全 文 ：香草兰(Vanilla planifolia Ames.)是兰科香草兰
属热带藤本攀缘植物， 具有 “天然食品香料之王”
的誉称。 其鲜豆荚经过生香加工后含有 250多种香
气成分， 香气独特， 被广泛应用于调制各种高级茶
叶、 名酒和香水等， 是各类高档食品和化妆品的配
香原料， 在国际市场上供不应求。 香草兰在我国海
南、 云南和广东等热带亚热带地区均有种植， 但热
带亚热带地区降雨量较大， 淋溶作用强烈， 且土壤
酸度较高， 使土壤磷和施入土壤中的肥料磷绝大部
分与铁、 铝形成难溶性的铁磷和铝磷， 甚至有效性
更低的闭蓄态磷， 难于被作物吸收利用。 王华等 [1]
对海南省香草兰园主要种植区的种植园进行了养分
测定分析， 结果表明： 香草兰种植园可被植物吸收
利用的养分 N、 P、 K、 Ca、 Mg 均缺乏， 其中有效
热带作物学报 2016， 37（4）： 660-664
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2015-08-27 修回日期 2016-02-19
基金项目 国家自然科学青年基金项目（No. 31201683）； 海南省中药现代化专项（No. 2015ZY12）。
作者简介 王 辉 （1982年—）， 男 ， 硕士 ， 助理研究员 ； 研究方向 ： 热作栽培与生理 。 *通讯作者 （Corresponding author） ： 赵青云
（ZHAO Qingyun）， E-mail: qingyun_022@163.com。
解磷细菌筛选鉴定及其在香草兰上
的应用效果研究
王 辉 1，2， 邢诒彰 1，2， 王 华 1，2， 庄辉发 1，2，
朱自慧 1， 宋应辉 1， 赵青云 1，2*
1 中国热带农业科学院香料饮料研究所， 海南万宁 571533
2 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室， 海南万宁 571533
摘 要 香草兰为喜磷作物， 施用解磷微生物可减少肥料施用量， 促进作物生长。 采用磷酸盐生长培养基从香
草兰种植园中筛选到 6 株可解磷的细菌， 通过 NBRIP 液体培养基摇床培养 3 d 后， 菌株 V-29 培养液中可溶性
磷含量最高， 达到 475.3 μg/mL。 经 16S rDNA 分子鉴定该菌株为伯克霍尔德氏菌。 通过温室盆栽试验研究了施
用 V-29 及其制得的微生物有机肥料在香草兰上的应用效果。 结果表明： 施用由解磷细菌制得的微生物有机肥
可显著提高香草兰茎蔓及根系干重， 但单独接种解磷细菌处理与对照相比， 差异不显著； 施用微生物有机肥及
接种解磷细菌均可提高土壤有效磷和植株全磷含量。
关键词 香草兰； 解磷细菌； 微生物有机肥； 伯克霍尔德氏菌
中图分类号 S144； S573 文献标识码 A
Identification of Phosphate-solubilizing Bacteria and
The Effects on the Growth of Vanilla
(Vanilla planifolia Ames.)
WANG Hui1,2, XING Yizhang1,2, WANG Hua1,2, ZHUANG Huifa1,2,
ZHU Zihui1, SONG Yinghui1, ZHAO Qingyun1,2*
1 Institute of spice and Beverage, CATAS, Wanning, Hainan 571533, China
2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops,
Ministry of Agriculture, Wanning, Hainan 571533， China
Abstract Vanilla (Vanilla planifolia Ames.) is one kind of heavily-phosphorus absorption crops. Six phosphate-
solubilizing bacteria were isolated from vanilla plantation by using National Botanical Research Institutes phosphate
growth medium (NBRIP). After three days incubated in liquid NBRIP medium, the content of soluble P was
475.3 μg/ml in strain V-29 treatment, which was the highest one in all treatments. Based on 16S rDNA sequences
technique, the bacterium V-29 was identified as Burkholderia spp. In addition, pot experiments were carried out
to investigate the effects of phosphate-solubilizing bacteria and its fertilizer (BIO) on vanilla plant growth. The
results indicated that the application of BIO could significantly promote root and shoot growth of vanilla; Meanwhile,
inoculation of phosphate-solubilizing bacteria also could promote the growth of vanilla plants, which compared with
the control treatment, but there was no significant difference between each other; However, the contents of soil available
P and total P in plants all increased by the application of BIO and the inoculation of phosphate-solubilizing bacteria.
Key words Vanilla (Vanilla planifolia Ames.); Phosphate-solubilizing bacteria; Bio-organic fertilizer; Burkholderia spp.
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.04.003
第 4 期 王 辉等： 解磷细菌筛选鉴定及其在香草兰上的应用效果研究
态 P 缺乏最严重， 且各养分之间比例严重失衡。
香草兰是典型的喜磷作物， 高产园植株体内磷含量
显著高于低产园。
磷是作物生长必不可少的矿质营养元素之一[2]，
但土壤中大部分磷以闭蓄态或固定态存在， 作物吸
收利用率极低 [3]。 解磷细菌可将土壤中固定态矿质
磷转化成为可被作物吸收利用的有效磷， 减少化学
磷肥施用量 [4-5]。 朱培淼等 [5]从石灰性土壤中分离筛
选到可解磷的高效菌株， 土壤接种该菌株可促进苗
期玉米生长。 Hameeda 等[6]从堆肥中筛选出 5 株解
磷细菌， 盆栽及大田试验均表明， 接种这些解磷细
菌可以提高玉米生物量。
本试验采用改良的 NBRIP磷酸盐生长培养基从
长势良好的香草兰种植园中分离筛选解磷细菌， 并
对其进行 16S rDNA分子鉴定。 通过盆栽试验研究解
磷细菌及其经固体发酵制得的微生物有机肥料在香
草兰上的应用效果， 旨在为利用有益微生物提高土壤
中磷的有效性、 减少化学磷肥施用量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试土壤样品及培养基
土壤样品采自连作香草兰园中长势良好的植株
根际土壤， 带回实验室 4℃冰箱保存备用。
分离筛选培养基采用国际植物研究所磷酸盐生
长培养基（NBRIP）[7]： 葡萄糖 10 g， 磷酸铝 3 g， 氯
化镁 5 g， 硫酸镁 5 g， 氯化钾 0.2 g， 硫酸铵 0.1 g，
蒸馏水 1 000 mL， pH7.0， 115 ℃高压蒸汽灭菌
30 min， 备用。
LB 液体培养基： 酵母膏 5 g， 蛋白胨 10 g， 氯
化钠 5 g， 蒸馏水 1 000 mL， pH7.0， 121 ℃高压蒸
汽灭菌 20 min， 备用。
1.2 方法
1.2.1 解磷细菌分离筛选 称取 5 g 香草兰根际
土壤， 放入 250 mL 装有 45 mL无菌水的三角瓶中，
置于 28 ℃摇床中震荡 30 min。 上清土壤悬浊液依
次稀释至 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7， 选取
10-5、 10-6、 10-7 浓度梯度 ， 各取 0.1 mL 涂布至
NBRIP 选择性培养皿上， 每个浓度重复 3 皿， 置
28℃培养箱中培养 5 d。 挑取有透明水解圈的菌落
连续纯化 5 次以上， 选择仍然有透明水解圈的单菌
落 4℃冰箱保存备用。
1.2.2 解磷细菌溶磷能力测定 将筛选到的解磷
细菌接种至 NBRIP 液体培养基中 170 r/min， 28 ℃
摇床震荡培养 3 d， 菌液 8 000 ×g 离心 15 min， 取
上清液测定 pH， 适当稀释后， 用钼锑抗比色法[8]测
定上清液中的可溶性磷。
1.2.3 解磷细菌的 16S rDNA分子鉴定 菌体基因
组 DNA的提取参照文献[9]的方法。 细菌 16S rDNA
的 PCR 扩增采用通用引物： 正向引物（对应于 E.
coli 的 16S rDNA 5′ 端 8 -27f 位 置 ） ： 5′ -
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 反向引物(对应于
E. coli 的 16S rDNA 5′端 1523-1540r 位置 )： 5′-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR 反应体系为 ： DNA 模板 1 μL， dNTPs
Mixture（2.5 mmol/L）4 μL， 引物（1 mmol/L）各 1 μL，
10×Buffer(缓冲液 )2.5 μL， Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，
加超纯水（ddwater）至 25 μL。 PCR反应条件： 94℃
预变性 5 min， 进入热循环， 94 ℃变性 30 s， 55 ℃
退火 35 s， 72℃延伸 1 min， 35个循环， 延伸 8 min。
PCR 产物经试剂盒纯化后测序。 将测序所得基因
序列在 RDP 数据库中进行对比分析， 选取同源性
高的相关序列采用 MEGA 4.1 软件进行比对分析，
用邻接法构建进化树。
1.2.4 盆栽试验 将解磷菌株接种至 LB液体培养
基中， 摇床培养 48 h， 10 000 ×g 离心菌体 10 min，
倒掉上清液， 菌体用无菌水悬浮。 按照 10％（V/m）
的比例接种至牛粪有机肥中， 搅拌均匀， 用水调节
肥料含水量至 40％～45％， 置于温室发酵 5 d， 每
天翻动肥料 1次， 即为微生物有机肥料。
供试土壤为砂壤土， 养分含量为全氮 0.58 g/kg，
速效磷 7.10 mg/kg， 速效钾 94.08 mg/kg， 有机质
12.67 g/kg。 供试牛粪有机肥养分含量为全氮 0.8％，
全磷 0.6％， 全钾 0.2％， 有机质 19.4％。 试验盆钵
采用周转箱（内尺寸 600 mm×420 mm×165 mm）， 每
盆装土 10 kg。 选取长势一致的健康香草兰作为供
试苗。
试验设 4个处理： （1）对照 （CK， 施用尿素 5.2 g，
磷酸二氢钾 3.4 g）； （2）施用牛粪有机肥 （COM，
300 g/盆）； （3）施用解磷菌株菌悬液； （4）施用微生
物有机肥（BIO， 300 g/盆）。 每盆栽种 1 株香草兰，
每处理重复 4 次， 3 次独立试验， 共 48 盆。 该盆
栽试验于 2014年 4～8月在温室内进行。
香草兰移栽 4个月后毁灭性采样。 采用抖土法
收集根际土， 风干过筛。 植株茎蔓和根系分别置烘
箱 105 ℃杀青 30 min， 75 ℃烘干至恒重， 称量干
重。 土壤及植株样品分别用 H2SO4-H2O2 消煮， 钼
锑抗比色法测定磷含量。
1.3 数据分析
数据均采用 SPSS软件（SPSS 16.0）进行 ANOVA
方差分析和多重比较（LSD， p<0.05）。
661- -
第 37 卷热 带 作 物 学 报
表2 解磷细菌在液体NBRIP培养基中的解磷量
Table 2 P-solubilizing abilities of PSBs in NBRIP
liquid medium
菌株 可溶性磷浓度/（μg/mL） 培养液pH
CK （43.7±3.1）f （6.84±0.09）a
V-19 （231.1±34.9）e （5.32±0.19）b
V-29 （475.3±32.4）a （5.43±0.25）b
V-39 （418.8±49.2）b （4.67±0.22）c
V-49 （379.6±27.4）c （5.21±0.14）b
V-59 （407.3±38.2）bc （4.75±0.28）c
V-69 （283.5±32.7）d （4.91±0.10）c
表1 解磷细菌的平板筛选结果
Table 1 Phosphate-solubilizing bacteria (PSB) isolated
by NBRIP selective plates
菌株 透明圈直径/mm 透明圈直径/菌落直径
V-19 8.7 1.4
V-29 10.2 2.8
V-39 9.1 2.3
V-49 6.4 1.7
V-59 6.5 2.0
V-69 9.8 1.9
2 结果与分析
2.1 解磷细菌的平板筛选结果
根据在 NBRIP 溶磷培养基上的透明圈， 初筛
出 6株解磷细菌。 表 1为透明圈直径及透明圈直径
与菌落直径之比。 从表 1可知， 不同菌株透明圈直
径和透明圈直径与菌落直径之比不同， 其中菌株
V-29 透明圈直径最大， 为 10.2 mm， 透明圈直径
与菌落直径比值为 2.8。 图 1为菌株 V-29在 NBRIP
选择性培养基上的溶磷效果。
图1 菌株V-29在改良NBRIP培养基上的溶磷效果
Fig. 1 Phosphorus solubilizing effects of strain V-29 on
modified NBRIP plates
图2 菌株V-29的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain V-29
2.2 解磷细菌的摇瓶复筛结果
表 2结果显示， 不同菌株对 AlPO4的溶解量各
异， 接种菌株 V-29 的 NBRIP 培养液中可溶性磷
含量最高， 达到 475.3 μg/mL。 从培养液的酸碱度
看， 接种不同菌株的培养液均比对照有不同程度的
降低， 下降幅度 1.41～2.09个 pH。
2.3 解磷细菌的 16S rDNA分子鉴定结果
16S rDNA 序列分析结果表明： 菌株 V-29 与
伯克霍尔德氏菌 S000428831 的同源性在 99％以上
（图2）， 初步鉴定菌株 V-29 为伯克霍尔德氏菌。
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第 4 期 王 辉等： 解磷细菌筛选鉴定及其在香草兰上的应用效果研究
表3 不同处理对土壤有效磷与香草兰植株全磷的影响
Table 3 Effect of different treatments on concentrations
of available phosphorous (P) in soils and total
P in vanilla plants
处理 根际土壤有效磷/（mg/kg） 植株全磷量/（mg/kg）
CK （21.23±1.70）c （3.42±0.15）d
COM （24.53±1.97）ab （4.20±0.24）b
V-29 （22.96±2.01）b （3.87±0.31）c
BIO （26.37±2.64）a （4.83±0.39）a
CK为对照； COM为牛粪有机肥处理； V-29为伯克霍尔德氏菌
V-29菌悬液处理； BIO为微生物有机肥BIO处理。 图中数据为3次独
立试验的平均值±标准偏差， 不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
CK: control; COM: application of organic fertilizer; V -29:
inoculation of Burkholderia spp V-29; BIO: application of bio-organic
fertilizer. Data were expressed as mean ± standard deviation(n=3). Bars
with different letters indicate significant differences(p<0.05).
图3 不同处理对香草兰植株地上部及根系干重的影响
Fig. 3 Effects of different treatments on dry weights of
vanilla shoot and root
处理
3
2
1
0
生
物
量
/g
CK OF V-29 BlO
茎蔓干重
根系干重
c
c
b
b
bc
a
bc
a
GenBank 登录号为 KF137574。 菌种保藏在中国微
生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号
为 CGMCC No.7980。
2.4 解磷细菌对香草兰苗期生长的影响
由图 3 可知， 施用微生物有机肥的处理（BIO）
香草兰地上部干重显著高于其它处理， 与对照（CK）
相比， 提高了 95.8％。 施用牛粪有机肥的处理（COM）
和接种解磷菌 V-29的处理（V-29）地上部干重差异
不显著 ， 但均显著高于 CK， 分别比 CK 增加了
63.1％和 31.6％。 BIO 处理香草兰根系干重显著高
于 COM 及 V-29 处理， 分别增加 24.2％和 43.0％。
处理 V-29 与 COM 之间差异不显著。 由此可见，
施用解磷菌 V-29 及 BIO 均可促进香草兰地上部及
根系生长， 且 BIO 促生效果较好。
2.5 施用解磷细菌对香草兰植株全磷及根际土壤
有效磷的影响
从表 3 可得出， 施用微生物有机肥 BIO、 牛粪
有机肥 COM 及接种 V-29 菌液的处理根际土壤有
效磷含量与对照相比， 分别增加了 24.2％、 15.5％
和 8.1％， 均显著高于对照。 接种 V-29 菌液的处
理根际土壤有效磷含量显著低于施用微生物有机肥
BIO 的处理， 但与牛粪有机肥处理差异不显著。 不
同处理之间香草兰植株全磷量差异显著， 其中， 接
种 V-29 菌液的处理植株全磷量显著高于对照， 但
显著低于施用牛粪有机肥及微生物有机肥的处理。
3 讨论与结论
解磷菌是指能够将土壤中难以被作物吸收利用
的磷转化为可吸收利用形态磷的一类微生物。 在碱
性土壤中， 磷主要转化为难于被作物吸收的 Ca-P，
酸性土壤中主要转化为 Al-P 和 Fe-P[10]。 香草兰为
热带和亚热带作物， 在我国主要分布在海南、 云南
和广东等地区， 这些地区的土壤大部分均为酸性土
壤， 故将 NBRIP培养基中的 Ca3(PO4)2替换为 AlPO4，
以便于从酸性土壤中筛选解磷细菌。
本文从长势良好的香草兰种植园中初步分离筛
选到 6 株解磷细菌， 不同菌株在 NBRIP 培养基上
产生的透明圈大小不同， 解磷圈直径在 6.4～9.8 mm
之间， 溶磷圈直径与菌落直径之比在 1.4～2.8 之
间， 其中， 菌株 V-29 解磷圈直径、 解磷圈直径与
菌落直径之比均最大， 分别为 10.2 mm 和 2.8。 摇
瓶试验结果表明： 在 NBRIP 液体培养基中震荡培
养 3 d 后， 各菌株培养液可溶性磷含量和 pH 均不
同， 菌株 V-29 解磷能力显著高于其它菌株。 菌株
V-69 解溶磷圈为 9.8 mm， 而摇瓶试验中解磷量仅
为 283.5 μg/mL， 这表明解磷圈直径可定性反映菌
株的解磷能力， 定量评价则需要摇瓶试验确定。 这
一结论与朱培淼等 [5]研究结果相似。 朱培淼等 [5]从
石灰性土壤中筛选到 44 株解磷菌株， 结果表明菌
株 K4和 K9在培养皿中的透明圈直径与摇瓶试验中
培养液的全磷浓度呈相反的趋势。
有报道指出， Pseudomonas， Bacillus， Rhizobium，
Agrobacterium， Burkholderia 和 Erwinia 等具有较强
的溶磷作用 [11-12]。 Shahid 等 [12]研究表明， 土壤接种
Enterobacter sp Fs-11 可显著增加向日葵生物量。
Mamta 等[13]指出土壤单一接种 Enterobacter aerogenes
10208、 Burkholderia gladioli 10217、 Serratia marcescens
10238 或混合接种这几株解磷菌均可促进甜菊生
长， 并增加甜菊苷含量。 经 16S rDNA分子鉴定， 菌
株 V-29 为 Burkholderia stabilis。 盆栽试验结果表
明： 土壤接种菌株 V-29 或施用由 V-29 与牛粪有
机肥经固体发酵制得的微生物有机肥均可增加香草
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第 37 卷热 带 作 物 学 报
责任编辑： 叶庆亮
兰植株地上部及根系干重， 促进香草兰生长， 这说
明解磷菌株 V-29 可溶解土壤中难溶性磷， 提高磷
的生物有效性， 利于香草兰对磷素的吸收利用， 也
说明牛粪有机肥可以作为解磷细菌 V-29 的有机载
体， 使其充分发挥解磷菌的有益作用。 解磷菌株的
促生作用在玉米等作物上也得到证实。 假单胞菌株
K3和 K9接种至有机肥施入土壤后可增加玉米地上
部磷的累积量， 干物重显著高于单独接种菌液及对
照的处理 [5]。 Pereira 等 [14]指出， 在磷素缺乏的土壤
中接种 Rhodococcus sp. B1， Pseudomonas sp. B2
和 Arthrobacter nicotinovorans B3 均可提高土壤中
磷的有效性， 显著促进玉米生长。 Zhao 等[15]研究显
示， 土壤接种根际促生菌 Bacillus subtilis Y-IVI
可促进甜瓜生长， 主要是因为菌株 Y-IVI 可稳定
定殖于甜瓜植株根际土壤， 产生促生类活性物质吲
哚乙酸和铁载体等。 菌株 V-29 是否可产生促生类
活性物质？ 这些物质的促生贡献如何？ 均需后续进
一步研究。
本研究从酸性土壤中筛选到了可降解 Al-P 形
态的解磷菌 V-29， 并通过稀释平板法及摇瓶试验
检测了该解磷细菌的溶磷能力， 并采用盆栽试验进
一步研究了解磷菌株 V-29 及其微生物肥料对香草
兰的促生作用。 为生产上应用土壤微生物的有益功
能， 减少化学磷肥施用量， 解决香草兰磷素缺乏问
题提供了理论依据， 并对解决我国热区其它经济作
物磷素缺乏问题具有一定的借鉴意义。 下一步拟从
解磷菌株产生的有机酸类物质、 促生类活性物质、
利用碳、 氮源的能力以及在土壤中的定殖能力等方
面揭示解磷菌的解磷和促生作用机制。
参考文献
[1] 王 华， 朱自慧， 杨建峰， 等. 海岸省香草兰种植园土壤养分
状况调查[J]. 中国农学通报， 2009， 25（11）： 220-223.
[2] Sharma S B， Sayyed R Z， Trivedi M H， et al. Phosphate solubilizing
microbes： sustainable approach for managing phosphorus deficiency
in agricultural soils[J]. Springer Plus， 2013， 2： 587.
[3] Rodríguez H， Fraga R. Phosphate solubilizing bacteria and their
role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advance， 1999，
17： 319-339.
[4] Pereira I A Sofia， Castro M L Paula. Phosphate-solubilizing
rhizobacteria enhance Zea mays growth in agricultural P-deficient
soils[J]. Ecological Engineering， 2014， 73： 526-535.
[5] 朱培淼， 杨兴明， 徐阳春， 等. 高效解磷细菌的筛选及其对玉
米苗期生长的促进作用[J]. 应用生态学报， 2007， 18： 107-112.
[6] Hameedaa B， Harini G， Rupelab O P， et al. Growth promotion
of maize by phosphate-solubilizing bacteria isolated from composts
and macrofauna[J]. Microbiological Research， 2008， 163： 234-242.
[7] Nautiyal C S. An efficient microbiological growth medium for
screening phosphate solubilizing microorganisms [J] . FEMS
Microbiology Letters， 1999， 170： 265-270.
[8] 鲁如坤 土壤农业化学分析方法（第 1 版）[M]. 北京： 中国农业
科技出版社， 2000： 180-181.
[9] Kataoka M， Ueda K， Kudo T. Application of the variable region
in 16S rDNA to create an index for rapid species identification
in the genus Streptomyces[J]. FEMS Microbiology Letters， 1997，
151： 249-255.
[10] Mahdi S S， Hassan G I， Hussain A， et al. Phosphorus availability
issue-its fixation and role of phosphate solubilizing bacteria in
phosphate solubilization[J]. Research Journal of Agricultual Science，
2011， 2： 174-179.
[11] Liu F P， Liu H Q， Zhou H L， et al. Isolation and characterization
of phosphate-solubilizing bacteria from betel nut(Areca catechu)
and their effects on plant growth and phosphorus mobilization
in tropical soils[J]. Biology and Fertility of Soils 2014， 50：
927-937.
[12] Shahid M， Hameed S， Imran A， et al. Root colonization and
growth promotion of sunflower(Helianthus annuus L.)by phosphate
solubilizing Enterobacter sp. Fs-11[J]. World Journal of Microbiology
and Biotechnology， 2012， 28： 2 749-2 758.
[13] Mamta， Praveen R， Vijaylata P， et al. Stimulatory effect of
phosphate-solubilizing bacteria on plant growth， stevioside and
rebaudioside-A contents of Stevia rebaudiana Bertoni[J]. Applied
Soil Ecology， 2010， 46： 222-229.
[14] Sofia I A Pereira， Paula M L Castro. Phosphate-solubilizing
rhizobacteria enhance Zea mays growth in agricultural P-deficient
soils[J]. Ecological Engineering， 2014， 73： 526-535.
[15] Zhao Q Y， Shen Q R， Ran W， et al. Inoculation of soil by
Bacillus subtilis Y-IVI improves plant growth and colonization
of the rhizosphere and interior tissues of muskmelon (Cucumis
melo L.)[J]. Biology and Fertility of Soils， 2011， 47： 507-514.
664- -