采用营养液培养方法,研究外源NO对铜胁迫下番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)幼苗根系抗坏血酸(AsA)-谷胱甘肽(GSH)循环中抗氧化物质和抗氧化酶系的影响.结果表明:外施适量NO(硝普钠)可提高铜胁迫下番茄幼苗根系AsA、GSH含量和AsA/DHA(氧化型抗坏血酸)、GSH/GSSG(氧化型谷胱甘肽),降低DHA和GSSG含量.添加100 μmol·L-1 BSO(谷胱甘肽合成酶抑制剂)处理下,外源NO可提高铜胁迫下番茄幼苗根系的AsA含量、AsA/DHA及抗坏血酸酶(AAO)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)比活性,降低DHA、GSH、GSSG含量及抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)比活性;添加250 μmol·L-1 BSO处理下,外源NO提高了铜胁迫下番茄幼苗根系的AsA、GSH、GSSG含量、AsA/DHA及APX和GR比活性,降低了DHA含量及AAO、DHAR和MDHAR比活性.说明外源NO影响了铜胁迫下番茄根系的AsA-GSH代谢循环,并通过调节AsA/DHA、GSH/GSSG的变化来减轻氧化胁迫,从而缓解铜胁迫对番茄根系的伤害.
By using solution culture method, this paper studied the effects of exogenous nitric oxide (NO) on the antioxidants and antioxidases in the ascorbateglutathione (AsA-GSH) cycle in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seedling roots under copper stress. Exogenous NO could affect the metabolic cycle of AsA-GSH in tomato roots under copper stress. Applying appropriate amount of exogenous NO increased the AsA and GSH contents, AsA/DHA and GSH/GSSG ratios, and decreased the DHA and GSSG contents in tomato roots under copper stress. With the addition of 100 μmol·L-1 of BSO, exogenous NO increased the AsA content, AsA/DHA ratio, and the AAO, MDHAR, and DHAR activities, and decreased the DHA, GSH, and GSSG contents and the APX and GR activities. When 250 μmol·L-1 of BSO was added, exogenous NO increased the contents of AsA, GSH, and GSSG, AsA/DHA ratio, and the activities of APX and GR, and decreased the DHA content and the AAO, DHAR and MDHAR activities. It was suggested that exogenous NO could affect the metabolic cycle of AsA-GSH in tomato roots under copper stress, and mitigate the damage of copper stress to tomato roots via regulating the AsA/DHA and GSH/GSSG ratios to alleviate oxidative stress.
全 文 :外源 NO对铜胁迫下番茄幼苗根系抗坏血酸鄄
谷胱甘肽循环的影响*
李晓云1 摇 王秀峰2 摇 吕乐福1 摇 尹摇 博1 摇 张摇 敏1 摇 崔秀敏1**
( 1山东农业大学资源与环境学院, 山东泰安 271018; 2山东农业大学作物生物学国家重点实验室 /农业部黄淮地区园艺作物
生物学与种质创制重点实验室, 山东泰安 271018)
摘摇 要摇 采用营养液培养方法,研究外源 NO 对铜胁迫下番茄(Lycopersicon esculentum Mill. )
幼苗根系抗坏血酸(AsA) 鄄谷胱甘肽(GSH)循环中抗氧化物质和抗氧化酶系的影响. 结果表
明:外施适量 NO(硝普钠)可提高铜胁迫下番茄幼苗根系 AsA、GSH含量和 AsA / DHA(氧化型
抗坏血酸)、GSH / GSSG(氧化型谷胱甘肽),降低 DHA和 GSSG含量.添加 100 滋mol·L-1 BSO
(谷胱甘肽合成酶抑制剂)处理下,外源 NO可提高铜胁迫下番茄幼苗根系的 AsA 含量、AsA /
DHA及抗坏血酸酶 (AAO)、单脱氢抗坏血酸还原酶 (MDHAR)和脱氢抗坏血酸还原酶
(DHAR)比活性,降低 DHA、GSH、GSSG含量及抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶
(GR)比活性;添加 250 滋mol·L-1 BSO 处理下,外源 NO 提高了铜胁迫下番茄幼苗根系的
AsA、GSH、GSSG含量、AsA / DHA及 APX 和 GR 比活性,降低了 DHA 含量及 AAO、DHAR 和
MDHAR比活性.说明外源 NO 影响了铜胁迫下番茄根系的 AsA鄄GSH 代谢循环,并通过调节
AsA / DHA、GSH / GSSG的变化来减轻氧化胁迫,从而缓解铜胁迫对番茄根系的伤害.
关键词摇 一氧化氮摇 番茄摇 铜胁迫摇 抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环
文章编号摇 1001-9332(2013)04-1023-08摇 中图分类号摇 S152. 7摇 文献标识码摇 A
Effects of exogenous nitric oxide on ascorbate鄄glutathione cycle in tomato seedlings roots un鄄
der copper stress. LI Xiao鄄yun1, WANG Xiu鄄feng2, L譈 Le鄄fu1, YIN Bo1, ZHANG Min1, CUI
Xiu鄄min1 ( 1 College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, Tai爷 an
271018, Shandong, China; 2State Key Laboratory of Crop Biology / Ministry of Agriculture Key Labo鄄
ratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in Huanghuai Region, Shandong
Agricultural University, Tai爷an 271018, Shandong, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2013,24(4):
1023-1030.
Abstract: By using solution culture method, this paper studied the effects of exogenous nitric oxide
(NO) on the antioxidants and antioxidases in the ascorbate鄄glutathione (AsA鄄GSH) cycle in tomato
(Lycopersicon esculentum Mill. ) seedling roots under copper stress. Exogenous NO could affect the
metabolic cycle of AsA鄄GSH in tomato roots under copper stress. Applying appropriate amount of
exogenous NO increased the AsA and GSH contents, AsA / DHA and GSH / GSSG ratios, and de鄄
creased the DHA and GSSG contents in tomato roots under copper stress. With the addition of 100
滋mol·L-1 of BSO, exogenous NO increased the AsA content, AsA / DHA ratio, and the AAO,
MDHAR, and DHAR activities, and decreased the DHA, GSH, and GSSG contents and the APX
and GR activities. When 250 滋mol·L-1 of BSO was added, exogenous NO increased the contents
of AsA, GSH, and GSSG, AsA / DHA ratio, and the activities of APX and GR, and decreased the
DHA content and the AAO, DHAR and MDHAR activities. It was suggested that exogenous NO
could affect the metabolic cycle of AsA鄄GSH in tomato roots under copper stress, and mitigate the
damage of copper stress to tomato roots via regulating the AsA / DHA and GSH / GSSG ratios to alle鄄
viate oxidative stress.
Key words: nitric oxide; tomato; copper stress; ascorbate鄄glutathione cycle.
*国家自然科学基金项目(31201619)、泰安市科技发展计划项目(32606)和现代农业技术体系建设专项基金(CAR鄄25鄄D)资助.
**通讯作者. E鄄mail: xiumincui@ sdau. edu. cn
2012鄄08鄄07 收稿,2013鄄01鄄28 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 4 月摇 第 24 卷摇 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Apr. 2013,24(4): 1023-1030
摇 摇 铜是植物正常生命活动所必需的微量矿质元
素,广泛参与各种生命活动. 但植物对铜的需求很
低,稍过量就会对植物造成伤害,大部分作物以土壤
有效铜含量低于 5 mg·kg-1为缺乏临界值. 铜过量
会导致一系列生物代谢过程的紊乱,并最终抑制植
物生长而致作物减产[1] .
铜等重金属胁迫能够导致大量活性氧(ROS)产
生,抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环是酶促催化系统,在植
物抵抗胁迫、清除逆境 ROS 积累方面具有重要作
用.抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环代谢在干旱[2]、高温[3]、
低温[4]、NaCl胁迫[5]及镉胁迫[6]等方面的研究已有
报道.有研究表明,外源 NO能够提高铜胁迫下番茄
植株的抗氧化能力和重金属耐性[7],主要是由于适
当浓度的 NO 能有效提高酶促系统中的酶比活性,
如过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化
物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)比活
性,缓解重金属引起的氧化伤害[8],但是外源 NO对
铜胁迫下番茄幼苗根系 AsA鄄GSH 循环代谢的影响
尚未见报道. 本试验采用 NO 产生剂硝普钠(SNP)
及谷胱甘肽合成酶抑制剂(BSO)处理铜胁迫下番茄
幼苗,探讨外源 NO 对铜胁迫下番茄幼苗根系 AsA鄄
GSH循环中的抗氧化物质及相关酶比活性的影响,
以期为外源 NO提高铜胁迫下植株耐性或抗性机制
提供理论依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料与试验设计
供试番茄品种为“改良毛粉 802F1冶.
试验于 2011 年 9 月在山东农业大学温室内进
行,用 Hoagland营养液培养幼苗.种子经 55 益温汤
浸种消毒 15 min,然后在润湿的吸水纸上 26 益催
芽,待种子露白后,播于洗净的蛭石中.萌发后用1 / 4
Hoagland营养液浇灌,当幼苗长至 3 ~ 4 片真叶时,
挑选生长一致的植株洗净根部蛭石后,移栽于2郾 5 L
塑料盒中,用厚度为 3 cm的泡沫塑料板做成长方形
盖子,覆盖在塑料桶顶部.每盆栽 5 株,用1 / 2 Hoag鄄
land营养液进行栽培,1 周后换成完全营养液,此后
每 3 d更换 1 次营养液. 营养液栽培期间用电动气
泵 24 h连续通气.
当番茄植株长至 5 ~ 6 片真叶时进行铜胁迫处
理.胁迫处理前分别向营养液中加入 CuCl2、硝普钠
(SNP,NO 产生剂)和 BSO(谷胱甘肽合成酶抑制
剂,购自 Sigma公司).试验设 7 个处理:1)完全营养
液(CK);2)50 滋mol·L-1 CuCl2,铜胁迫处理(CK+
Cu);3)50 滋mol·L-1 CuCl2 +100 滋mol·L-1 SNP,
NO缓解处理(Cu+SNP);4) 50 滋mol·L-1 CuCl2 +
100 滋mol · L-1 BSO ( Cu + B1 ); 5 ) 50 滋mol · L-1
CuCl2+100 滋mol · L-1 BSO + 100 滋mol · L-1 SNP
( Cu+B1 + SNP ); 6 ) 50 滋mol · L-1 CuCl2 + 250
滋mol·L-1 BSO(Cu+B2 );7) 50 滋mol·L-1 CuCl2 +
250 滋mol·L-1 BSO+100 滋mol·L-1 SNP(Cu+B2 +
SNP).每个处理 3 次重复,温室内随机排列.用低浓
度的 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 5郾 5 依0郾 2,处理 8 d
后,分别收获植株不同部位,液氮速冻,置于-80 益
备测.
1郾 2摇 测定项目与方法
1郾 2郾 1 还原型抗坏血酸(AsA)和氧化型抗坏血酸
(DHA)含量测定 摇 AsA 和 DHA 含量测定参考 Ka鄄
mpfenkel等[9]的 Fe3+还原法.称取 1 g 植株样品,加
6%三氯乙酸(TCA,w / v)于 4 益研磨成浆,定容至
6 mL,16000伊g、2 益离心 10 min,收集上清液. 测定
AsA的 4 mL反应体系中含:0郾 8 mL 0郾 2 mol·L-1磷
酸缓冲液( PBS,pH 7郾 4)、0郾 2 mL 提取液、1郾 0 mL
10% TCA、0郾 8 mL 42%磷酸(H3 PO4)、0郾 8 mL 2%
2,2忆鄄双吡啶、0郾 4 mL 3%三氯化铁.混匀后 42 益水
浴 60 min,测 525 nm处的吸光值. 测定总抗坏血酸
的方法与 AsA的不同之处是:在加 10% TCA 之前,
先加 0郾 2 mL 6 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT),混匀
后 42 益水浴 15 min,再加 0郾 2 mL 0郾 4% N鄄乙基马
来酰亚胺(NEM),混匀室温放置 2 min.用同样方法
制作标准曲线,计算总抗坏血酸和 AsA 含量. DHA
为总抗坏血酸和 AsA的差值.
1郾 2郾 2 谷胱甘肽(GSH)含量测定 摇 根据 Hissin 和
Hilf[10]的方法用荧光法测定 GSH 含量. 将 1 g 根系
样品,加入 4郾 5 mL 0郾 1 mol·L-1 PBs(pH 5郾 0,含 5
mmol·L-1 EDTA),0郾 4 mL 25%偏磷酸(HPO3)冰浴
研磨,4 益、12000伊g 离心 30 min,取上清液用于分
析 GSH 和 GSSG(氧化型谷胱甘肽). GSH 测定:取
上清液 0郾 5 mL,加入 2郾 5 mL 0郾 1 mol·L-1 PBS(pH
8郾 0,含 5 mmol·L-1 EDTA)、0郾 1% 邻苯二甲醛,
30 益反应 15 min,用荧光光度计(发射波长420 nm,
激发波长 350 nm) 测定. GSSG 测定:取上清液
0郾 5 mL,加入 200 滋L NEM,室温下保持 30 min,使
GSH和 NEM结合,然后加入 2郾 3 mL 0郾 1 mol·L-1
NaOH溶液,混匀,以后步骤与测定 GSH相同.
1郾 2郾 3 酶比活性测定摇 粗酶液提取方法:称取 1 g 植
株样品,加 6 mL 50 mmol·L-1(含 2 mmol·L-1ED鄄
4201 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
TA、2 mmol·L-1DTT、20%甘油、2% PVP)磷酸缓冲
液(pH 7郾 2),于 4 益研磨,然后于 4 益下 10000伊g
离心 30 min.上层清液即为酶粗液,用于抗坏血酸酶
(AAO)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏
血酸还原酶 ( MDHAR)、抗坏血酸过氧化物酶
(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)比活性测定.
AAO比活性参照 Shen 等[11]的方法测定. 取
0郾 1 mL 酶粗液,加入 2郾 5 mL 50 mmol· L-1 (含
1 mmol·L-1 AsA和 0郾 5 mmol·L-1EDTA)磷酸缓冲
液(pH 5郾 6).反应液加入酶粗液后在 265 nm 处测
定吸光度的变化.
MDHAR和 DHAR比活性参考 Ma 和 Cheng[12]
的方法测定.测定 MDHAR比活性的 3 mL反应体系
含: 50 mmol · L-1 Hepes鄄KOH ( pH 7郾 6 )、 0郾 1
mmol·L-1 NADH、0郾 25 mmol·L-1 AsA、0郾 3 units抗
坏血酸氧化酶(AO)及 0郾 1 mL酶液,测定 340 nm处
吸光值的变化. 测定 DHAR 比活性的 3 mL 反应体
系含: 100 mmol · L-1 Hepes鄄KOH ( pH 7郾 0 )、 2郾 5
mmol·L-1 GSH、0郾 2 mmol·L-1 DHA 及 0郾 1 mL 酶
液,测定 265 nm处吸光值的变化.
GR比活性参考 Ma 和 Cheng[12]的方法测定.
3 mL的反应体系含: 0郾 1 mol · L-1 Tris鄄HCl ( pH
8郾 0)、1 mmol·L-1 GSSG、0郾 2 mmol·L-1 NADPH 及
0郾 1 mL酶液,测定 340 nm处吸光值的变化.
APX比活性测定参照孔祥生等[13]的方法. 3 mL
的反应体系含: 50 mmol · L-1 Hepes鄄KOH ( pH
7郾 6)、1郾 0 mmol·L-1 H2 O2、0郾 5 mmol·L-1 AsA 及
0郾 05 mL酶提取液,测定 290 nm处吸光值的变化.
可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝 G鄄250 染
色法[13] . AAO、DHAR、MDHAR、APX和 GR为每毫克
蛋白酶比活性.各个指标测定均重复 3次,取平均值.
1郾 3摇 数据处理
采用 Microsoft Excel软件对数据进行处理及绘
图,并用 SAS 软件进行数据统计分析,采用最小显
著差异法(LSD)进行多重比较和差异显著性分析
(琢=0郾 05).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 外源 NO 对铜胁迫下番茄根系 GSH鄄AsA 循环
抗氧化物质的影响
2郾 1郾 1 AsA和 DHA 含量摇 在抗氧化系统中,抗坏血
酸作为一种小分子抗氧化剂,一方面可以直接清除
植物体内因氧化代谢、光合作用及环境胁迫等产生
的 ROS;另一方面可以通过抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环
(AsA鄄GSH)清除 H2O2,从而降低氧化胁迫对植物有
机体及其正常代谢的伤害.从图 1 可知,Cu 处理下,
番茄根系 AsA 含量比 CK 降低 55郾 4% ,差异显著.
Cu+SNP 处理番茄根系 AsA 含量比 Cu 处理增加
8郾 7 倍,差异显著.与 Cu 处理相比,Cu+B1处理的番
茄根系 AsA含量增加 158% ,差异显著,而 Cu+B2处
图 1摇 外源 NO对铜胁迫下番茄根系 AsA、DHA、GSH和 GSSG含量的影响
Fig. 1摇 Effects of exogenous nitric oxide on AsA, DHA, GSH and GSSG contents of tomato roots under copper stress郾
不同字母表示处理间差异显著(P<0郾 05) Different letters meant significant difference among treatments at 0郾 05 level郾 下同 The same below郾
52014 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李晓云等: 外源 NO对铜胁迫下番茄幼苗根系抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环的影响摇 摇 摇
理的番茄根系 AsA含量仅增加 6郾 7% . Cu+B1+SNP、
Cu+B2 +SNP 处理的番茄根系 AsA 含量分别比 Cu+
B1、Cu+B2处理增加 61郾 4%和 330% ,差异均达到显
著水平.
Cu处理下,番茄根系 DHA 含量比 CK 增加 32
倍,差异达到极显著水平. 与 Cu 处理相比,Cu+SNP
处理下番茄根系 DHA含量降低 46郾 6% ,差异显著.
与 Cu处理相比,Cu+B1处理番茄根系 DHA 含量增
加 16郾 2% ;而 Cu+B2处理变化不显著. Cu+B1 +SNP、
Cu+B2+SNP处理的番茄根系 DHA 含量分别比 Cu+
B1、Cu+B2处理降低 47郾 7%和 16郾 0% (图 1). 说明
SNP能降低铜胁迫下番茄植株 DHA含量.
2郾 1郾 2 AsA / DHA摇 逆境条件下,植物体内 AsA 氧化
还原状态的改变对逆境的抗性有重要作用. 由图 2
可以看出,Cu+SNP、Cu+B1 +SNP、Cu+B2 +SNP 处理
番茄根系 AsA / DHA 分别比 Cu、Cu+B1、Cu+B2处理
提高 21 倍、2郾 3 倍和 7郾 3 倍. Cu 胁迫下番茄植株
AsA含量降低,DHA 含量和 AsA / DHA 升高;外源
NO提高了番茄植株 AsA含量,降低了 DHA 含量和
AsA / DHA,减轻了铜胁迫对番茄植株的伤害. 说明
NO参与番茄植株体内 AsA鄄GSH 循环中 AsA、DHA
含量的调节.
2郾 1郾 3 GSH和GSSG含量 摇 由图1可以看出 ,Cu处
图 2 摇 外源 NO 对铜胁迫下番茄根系 AsA / DHA 和 GSH /
GSSG的影响
Fig. 2 摇 Effects of exogenous nitric oxide on AsA / DHA and
GSH / GSSG ratios of tomato roots under copper stress郾
理下番茄根系 GSH含量比 CK 降低 20郾 5% ,差异达
到显著水平. Cu+SNP 处理下番茄根系 GSH 含量比
Cu处理升高 13郾 3% . 说明铜胁迫条件下,外源 NO
能够提高番茄植株 GSH含量.与 Cu 处理相比,Cu+
B1、Cu + B2处理的番茄根系 GSH 含量分别增加
53郾 2%和 30郾 9% ,差异均达显著水平. Cu+B1 +SNP
处理番茄根系 GSH含量比 Cu+B1处理降低 20郾 7% ,
而 Cu+B2+SNP处理番茄根系 GSH含量比 Cu+B2处
理增加 22郾 2% ,差异达显著水平. 与 Cu 处理相比,
Cu+B1和 Cu+B2处理番茄 GSH 含量均显著提高,可
见外源 SNP 使 GSH 含量继续上升,而高浓度 BSO
处理下上升更显著.
与 CK相比,Cu 处理下番茄根系 GSSG 含量变
化不明显. Cu+SNP 处理番茄根系 GSSG 含量比 Cu
处理增加 19郾 8% ,差异达到显著水平.与 Cu 处理相
比,Cu+B1和 Cu+B2处理下番茄根系 GSSG含量分别
增加 25郾 8%和 48郾 0% ,差异显著. Cu+B1 +SNP 处理
番茄根系 GSSG 含量比 Cu+B1处理降低 9郾 0% ,而
Cu+B2+SNP处理番茄根系 GSSG含量比 Cu+B2处理
增加 22郾 2% ,差异达显著水平(图 1).
2郾 1郾 4 GSH / GSSG摇 Cu 处理的番茄根系 GSH / GSSG
比 CK降低 23郾 9% ,差异显著. Cu+SNP 处理的番茄
根系 GSH / GSSG变化不明显. 与 Cu 处理相比,Cu+
B1处理的番茄根系 GSH / GSSG升高 25郾 0% ,而 Cu+
B2处理的番茄根系 GSH / GSSG 降低 7郾 9% . Cu+B1 +
SNP处理番茄根系 GSH / GSSG 比 Cu+B1处理降低
11郾 9% ,差异显著;而 Cu +B2 +SNP 处理番茄根系
GSH / GSSG 比 Cu +B2处理升高 20郾 7% ,差异显著
(图 2).
2郾 2摇 外源 NO 对铜胁迫下番茄根系 GSH鄄AsA 循环
酶系的影响
2郾 2郾 1 AAO比活性 摇 抗坏血酸氧化酶(AAO)主要
存在于植物细胞壁中,氧化 AsA 生成 MDHA,而后
MDHA经膜结合态 Cyt b 还原成 AsA[14-15] . 由图 3
可知,Cu处理的番茄根系 AAO 比活性比 CK 降低
54郾 4% ,差异达到显著水平. Cu+SNP 处理的番茄根
系 AAO 比活性比 Cu 处理提高 14郾 1% ,差异不显
著. Cu+B1处理的番茄根系 AAO 比活性比 Cu 处理
降低 54郾 0% ,差异显著;而 Cu+B2处理的番茄根系
AAO比活性比 Cu处理提高 11郾 6% . Cu+B1 +SNP 处
理的番茄根系 AAO 比活性比 Cu+B1处理提高 4郾 3
倍,差异显著;Cu+B2+SNP 处理的番茄根系 AAO 比
活性比 Cu+B2处理降低 10郾 5% .说明在添加低浓度
BSO处理下,外源NO可以提高铜胁迫下番茄根系
6201 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
图 3摇 外源 NO对铜胁迫下番茄根系 AAO、DHAR、MDHAR、
APX和 GR比活性的影响
Fig. 3 摇 Effects of exogenous nitric oxide on AAO, DHAR,
MDHAR, APX and GR activities of tomato roots under copper
stress郾
AAO比活性;而高浓度 BSO 处理下,外源 NO 起相
反作用.
2郾 2郾 2 DHAR 比活性 摇 脱氢抗坏血酸还原酶
(DHAR)以 GSH 作为还原剂将 DHA 还原为 AsA,
因而 DHAR 作为调控 AsA 氧化还原态的关键酶在
植物抗氧化及 AsA再生过程中具有重要作用,在胞
质和叶绿体中都有 DHAR 存在[16] . Cu 处理下番茄
根系 DHAR 比活性比 CK 提高 41郾 2% ,差异显著.
Cu+SNP处理下番茄根系 DHAR 比活性比 Cu 处理
升高 60郾 5% ,差异达到显著水平. 与 Cu 处理相比,
Cu+B1和 Cu+B2处理的番茄根系 DHAR比活性分别
增加 18郾 1%和 55郾 3% ,差异均达到显著水平. Cu+
B1+SNP处理的番茄根系 DHAR 比活性比 Cu+B1处
理升高 57郾 4% ,而 Cu +B2 + SNP 处理的番茄根系
DHAR比活性比 Cu+B2处理降低 34郾 0% ,差异均达
到显著水平(图 3).
2郾 2郾 3 MDHAR比活性 摇 AsA 作为电子供体被氧化
为 MDHA (单脱氢抗坏血酸 ),然后 MDHA 被
MDHAR还原为 AsA,因此 MDHAR 对 AsA 再生具
有重要作用. Cu处理下番茄根系 MDHAR 比活性比
CK升高 43郾 4% ,差异显著. Cu+SNP 处理番茄根系
MDHAR比活性比 Cu 处理降低 69郾 6% ,差异显著.
与 Cu处理相比,Cu +B1、Cu +B2处理下番茄根系
MDHAR比活性分别降低 18郾 5%和 45郾 9% ,差异均
达显著水平. Cu+B1 +SNP 处理下番茄根系 MDHAR
比活性比 Cu+B1处理降低 23郾 6% ,差异显著;Cu+
B2+SNP处理的番茄根系 MDHAR 比活性比 Cu+B2
处理降低 25郾 3% ,差异显著(图 3). 可见在添加低
浓度 BSO处理下,外源 NO 可以提高铜胁迫下番茄
根系 DHAR比活性,降低MDHAR比活性;而添加高
浓度 BSO处理,外源 NO则降低两种酶比活性.
2郾 2郾 4 APX比活性摇 与 CK 相比,Cu 处理的番茄根
系 APX比活性提高 55郾 0% ,差异显著. Cu+SNP 处
理的番茄根系 APX 比活性比 Cu 处理降低 31郾 1% ,
差异显著.与 Cu 处理相比,Cu+B1处理下番茄根系
APX比活性变化不明显,而 Cu+B2处理下 APX比活
性降低 37郾 9% ,差异显著. Cu+B1 +SNP 处理的番茄
根系 APX比活性比 Cu+B1处理降低 17郾 4% ;而 Cu+
B2+SNP处理的番茄根系 APX比活性比 Cu+B2处理
升高 42郾 7% ,差异显著(图 3). 铜胁迫能增加番茄
APX比活性;添加低浓度 BSO 处理,外源 NO 降低
铜胁迫下番茄 APX 比活性;添加高浓度 BSO 处理,
外源 NO增强铜胁迫下番茄 APX比活性;这与 AAO
比活性变化趋势相反.
2郾 2郾 5 GR 比活性 摇 GR 利用 NADPH 的电子将
GSSG还原为 GSH,从而使细胞内谷胱甘肽库保持
72014 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李晓云等: 外源 NO对铜胁迫下番茄幼苗根系抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环的影响摇 摇 摇
还原状态,在维持 AsA鄄GSH循环的有效运行及对氧
化胁迫的响应中具有重要作用[17] . 与 CK 相比,Cu
处理下番茄根系 GR比活性变化不显著. Cu+SNP处
理下番茄根系 GR比活性比 Cu处理降低 22郾 8% .与
Cu处理相比,Cu+B1和 Cu+B2处理下番茄根系 GR
比活性分别升高 26郾 7%和 38郾 3% . Cu+B1 +SNP 处
理的番茄根系 GR 比活性比 Cu + B1 处理降低
18郾 0% ;而 Cu+B2+SNP处理的番茄根系 GR 比活性
比 Cu+B2处理升高 32郾 5% ,差异显著(图 3).这说明
在低浓度 BSO处理下,外源 NO 能降低铜胁迫下番
茄根系 GR 比活性;而在高浓度 BSO 处理下,外源
NO可提高铜胁迫下番茄根系 GR比活性.
3摇 讨摇 摇 论
逆境条件下,植物体内 AsA 的氧化还原状态反
映了植物细胞内外环境的氧化还原状态,当遭遇逆
境胁迫时,AsA / DHA、相关代谢物和酶类会发生相
应变化[18] . 本研究表明,Cu、Cu+B1、Cu+B1 +SNP、
Cu+B2、Cu+B2 +SNP 处理中 DHA 含量高于 AsA 含
量,可能因为番茄根系在营养液中直接与 Cu2+接
触,AsA作为一种重要的抗氧化物质,清除活性氧,
被氧化为 DHA,这与 Anjum 等[19]的研究结果相似.
铜胁迫能降低 AsA 含量和 AsA / DHA,增加 DHA 含
量,这与 Shalata 等[20]的研究结果相似. 加入外源
NO( SNP 为供体), AsA 含量和 AsA / DHA 升高,
DHA含量降低,植株的抗逆境胁迫能力增强,这在
番茄根系上体现尤为明显.而添加 GSH抑制剂 BSO
后,铜胁迫番茄植株中 AsA含量和 AsA / DHA降低,
这与 GSH参与 GSH鄄AsA 循环有关. Cu+B1 +SNP 处
理的 AsA 含量和 AsA / DHA 高于 Cu+B1处理,但明
显低于 Cu+SNP 处理,说明外源 NO 能够有效提高
AsA含量,维持 AsA / DHA,这可能与 NO 改变植物
体内有关 AsA 代谢的酶活性有关[21],进一步说明
NO影响了铜胁迫下 GSH鄄ASA的代谢循环.
作为抗氧化物质,还原态的谷胱甘肽(GSH)可
通过酶促或非酶促反应清除活性氧. GSH 还可以通
过抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环途径清除活性氧[22-23] .
本研究表明,在 50 滋mol·L-1 Cu 处理下,番茄植株
GSH含量比对照显著降低,可能是由于铜胁迫下,
GSH参与清除活性氧后本身被氧化,从而含量下
降.这与前人研究发现在抗性氧化能力相对较弱的
植物中,GSH作为主要的抗氧化剂,过量 Cu 胁迫会
导致 GSH下降的结果相似[24] .本试验还表明,外源
NO可提高铜胁迫下番茄植株 GSH 含量,与阮海华
等[25]在小麦上的研究结果一致.说明外源 NO 能够
通过提高 GSH含量增强植物的抗氧化能力.
氧化胁迫条件下,H2O2等活性氧被 GSH 还原,
同时 GSH 被氧化为 GSSG,GSH / GSSG 可反映细胞
内氧化还原状态[26] . 本研究表明,在低浓度 (100
滋mol·L-1)BSO 处理下,外源 NO 能够降低铜胁迫
番茄 GSH 含量和 GSH / GSSG;而在高浓度 ( 250
滋mol·L-1)BSO 处理下,外源 NO 通过提高铜胁迫
番茄 GSH含量,降低 GSSG 含量,调节 GSH / GSSG.
说明外源 NO 调节 GSH、GSSG 含量和 GSH / GSSG
与 BSO的处理浓度有关. 低浓度 BSO 处理下,外源
NO增加了氧化胁迫的程度,高浓度 BSO 处理下,外
源 NO 可通过调节 GSH、GSSG 含量和 GSH / GSSG,
维持细胞相对稳定的氧化还原平衡.
AsA在植物细胞内的氧化分解主要由 AAO 和
APX催化,两种酶分别在 O2和 H2 O2的参与下将
AsA氧化为不稳定的 MDHA,MDHA 经过非酶促歧
化反应形成脱氢抗坏血酸(DHA). 本研究表明,在
添加 100 滋mol·L-1 BSO 处理下,外源 NO 可提高
AAO 比活性,而 250 滋mol·L-1 BSO 处理下,外源
NO降低了铜胁迫下 AAO 比活性. APX 比活性变化
与 AAO比活性呈负相关,这与前人在烟草和西葫芦
上的研究结果一致[27] . 外源 NO 降低了 APX 比活
性,这与吴锦程等[4]的研究结果相反,可能与试验
胁迫程度或者植物种类不同有关.
DHAR和 MDHAR对维持植物细胞内 AsA的再
生起重要作用. MDHAR 的主要目标是限制 MDHA
的数量,MDHA 可以自发不成比例地生成 AsA 和
DHA.因此,较高水平的 MDHAR比活性能够达到限
制 MDHA 的作用,而较高水平的 DHAR 与巯基
(鄄SH)基团水平的降低有关. 植物通过 DHAR 比活
性的增加,利用 GSH 作为电子供体使 DHA 得到还
原,最终完成 AsA鄄GSH 循环的有效运作[28-29] . 本研
究表明,在添加低浓度 BSO处理下,外源 NO提高了
DHAR比活性,降低了 MDHAR 和 APX 比活性,而
同时 Cu+B1 +SNP 处理的 AsA 含量高于 Cu+B1处
理,说明 DHAR在维持 AsA含量和调节细胞抗坏血
酸的氧化还原状态方面起关键作用,而 MDHAR 比
活性的降低可能部分影响了 AsA 含量,这可能是由
于外源 NO通过提高 DHAR比活性,利用 GSH 作为
电子供体使 DHA得到还原[30] .添加高浓度 BSO 处
理下,外源 NO 降低了铜胁迫番茄根系 DHAR、
MDHAR和 AAO比活性,提高了 APX 比活性,同时
AsA、DHA含量和 AsA / DHA 升高,表明番茄幼苗根
8201 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
系 AsA 含量可能受 AsA 合成酶的调节[20],这还需
要试验进一步证实.
谷胱甘肽还原酶(GR)是一种黄素蛋白氧化还
原酶,在重金属胁迫下,其对活性氧的清除起关键作
用.在氧化胁迫条件下,活性氧可使 GSH 氧化成
GSSG,GSSG又可以在 GR的作用下还原为 GSH.在
植物中,GR 通过使细胞内谷胱甘肽库保持在还原
状态而在氧化胁迫响应中具有重要作用[31] .本试验
结果表明,Cu+B1+SNP 比 Cu+B1处理番茄 GR 比活
性下降,可能是由于 MDHA在 NADPH提供电子下,
由 MDHAR催化还原为 AsA,消耗 NADPH,而 NAD鄄
PH浓度降低可能影响 GR 比活性[32] . GSH 清除活
性氧时本身被氧化成 GSSG,而 GR 比活性又降低,
所以不能及时将 GSSG 还原,导致 GSH 含量下降.
而 Cu+B2+SNP比 Cu+B2处理番茄 GR比活性升高,
可能是由于 NO在抑制胁迫反应时使茉莉酸产生积
累,而 GR 受茉莉酸激活[33] . 说明在添加低浓度
(100 滋mol·L-1)BSO处理下,外源 NO 导致铜胁迫
番茄 GR 比活性降低,可能与 NADPH 浓度有关;而
高浓度(250 滋mol·L-1)BSO 处理下,外源 NO 提高
了 GR比活性,可能与 NO刺激茉莉酸积累有关[34] .
在添加低浓度 BSO(100 滋mol·L-1)处理下,外
源 NO提高了 DHAR比活性,降低了 GR比活性,而
同时 GSH含量降低,GSSG含量升高.这是因为一方
面 GSH作为还原 DHA 的电子供体,在较高 DHAR
比活性作用下被氧化为 GSSG[30];另一方面 GR 比
活性降低,不能及时将 GSSG还原为 GSH.而在添加
高浓度 BSO(250 滋mol·L-1)处理下,外源 NO 通过
降低 DHAR比活性,提高 GR 比活性,升高 GSH 含
量和 GSH / GSSG,降低 GSSG 含量,维持细胞内相对
稳定的氧化还原平衡.
综上,外源 NO 影响了铜胁迫下番茄 AsA鄄GSH
循环,但是在不同浓度谷胱甘肽抑制剂处理下,外源
NO对番茄根系 AsA鄄GSH代谢的调节效应不同.
参考文献
[1]摇 Wojcik M, Tukiendorf A. Response of wild type of Ara鄄
bidopsis thaliana to copper stress. Biologia Plantarum,
2003, 46: 79-83
[2]摇 Ma Y鄄H (马玉华), Ma F鄄W (马锋旺), Ma X鄄W (马
小卫). Effects of drought stress on ascorbic acid con鄄
tents and activities of related metabolic enzymes in apple
leaves. Journal of Northwest A&F University ( Natural
Science) (西北农林科技大学学报·自然科学版),
2008, 36(3): 150-154 (in Chinese)
[3]摇 Xu X鄄D (徐向东), Sun Y (孙摇 艳), Guo X鄄Q (郭晓
芹). Effect of exogenous melatonin on ascorbate metab鄄
olism system in cucumber seedling under high tempera鄄
ture stress. Chinese Journal of Applied Ecology (应用生
态学报), 2010, 21(10): 2580-2586 ( in Chinese)
[4]摇 Wu J鄄C (吴锦程), Chen J鄄Q (陈建琴), Liang J (梁
杰), et al. Effects of exogenous NO on ascorbate鄄gluta鄄
thione cycle in loquat leaves under low temperature
stress. Chinese Journal of Applied Ecology (应用生态学
报), 2009, 20(6): 1395-1400 (in Chinese)
[5]摇 Liu J鄄X (刘建新), Wang X (王摇 鑫), Li B鄄P (李博
萍). Effect of exogenous nitric oxide on ascorbate鄄gluta鄄
thione cycle in ryegrass seedling leaves under NaCl
stress. Acta Prataculturae Sinica (草业学报), 2010,
19(2): 82-88 (in Chinese)
[6]摇 Zhu W鄄M (朱为民), Ding H鄄D (丁海东), Qi N鄄M
(齐乃敏), et al. Effects of Cd2+ stress on ascorbate鄄
glutathione cycle metabolism in tomato seedling. Acta
Agriculturae Boreali鄄Sinica (华北农学报), 2005, 20
(3): 50-53 (in Chinese)
[7]摇 Cui X鄄M (崔秀敏), Wu X鄄B (吴小宾), Li X鄄Y (李
晓云), et al. Responses of growth, functional enzyme
activity in biomembrane of tomato seedlings to excessive
copper, cadmium and the alleviating effect of exogenous
nitric oxide. Plant Nutrition and Fertilizer Science (植
物营养与肥料学报), 2011, 17 (2): 349 - 357 ( in
Chinese)
[8]摇 Zhang Y鄄K (张义凯), Cui X鄄M (崔秀敏), Yang S鄄X
(杨守祥), et al. Effects of exogenous nitric oxide on
active oxygen metabolism and photosynthetic characteris鄄
tics of tomato seedlings under cadmium stress. Chinese
Journal of Applied Ecology (应用生态学报), 2010, 21
(6): 1432-1438 (in Chinese)
[9]摇 Kampfenkel K, Van MM, Inz侉 D. Extraction and deter鄄
mination of ascorbate and dehydroascorbate from plant
tissue. Analytical Biochemistry, 1995, 225: 165-167
[10]摇 Hissin PJ, Hilf R. A fluoremetric method for determina鄄
tion of oxidized and reduced glutathione in tissue. Ana鄄
lytical Biochemistry, 1976, 74: 214-226
[11]摇 Shen CH, Krishnamurthy R, Yeh KW. Decreased L鄄
ascorbate content mediating bolting is mainly regulated
by the galacturonate pathway in Oncidium. Plant Cell
Physiology, 2009, 50: 935-946
[12]摇 Ma FW, Cheng LL. The sun鄄exposed peel of apple fruit
has higher xanthophyll cycle鄄dependent thermal dissipa鄄
tion and antioxidants of the ascorbate鄄glutathione path鄄
way than the shade peel. Plant Science, 2003, 165:
819-827
[13]摇 Kong X鄄S (孔祥生), Yi X鄄F (易现峰). Plant Physi鄄
ology Experimental Techniques. Beijing: China Agricul鄄
ture Press, 2008: 264-265 (in Chinese)
[14]摇 Zhao S鄄J (赵世杰), Liu H鄄S (刘华山), Dong X鄄C
(董新纯). Laboratory Guide for Plant Physiology. Bei鄄
jing: China Agricultural Science and Technology Press,
2002: 47-48 (in Chinese)
[15]摇 Smirnoff N, Pallanca JE. Ascorbate metabolism in rela鄄
tion to oxidative stress. Biochemical Society Transac鄄
tions, 1996, 24: 472-478
92014 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李晓云等: 外源 NO对铜胁迫下番茄幼苗根系抗坏血酸鄄谷胱甘肽循环的影响摇 摇 摇
[16]摇 Meyer AJ. The integration of glutathione homeostasis
and redox signaling. Plant Physiology, 2007, 31: 1-14
[17]摇 May MJ, Vernoux T, Leaver C, et al. Glutathione ho鄄
meostasis in plant: Implications for environmental sens鄄
ing and plant development. Journal of Experimental Bot鄄
any, 1998, 49: 649-667
[18]摇 Chen K鄄M (陈坤明), Gong H鄄J (宫海军), Wang S鄄
M (王锁民). Biosynthesis, transport and function of
ascorbate in plants. Acta Botanica Boreali鄄Occidentalia
Sinica (西北植物学报), 2004, 24(2): 329-336 ( in
Chinese)
[19]摇 Anjum NA, Umar S, Ahmad A, et al. Sulphur protects
mustard (Brassica campestris L. ) from cadmium toxicity
by improving leaf ascorbate and glutathione. Plant
Growth Regulation, 2008, 54: 271-279
[20]摇 Shalata A, Neumann PM. Exogenous ascorbic acid (vi鄄
tamin C) increases resistance to salt stress and reduces
lipid peroxidation. Journal of Experimental Botany,
2001, 52: 2207-2211
[21]摇 Fan H鄄F (樊怀福), Guo S鄄R (郭世荣), Duan J鄄J
(段九菊), et al. Effects of nitric oxide on the growth
and glutathione dependent antioxidative system in cu鄄
cumber ( Cucumis sativus L. ) seedlings under NaCl
stress. Acta Ecologica Sinica (生态学报), 2008, 28
(6): 2511-2517 (in Chinese )
[22]摇 Wells WW, Xu DP, Yang Y, et al. Mammalian thiol鄄
transferase (glutaredoxin) and protein disulfide isomer鄄
ase have dehydroascorbate reductase activity. Journal of
Biological Chemistry, 1990, 265: 15361-15364
[23]摇 Dixon DP, Davis BG, Edwards R. Functional diver鄄
gence in the glutathione transferase superfamily in
plants: Identification of two classes with putative func鄄
tions in redox homeostasis in Arabidopsis thaliana. Jour鄄
nal of Biological Chemistry, 2002, 277: 30859-30869
[24] 摇 Wang S鄄H (王松华), Yang Z鄄M (杨志敏), Xu L鄄L
(徐朗莱), et al. Research development about copper
stress and resistance mechanism of plants. Ecology and
Environment (生态环境), 2003, 12(3): 336-341 (in
Chinese)
[25]摇 Ruan H鄄H (阮海华), Shen W鄄B (沈文飚), Liu K鄄L
(刘开力), et al. Effects of exogenous NO donor on
glutathione鄄dependent antioxidative system in wheat
seedling leaf under salt stress. Acta Agronomica Sinica
(作物学报), 2005, 31(9): 1144-1149 (in Chinese)
[26]摇 Sen CK, Packer L. Antioxidant and redox regulation of
gene transcription. The FASEB Journal, 1996, 10:
709-720
[27]摇 Zhang L, Wang ZN, Yang X. Metabolic engineering of
plant L鄄ascorbic acid biosynthesis: Recent trends and
applications. Critical Reviews in Biotechnology, 2007,
27: 173-182
[28]摇 Asada K. The role of ascorbate peroxidase and mono de鄄
hy鄄droascorbate reductase in H2O2 scavenging in
plants / / Scandalios JG, ed. Oxidative Stress and the
Molecular Biology of Antioxidant Defences. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997: 715-735
[29]摇 Foyer CH, Halliwell B. The presence of glutathione and
glutathione reductase in chloroplasts: A proposed role in
ascorbic acid metabolism. Planta, 1976, 133: 21-25
[30]摇 Gill SS, Tute JN. Reactive oxygen species and antioxi鄄
dant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants.
Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48: 909-930
[31]摇 Ali MB, Hahn EJ, Paek KY. Effects of temperature on
oxidative stress defense systems, lipid peroxidation and
lipoxygenase activity in Phalaenpossi. Plant Physiology
and Biochemistry, 2005, 43: 213-223
[32]摇 Shalata A, Mittova V, Volokita M, et al. Response of
the cultivated tomato and its wild salt鄄tolerant relative ly鄄
copersic on pennellii to salt鄄dependent oxidative stress:
The root antioxidative system. Physiologia Plantarum,
2001, 112: 487-494
[33]摇 Shan CJ, Liang ZG. Jasmonic acid regulates ascorbate
and glutathione metabolism in Agropyron cristatumleaves
under water stress. Plant Science, 2010, 178: 130-139
[34]摇 Hu X鄄Y (胡向阳), Cai W鄄M (蔡伟明). Nitric oxide
and elicitor鄄induced plant defense response. Chinese
Bulletin of Life Sciences (生命科学), 2005, 17(2):
176-182 (in Chinese)
作者简介摇 李晓云,女,1986 年生,硕士研究生.主要从事植
物营养机理与调控研究. E鄄mail: lixiaoyun1213@ 126. com
责任编辑摇 张凤丽
0301 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷