与猪粪、牛粪处理及化肥对照相比无显著差异;
可溶性糖与可滴定酸的比值(糖酸比)显著高于猪
粪、牛粪处理及化肥对照,而后三者间无显著差异.
2􀆰 3  不同施肥模式对土壤微生物碳量的影响
连续 2年施用生物有机肥 BIO 后,土壤微生物
碳含量显著高于猪粪、牛粪处理及化肥对照,而后三
者间没有显著差异(图 3).
2􀆰 4  不同施肥模式对土壤可培养微生物数量的
影响
涂布计数结果表明,连续两年施用生物有机肥
BIO后,土壤中可培养细菌、芽孢杆菌和放线菌数量
显著高于猪粪、牛粪处理及化肥对照,而后三者间无
显著差异;假单胞菌、可培养真菌数量与猪粪、牛粪
处理及化肥对照相比无显著差异,但尖孢镰刀菌属
的数量显著降低 .连续两年施用生物有机肥BIO土
表 2  不同施肥模式对香蕉果实可溶性糖和可滴定酸含量
及糖酸比的影响
Table 2   Effects of different practices of fertilization on
total soluble sugar content, titratable acidity content and
sugar / acid ratio of banana fruits
处理
Treat⁃
ment
可溶性糖含量
Total soluble
sugar
(g·100 g-1 DM)
可滴定酸含量
Titratable acidity
(g·100 g-1 FM)
糖 /酸比
Sugar / acid
ratio
CM 17.35±0.96b 0.32±0.01a 54.13±2.93b
PM 16.01±0.82b 0.28±0.01a 57.44±3.04b
BIO 20.63±0.12a 0.26±0.02a 79.20±2.91a
CF 17.02±0.82b 0.31±0.02a 54.36±2.68b
同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05) Different letters in the
same column meant significant difference at 0.05 level. 下同 The same
below.
484 应  用  生  态  学  报                                      26卷
图 3  不同施肥模式对土壤中微生物生物量碳的影响
Fig.3  Effects of different practices of fertilization on microbial
biomass C.
图 4  不同施肥模式对土壤微生物区系的影响
Fig.4  Effects of different practices of fertilization on soil micro⁃
flora.
Ⅰ: 细菌 Bacteria; Ⅱ: 假单胞菌 Pseudomonas; Ⅲ: 芽孢杆菌 Bacil⁃
lus; Ⅳ: 放线菌 Actinomycetes; Ⅴ: 真菌 Fungi; Ⅵ: 尖孢镰刀菌
Fusarium.
壤细菌与真菌数量的比值(B / F)最高,而猪粪和化
肥处理的 B / F最低(图 4).表明施用 BIO 能有效提
高土壤中总细菌、芽孢杆菌和放线菌的数量,降低尖
孢镰刀菌数量,提高细菌和真菌的比值,有效改良土
壤可培养微生物菌落结构.
2􀆰 5  不同施肥模式对土壤可培养细菌群落结构的
影响
基于 UPGMA的可培养细菌的 DGGE 聚类分析
表明:连续两年施用不同肥料后各处理 3 个重复样
品分别聚在一起,生物有机肥处理单独聚成一簇,而
猪粪、牛粪处理及化肥对照 DGGE 图谱聚成一大
簇,其中,施用普通猪粪及牛粪有机肥处理又聚成一
小簇(图 5),表明连续两年施用生物有机肥改变了
土壤可培养细菌的群落结构.条带分析表明,连续两
年施用生物有机肥对土壤可培养细菌的群落组成同
样产生了影响,表现为一些条带在生物有机肥处理
中的消失与增加和一些共有条带的强度差异:条带
B1、B2、B3、B4及 B5的强度增强,而 F1、F2、F3、F4、F5、
C1、C2、P 1及 P 2的强度减弱,甚至消失,其中条带 B1、
B2、B3及 B5为生物有机肥特有条带.
    基于可培养细菌 DGGE 图谱的丰富度和多样
性指数分析表明:连续两年施用 BIO 后,土壤可培
养细菌的丰富度显著高于猪粪、牛粪及化肥处理,化
肥处理又显著低于猪粪及牛粪处理;生物有机肥处
理的多样性显著高于猪粪、牛粪及化肥处理,而后三
者间无显著差异(表 3).
差异性条带切胶测序结果表明:生物有机肥处
理中强度增强且特有的条带B1 、B2 、B3及B5最可
图 5  不同肥料处理土体土中可培养细菌群落 DGGE 指纹
图片
Fig.5   Culturable bulk bacterial communities associated with
different fertilization treatments as determined by culture⁃
dependent DGGE (CD DGGE).
B、F、C和 P 分别为 BIO、CF、CM和 PM处理 DGGE的克隆条带,1~ 5
表示同一处理不同条带 B, F, C and P were the cloned banks in DGGE
for BIO, CF, CM and PM treatments, respectively, and 1-5 were used
to distinguish different bands in each treatment.
5842期                    钟书堂等: 生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤可培养微生物区系的影响       
能为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp. Gg9)、伯克氏菌
(Burkholderia sp. B35)、未培养疣微菌( uncultured
Verrucomicrobia bacterium clone)及 Bacillus aryabhat⁃
tai M54,分别属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门
(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)及厚壁
菌门( Firmicutes).生物有机肥处理中消失的条带
P 1、C1、C2、F1及 F3最可能为青枯菌 (Ralstonia sp.
Iso⁃38 )、 粘 金 黄 杆 菌 ( Chryseobacterium gleum
HM001)、Fluviicola taffensis MYL⁃8、肠杆菌 (Enter⁃
obacter sp. 2065)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megateri⁃
um BD18C2⁃E05),分别属于变形菌门、拟杆菌门
(Bacteroidetes)、拟杆菌门、变形菌门及厚壁菌门
(表 4).
表 3  基于 CD PCR⁃DGGE的不同处理土壤样品的多样性
指数(H)和丰富度(R)
Table 3  Richness (R) and Shannon diversity indices (H)
for soil samples analyzed by CD PCR⁃DGGE
处理
Treatment
丰富度
Richness
多样性指数
Diversity index
CM 18.00±0.00b 2.82±0.01b
PM 18.67±0.58b 2.81±0.02b
BIO 24.00±0.00a 3.08±0.02a
CF 16.67±0.58c 2.68±0.04b
表 4  PCR⁃DGGE DNA序列的系统发育关系
Table 4  Phylogenetic relationships of the extracted PCR⁃DGGE DNA sequences
分类门
Affiliated phylum
分类纲       
Affiliated class       
相近微生物种类
Closest relative microorganism
条带
Band
相似性
Similarity (%)
厚壁菌门 芽孢杆菌 类芽孢杆菌 Paenibacillus sp. Gg9 B1 98
Firmicutes Bacilli Bacillus aryabhattai M54 B5 100
巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium BD18C2⁃E05 F3 100
短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus SS1A F5 100
变形菌门 β⁃变形菌 伯克氏菌 Burkholderia sp. B35 B2 100
Proteobacteria β⁃Proteobacteria 伯克氏菌 Burkholderia sp. YXE3⁃19 F4 100
青枯菌 Ralstonia sp. Iso⁃38 P1 99
拟杆菌门
Bacteroidetes
黄杆菌纲
Flavobacteriia
脑膜炎败血伊丽莎白菌 Elizabethkingia meningoseptica
GS⁃7⁃08
B4 99
粘金黄杆菌 Chryseobacterium gleum HM001 C1 99
Fluviicola taffensis MYL⁃8 C2 100
变形菌门 γ⁃变形菌 肠杆菌 Enterobacter sp. 2065 F1 99
Proteobacteria γ⁃Proteobacteria 未培养假单胞菌 Uncultured Pseudomonas sp. P2 100
拟杆菌门
Bacteroidetes
鞘脂杆菌纲
Sphingobacteria
泉发菌 Chitinophaga sp. AMF4045 F2 98
疣微菌门
Verrucomicrobia
未定义疣微菌
Unclassified verrucomicrobia
未培养疣微菌 Uncultured Verrucomicrobia bacterium
clone
B3 99
3  讨    论
付琳等[27]报道,与农场常规施肥相比,施用由
解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) NJN⁃6
二次发酵而成的生物肥料一年,能够有效防控香蕉
枯萎病的发生.本研究比较了该生物有机肥与不同
普通有机肥及化肥连续施用两年对香蕉枯萎病的影
响,田间试验表明,连续两年施用生物有机肥能有效
降低香蕉枯萎病发病率.与已报道的研究结果类似,
如由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Y⁃IV1 二次发
酵生物肥料能够有效防控甜瓜枯萎病的发生[28];
Wang 等[14] 报道的由解淀粉芽孢杆菌 ( Bacillus
amyloliquefaciens)W19二次发酵而成的生物肥料能
够有效防控香蕉枯萎病的发生.本试验连续两年施
用生物有机肥能够显著提高香蕉产量、改善香蕉果
实品质.而何欣等[29]研究发现,营养钵育苗和移栽
时都施用由多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymixa)
SQR21二次发酵而成的生物有机肥能显著促进香
蕉植株生长. Baset Miaa 等[30]研究发现,由根际促
生菌株(PGPR)发酵而成的生物有机肥能够促进香
蕉生长并提高香蕉产量. Kavino 等[31]研究发现,由
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) CHA0 及几
丁质发酵而成的生物有机肥能够显著提高香蕉产量
并改善品质.本研究试验地在建立之前已连续种植
香蕉 12年,每年会施用化肥和有机肥,而本试验仅
调查连续两年不同肥料的施用效应,推测大量施用
有机肥对土壤的正面效应可能还未完全体现.
生物有机肥的连续施用能够显著增加土壤微生
物生物量碳含量.胡诚等[32]研究发现,与普通堆肥
及化肥处理相比,生物有机肥能够显著增加玉米田
块中土壤微生物量碳含量.连作条件下,土壤中致病
真菌类微生物大量繁殖和微生物区系的变化,是连
684 应  用  生  态  学  报                                      26卷
作障碍的主要原因之一[33] .涂布计数结果表明,在
连作多年并废弃的香蕉果园土壤上连续两年施用生
物有机肥能够显著增加土壤可培养细菌、放线菌及
芽孢杆菌数量.这与 Shen 等[34]的研究结果一致.连
续两年施用生物有机肥能够明显降低尖孢镰刀菌数
量,这与生物有机肥在香蕉[34]、甜瓜[28]、西瓜[35]上
的研究结果一致.细菌真菌比值(B / F)是土壤微生
物生态的重要指标,常被用来指示微生物群落结构
的变化[36] .Liu等[37]的研究表明,B / F与土壤肥力呈
正相关;Yao等[38]研究表明,高 B / F 土壤的抑病能
力更强.本研究中,连续两年施用生物有机肥能够显
著增加土壤 B / F,表明生物有机肥的施用增加了土
壤肥力并提高了香蕉园土壤抑制尖孢镰刀菌的
能力.
平板计数方法仅能反映土壤中可培养微生物种
群的数量变化,无法反映微生物种类的改变. CD
PCR⁃DGGE被应用于研究可培养细菌群落的变化并
探寻影响细菌群落变化的生物和环境关键因子[39] .
CD PCR⁃DGGE 分析表明,连续两年施用不同肥料
能够显著改变土壤可培养细菌的群落组成与结构,
连续施用生物有机肥显著增加了可培养细菌群落的
丰度及多样性.He 等[24]的 DGGE 研究结果同样表
明,细菌群落结构受不同施肥方式的影响;付琳
等[27]的 DGGE结果表明,施用生物有机肥的香蕉园
土壤总细菌的丰度及多样性明显提高.土壤微生物
的丰度和多样性与土壤抑制土传病害的能力呈正相
关[40],连续施用生物有机肥的香蕉园枯萎病发病率
最低,可能与此有关.
DGGE部分条带切胶回收测序分析表明:连续
两年施用生物有机肥的香蕉园土壤明显增加了类芽
孢杆菌 (Paenibacillus sp.)、伯克氏菌 (Burkholderia
sp.)、未培养疣微菌(uncultured Verrucomicrobia sp.)
及 Bacillus aryabhattai的丰度,同时也明显降低了青
枯菌(Ralstonia sp.)、粘金黄杆菌(Chryseobacterium
gleum)、Fluviicola taffensis、肠杆菌(Enterobacter sp.)
及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的丰度.疣微
菌门(Verrucomicrobia)是刚划分确定的新门,广泛
分布于水体、人体及土壤环境中,因其在实验室内难
以培养,有关其生态功能的研究还很少[41] .本研究
结果与 Shen等[34]报道的施用 1 年生物有机肥后香
蕉园土壤中疣微菌门的未命名疣微菌(Verrucomicro⁃
bia sp.)丰度有所增加相似.其他 3 种增加的菌均属
于 PGPR,被广泛应用于生物防治及促进作物生长,
如厚壁菌门的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)能够产
生多种拮抗物质并能抑制尖孢镰刀菌的生长[42];变
形菌门的伯克氏菌属(Burkholderia)能够防治棉花
枯萎病的发生[43];厚壁菌门的 Bacillus aryabhattai
能够产生吲哚乙酸并促进植物生长[44] .连续施用生
物有机肥增加了土壤中有益菌的数量,通过分泌促
生或者拮抗物质,抑制病原菌生长[45],并促进香蕉
生长.
综上所述,连续两年在连作障碍严重的蕉园施
用大量生物有机肥,显著增加了土壤微生物碳量、可
培养细菌、芽孢杆菌和放线菌的数量,减少了尖孢镰
刀菌的数量并改良了可培养细菌的群落结构及组
成.推测这些变化有利于连作土壤朝着稳定健康的
方向发展,有助于增加有益细菌的数量并抑制土壤
中病原真菌的繁殖,达到防控香蕉枯萎病和增产的
目的.
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作者简介  钟书堂,女,1991 年生,硕士研究生.主要从事土
壤微生物生态与肥料研究. E⁃mail: Unknown1990@ 163.com
责任编辑  肖  红
9842期                    钟书堂等: 生物有机肥对连作蕉园香蕉生产和土壤可培养微生物区系的影响