全 文 ：不同种植方式对绿洲农田土壤酶活性
与微生物多样性的影响∗
李　 锐　 刘　 瑜　 褚贵新∗∗
（新疆石河子大学农学院 ／新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室， 新疆石河子 ８３２００３）
摘　 要　 研究了玉米连作 １０年、小麦连作 ８年⁃棉花连作 １０年、棉花连作 １５ 年和棉花 ６ 年⁃６
年小麦 ／油葵轮作 ４种种植方式对土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶和蛋白酶
活性的影响，并分析了土壤细菌、真菌、氨氧化古菌与氨氧化细菌对北疆绿洲农田不同种植方
式的响应．结果表明： 不同种植方式对土壤过氧化氢酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶和蛋白酶活性
影响明显，但对蔗糖酶无显著影响；对氨氧化古菌多样性指数有显著影响，对土壤细菌、真菌
和氨氧化细菌多样性指数无明显影响．土壤真菌和氨氧化细菌群落结构对不同种植方式的响
应较细菌和氨氧化古菌敏感．长期棉花连作使绿洲农田土壤酶活性下降，微生物群落多样性
降低，而轮作可提高土壤酶活性和微生物群落结构多样性．
关键词　 连作； 土壤酶活性； 微生物多样性； 轮作； ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）０２－０４９０－０７　 中图分类号　 Ｓ１５４．３６　 文献标识码　 Ａ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｎ ｓｏｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｏａｓｉｓ ｆａｒｍｌａｎｄ． ＬＩ Ｒｕｉ， ＬＩＵ Ｙｕ， ＣＨＵ Ｇｕｉ⁃ｘｉｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉ⁃
ｖｅｒｓｉｔｙ ／ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｏａｓｉｓ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，
Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２００３， Ｘｉｎｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（２）： ４９０－４９６．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ， ｉｎｖｅｒｔａｓｅ， ａｒｙｌｓｕｌ⁃
ｆａｔａｓｅ， ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｆｏｕｒ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ
ｉｎｃｌｕｄｅｄ （１） １０ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎ， （２） ８ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｆｏｌ⁃
ｌｏｗｅｄ ｂｙ １０ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ， （３） １５ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ， ａｎｄ
（４） ６ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ６ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ／ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｒｏｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅ⁃
ｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｆｕｎｇｉ， ａｍｍｏｎｉａ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ （ＡＯＢ）， ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｍｏｎｉａ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ａｒ⁃
ｃｈａｅａ （ＡＯＡ） ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ， ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ， ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ，
ｗｈｉｌｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｏｉｌ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｆｌｕ⁃
ｅｎｃｅｄ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ＡＯＡ， ｂｕｔ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｆｕｎｇｉ
ａｎｄ ＡＯＢ． Ｔｈｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ＡＯＢ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ
ｔｈａｎ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ＡＯＡ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｏｉｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｏａｓｉｓ ｆａｒｍｌａｎｄ， ｗｈｉｌｅ ｃｒｏｐ ｒｏｔａｔｉｏｎ
ｃｏｕｌｄ ａｌｌｅｖｉａｔｅ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ； ｓｏｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； ｃｒｏｐ ｒｏｔａｔｉｏｎ； ＰＣＲ⁃
ＤＧＧＥ．
∗农业部公益性行业科研专项（２０１１０３００４）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｃｈｕｇｕｉｘｉｎｓｈｚｕ＠ １６３．ｃｏｍ
２０１４⁃０４⁃２７收稿，２０１４⁃１１⁃１２接受．
　 　 维持土壤微生物群落结构多样性对提高农田生
产力、抑制土传病害及增强土壤缓冲能力具有重要
意义．微生物广泛参与土壤 Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｓ 等养分循环，
是土壤有机物降解转化的驱动力．土壤氮的生物小
循环是地球大循环中最重要的物质循环，而氨氧化
过程是整个氮循环过程的限速步骤．土壤微生物分
泌的各类酶与土壤各种生物转化过程紧密相关，土
壤酶活性可表征土壤生物活性．土壤微生物群落结
构多样性与生物活性对农业活动中各种人为扰动有
敏感的响应．贾志红等［１］利用 ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ 技术研究
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 ２月　 第 ２６卷　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｆｅｂ． ２０１５， ２６（２）： ４９０－４９６
发现，烤烟轮作土壤微生物多样性较连作高；棉花连
作致使土壤细菌群落结构多样性发生较大变化［２］ ．
在新疆绿洲地区，棉花连作 ５ ～ １０ 年土壤酶活性明
显降低［３］ ．李坤等［４］得出葡萄连作使土壤细菌、真菌
种群发生变化．长期连作影响土壤中氨氧化古菌
（ａｍｍｏｎｉａ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ａｒｃｈａｅａ，ＡＯＡ）的群落组成，使土
壤氨氧化细菌（ ａｍｍｏｎｉａ ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＡＯＢ）的
组成趋于单一，同时也使得 ＡＯＢ 优势种群富集［５］ ．
宋亚娜等［６］报道，ＡＯＡ对红壤硝化作用的影响程度
较大．而轮作能有效克服连作障碍，提高土壤微生物
多样性［７］ ．综上，不同种植方式可导致土壤生物活性
与微生物群落结构多样性发生变化．
新疆棉花种植面积占全国 １ ／ ３ 以上，是国家主
要商品棉基地［８］ ．受经济利益驱动，棉花连作面积逐
年增加．据报道，新疆棉花大面积长期连作已超过 １５
年［９］，随着连作年限增加，棉花土传病害、地力下降
和土壤生物质量下降等问题值得关注．本文通过选
取典型样地，采用酶学和微生物分子生态学手段对
长期棉花连作、玉米连作、小麦 ／油葵轮作等种植方
式的土壤生物活性和微生物多样性进行了研究，旨
在揭示农田关键微生物菌群多样性与生物活性对不
同种植方式的响应，为北疆绿洲农田土壤生物肥力
和微生物多样性维护提供科学依据．
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试验设计
选取北疆绿洲长期种植作物的大田，分别为
Ｔ１：玉米连作 １０年，样地面积 ０．７ ｈｍ２；Ｔ２：小麦连作
８年⁃棉花连作 １０ 年，样地面积 ０．５ ｈｍ２；Ｔ３：棉花连
作 １５年，样地面积 １ ｈｍ２；Ｔ４：棉花 ６年⁃６年小麦 ／油
葵轮作，样地面积 ３ ｈｍ２ ．土壤类型为典型灌耕灰漠
土（ｃａｌｃａｒｉｃ ｆｌｕｖｉｓａｌ） ．
１􀆰 ２　 样品采集
采用多点混合法以“Ｓ”型路线在样地上采集土
壤，在样点附近取 １２ 钻为 １ 个混合样，共采集 ３ 个
混合样．土样采集后一部分存放在 ４ ℃冰箱，用于测
定酶活性．另一部分存放在－８０ ℃冰箱，用于土壤
ＤＮＡ提取和后续 ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ分子生物学指标测定．
１􀆰 ３　 土壤酶活性测定
土壤过氧化氢酶活性采用微量滴定法测定（５ ｇ
土，０．５ ｈ），结果以 １ ｇ土壤 ３０ ｍｉｎ 消耗的高锰酸钾
的毫升数表示［１０］ ．蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法
（５ ｇ 土，３７ ℃，２４ ｈ），显色强度在分光光度计 ５０８
ｎｍ波长下测定，酶活性用 ２４ ｈ后 １ ｇ土壤中的葡萄
糖毫克数表示［１０］ ．芳基硫酸酯酶采用对硝基苯硫酸
钾比色法（５ ｇ土，３７ ℃，ｌ ｈ），显色强度通过分光光
度计 ４１０ ｎｍ波长测定，结果以每小时 １ ｇ 土壤中释
放的对硝基酚微克数表示［１１］ ．脱氢酶采用 ＴＴＣ 比色
法（６ ｇ土，３７ ℃，２４ ｈ），显色强度在分光光度计 ４８５
ｎｍ波长下测定，结果以每小时 １ ｇ 土壤中释放的三
苯基甲臜（ＴＰＦ）的微克数表示［１２］ ．蛋白酶采用以酪
蛋白为底物的方法（２．５ ｇ 土，５０ ℃，２ ｈ），显色强度
在分光光度计 ７００ ｎｍ 波长下测定，结果以 ２ ｈ 后 １
ｇ土壤中酪氨酸的微克数表示［１２］ ．
１􀆰 ４　 土壤 ＤＮＡ及微生物群落结构与多样性测定
土壤总 ＤＮＡ的提取采用 ＰｏｗｅｒＳｏｉｌＴＭＤＮＡ Ｉｓｏｌａ⁃
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． ＵＳＡ）．试验所用引
物和 Ｔａｑ酶试剂盒均由大连宝生公司生产．
１􀆰 ４􀆰 １ 细菌 １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ６区 ＰＣＲ扩增及变性梯度凝
胶电泳（ＤＧＧＥ） 　 细菌 １６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ６ 区 ＰＣＲ 扩增
采用通用引物对 Ｆ９６８⁃Ｒ１４０４，引物序列见表 １．ＰＣＲ
扩增条件为：９４ ℃变性 ５ ｍｉｎ，２０个循环（９４ ℃变性
１ ｍｉｎ，６７ ℃退火 １ ｍｉｎ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ，每个循环
退火温度降 ０．５ ℃），然后 １５ 个循环（９４ ℃变性 １
ｍｉｎ，５７ ℃退火 １ ｍｉｎ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ，每个循环退
火温度降 ０．５ ℃），最后再 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ．产物片
段长度 ４５０ ｂｐ．土壤中总细菌（１６Ｓ ｒＤＮＡ）ＰＣＲ 产物
进行 ＤＧＧＥ分离时，使用 ７％的胶，变性浓度 ４５％ ～
５５％，缓冲液为 １×ＴＡＥ 溶液，电泳条件为电压 １１０
Ｖ，温度 ６０ ℃，时间 １７ ｈ．
１􀆰 ４􀆰 ２真菌 ＩＴＳ １８Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ 扩增及变性梯度凝
胶电泳（ＤＧＧＥ） 　 真菌 ＩＴＳ １８Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ 扩增采
用通用引物对 ＩＴＳ１Ｆ⁃ＩＴＳ２，引物序列见表 １．ＰＣＲ 扩
增条件为：９４ ℃变性 ５ ｍｉｎ，接着 ３６个循环（９４ ℃变
性 ３０ ｓ， ５６ ℃退火 １ ｍｉｎ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ），最后再
７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ．产物片段长度 ３００ ｂｐ．土壤中真菌
（ＩＴＳ区）ＰＣＲ 产物进行 ＤＧＧＥ 分离时，使用 ８％的
胶，变性浓度 ３０％ ～５０％，缓冲液为 １×ＴＡＥ 溶液，电
泳条件：电压 １１０ Ｖ，温度 ６０ ℃，时间 １７ ｈ．
１􀆰 ４􀆰 ３氨氧化古菌 ＰＣＲ 扩增及变性梯度凝胶电泳
（ＤＧＧＥ）　 氨氧化古菌（ＡＯＡ） ｒＤＮＡ ＰＣＲ扩增采用
通用引物对 ＣｒｅｎａｍｏＡ２３ｆ和 ＣｒｅｎａｍｏＡ６１６Ｒ，引物序
列见表 １．ＰＣＲ扩增条件为 ９４ ℃变性 ５ ｍｉｎ，接着 ３５
个循环（９４ ℃变性 ４５ Ｓ，５３ ℃退火 １ ｍｉｎ，７２ ℃延伸
１ ｍｉｎ），最后再 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ．产物片段长度 ６００
ｂｐ．土壤中氨氧化古菌（ＡＯＡ）ＰＣＲ 产物进行 ＤＧＧＥ
分离时，使用 ６％的胶，变性浓度 １５％ ～５５％，缓冲液
为 １×ＴＡＥ溶液，电泳条件：电压 １１０ Ｖ，温度 ６０ ℃，
１９４２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李　 锐等： 不同种植方式对绿洲农田土壤酶活性与微生物多样性的影响　 　 　 　 　 　
时间 １７ ｈ．
１􀆰 ４􀆰 ４氨氧化细菌 ＰＣＲ 扩增及变性梯度凝胶电泳
（ＤＧＧＥ）　 氨氧化细菌（ＡＯＢ） ｒＤＮＡ ＰＣＲ扩增采用
通用引物对 ａｍｏＡ１Ｆ ～ ａｍｏＡ２Ｒ，引物序列见表 １．
ＰＣＲ扩增条件为 ９４ ℃变性 ５ ｍｉｎ，接着 ３５ 个循环
（９２ ℃变性 １ ｍｉｎ， ５０ ℃退火 １ ｍｉｎ， ７２ ℃延伸 ４５
ｓ），最后再 ７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎ．产物片段长度 ５００ ｂｐ．土
壤中氨氧化细菌 ＰＣＲ产物进行 ＤＧＧＥ分离时，使用
７％的胶，变性浓度 ２７％ ～ ４５％，缓冲液为 １×ＴＡＥ 溶
液，电泳条件：电压 １１０ Ｖ，温度 ６０ ℃，时间 １７ ｈ．
ＤＧＧＥ均使用 ＳＹＢＲâ核酸凝胶染色 ２０ ｍｉｎ．
１􀆰 ５　 数据处理
采用 Ｅｘｃｅｌ ２０１０ 和 ＳＰＳＳ １７．０ 统计分析软件进
行数据处理，处理间的差异显著性采用 Ｄｕｎｃａｎ法进
行单因素多重比较． ＤＧＧＥ 指纹图谱分析借助于
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ７．０ 进行图片调整，采用 Ｇｅｌ⁃ＱｕａｎｔＴＭ １．０
软件（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）进行条
带判读及迁移率、强度和面积计算，采用 ＵＰＧＭＡ
（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒ⁃
ａｇｅ）方法进行聚类分析，再根据 Ｐｒｉｍｅｒ ６ 软件（Ｐｌｙ⁃
ｍｏｕｔｈ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）对 ＤＧＧＥ 指纹图谱进行
ＰＣＡ分析．
根据条带的相对位置和相对强度计算 Ｓｈａｎｎｏｎ
指数（Ｈ）和 Ｓｉｍｐｓｏｎ 均匀度指数（Ｅ）来评价微生物
的多样性［１７］ ．
Ｈ ＝－ ∑
Ｓ
ｉ ＝ １
Ｐ ｉ ｌｎＰ ｉ
Ｅ ＝ １ － ∑
Ｓ
ｉ ＝ １
Ｐ ｉ ２
式中：Ｐ ｉ为第 ｉ 个物种在全部样品中的比例（Ｐ ｉ ＝
ｎｉ ／ Ｎ． ｎｉ为第 ｉ个物种的个体数； Ｎ为每个样品中检
测到的条带数）；Ｓ为 ＤＧＧＥ检测到的每一泳道的条
带总数，即种的数目．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同种植方式对土壤酶活性的影响
过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶及
蛋白酶主要参与土壤有机碳、氮、硫的生物转化与循
环．由表 ２ 可知，不同种植方式对过氧化氢酶、芳基
硫酸酯酶、脱氢酶和蛋白酶活性均有明显影响．棉花
６年⁃小麦 ６年连作 ／油葵轮作（Ｔ４）处理的过氧化氢
酶（ＣＡＴ）活性最高，分别比玉米连作 １０ 年（Ｔ１）、小
麦连作 ８ 年⁃棉花连作 １０ 年（Ｔ２）和棉花连作 １５ 年
（Ｔ３）的 ＣＡＴ活性高 ８．２％、２．０％和 ６．７％．Ｔ４处理的
脱氢酶（ＤＨＯ）活性也最高，分别比Ｔ１、Ｔ２和Ｔ３处理
表 １　 用于细菌、真菌、氨氧化古菌、氨氧化细菌的引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｆｕｎｇｉ， ＡＯＡ ａｎｄ ＡＯＢ
项目
Ｉｔｅｍ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列　 　 　 　 　 　
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′⁃３′） 　 　 　 　 　
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
细菌
Ｂａｃｔｅｒｉａ
Ｆ９６８⁃ＧＣ ５′⁃ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧ⁃
ＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣ⁃３′
［１３］
Ｒ１４０１ ５′⁃ＧＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣ⁃３′
真菌
Ｆｕｎｇｉ
ＩＴＳ１Ｆ⁃ＧＣ ５′⁃ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣ⁃
ＣＧＣＣＣＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ⁃３′
［１４］
ＩＴＳ２ ５′⁃ＴＴＹＧＣＴＧＹＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧ⁃３′
氨氧化古菌
ＡＯＡ ＣｒｅｎａｍｏＡ２３ｆ ５′⁃ＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＷＡＧＡＣＧ⁃３′ ［１５］ＣｒｅｎａｍｏＡ
６１６Ｒ ５′⁃ＧＣＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＴＣＣＡ⁃３′氨氧化细菌
ＡＯＢ ａｍｏＡ１Ｆ ５′⁃ＧＧＧＧＨＴＴＹＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴ⁃３′ ［１６］
ａｍｏＡ２Ｒ ５′⁃ＣＣＣＣＴＣＫＧＳＡＡＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣ⁃３′
表 ２　 不同种植方式对土壤酶活性的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
过氧化氢酶
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
（ｍＬ·ｇ－１）
蔗糖酶
Ｉｎｖｅｒｔａｓｅ
（ｍｇ·ｇ－１·ｈ－１）
芳基硫酸酯酶
Ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ
（μｇ ＰＮＰ·ｇ－１·ｈ－１）
脱氢酶
Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
（μｇ ＴＰＦ·ｇ－１·２４ ｈ－１）
蛋白酶
Ｐｒｏｔｅａｓｅ
（μｇ·ｇ－１·ｈ－１）
Ｔ１ ２．３４±０．０２ｂ ８．３８±０．５７ａ ６４．３±０．４ｃ ７．４５±０．０４ｂ ６．０７±０．１３ｃ
Ｔ２ ２．５０±０．０４ａ ７．５０±０．６４ａ ６８．０±０．７ｂ ７．５５±０．０４ｂ ９．６９±０．１６ａ
Ｔ３ ２．３８±０．０６ｂ ８．１８±０．８２ａ ５９．７±０．６ｄ ６．２０±０．０６ｃ ６．１３±０．１０ｂｃ
Ｔ４ ２．５５±０．０１ａ ８．８５±１．５１ａ ７４．３±０．５ａ ８．８１±０．０８ａ ６．３６±０．１４ｂ
Ｔ１： 玉米连作 １０年 １０ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎ； Ｔ２：小麦连作 ８年⁃棉花连作 １０年 ８ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ １０ ｙｅａｒｓ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ； Ｔ３： 棉花连作 １５年 １５ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ； Ｔ４： 棉花 ６年⁃６年小麦 ／油葵轮作 ６ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐ⁃
ｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ６ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ／ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｒｏｔａｔｉｏｎ． 同列不同字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｓｉｇ⁃
ｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ ｌｅｖｅｌ． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
２９４ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
的 ＤＨＯ活性高 １５．４％、１４．３％和 ２９．６％．芳基硫酸酯
酶活性表现为： Ｔ４＞Ｔ２＞Ｔ１＞Ｔ３ ．蛋白酶活性则以 Ｔ２处
理下最高，其次为 Ｔ４处理，Ｔ１处理最低．不同种植方
式对土壤蔗糖酶的影响差异不显著．Ｔ４ 处理的各种
酶活性处在一个比较高的水平，说明轮作有利于北
疆绿洲农田保持较高的土壤酶活性，而长期连作使
土壤酶活性明显下降．
２􀆰 ２　 不同种植方式对细菌、真菌群落结构的影响
对不同种植方式下土壤细菌、真菌的 ＤＧＧＥ 指
纹图谱进行主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙ⁃
ｓｉｓ，ＰＣＡ），其因子载荷可反映土壤中微生物群落结
构的变化．由图 １Ａ 可以看出，土壤细菌群落结构遗
传多样性的 ２ 个主成分 ＰＣ１ 和 ＰＣ２ 分别代表总变
量的 ２１．３％和 １９．０％．在相似度为 ８０％情况下，棉花
连作 １５ 年（Ｔ３）处理的土壤细菌群落在第 １ 主成分
轴上（ＰＣ１）明显不同于棉花 ６ 年⁃６ 年小麦 ／油葵轮
作（Ｔ４）处理，由第 ２ 主成分轴同样发现，Ｔ４处理细
菌的群落结构明显不同于 Ｔ３ 处理，玉米连作 １０ 年
（Ｔ１）、小麦连作 ８ 年⁃棉花连作 １０ 年（Ｔ２）两处理细
菌群落结构与 Ｔ３ 处理比较接近．表明绿洲农田不同
种植方式对土壤细菌群落结构有明显影响．土壤真
菌群落的 ２个主成分 ＰＣ１ 和 ＰＣ２ 分别代表总变量
的 ２８．２％和 ２４．９％，累计方差贡献率为 ５３．１％（图
１Ｂ）．在相似度为 ７３％水平下，土壤真菌群落结构在
第 １主成分轴把 Ｔ３和 Ｔ４聚为一类，且明显有别于 Ｔ１
和 Ｔ２；在第 ２主成分轴上 Ｔ１处理的真菌群落结构则
显著不同于 Ｔ２处理．说明不同种植方式改变了土壤
真菌群落结构，且绿洲农田土壤真菌群落结构对不
同作物长期种植的响应比细菌敏感．
２􀆰 ３　 不同种植方式对氨氧化古菌、氨氧化细菌群落
结构的影响
氨氧化古菌（ＡＯＡ）和氨氧化细菌（ＡＯＢ）是参
与土壤硝化作用的微生物，在农田氮素循环转化过
程中发挥重要作用．如图 ２ 所示，不同种植方式对氨
氧化古菌群落结构有显著影响．氨氧化古菌第 １ 主
成分 （ ＰＣ１） 方差贡献率是 ３５． ５％，第 ２ 主成分
（ＰＣ２）方差贡献率是 １７． １％，累计方差贡献率为
５２􀆰 ６％．在相似度为 ７０％情况下，ＰＣ１ 轴上长期玉米
连作（Ｔ１）与棉花 ６年⁃６年小麦 ／油葵轮作（Ｔ４）处理
的氨氧化古菌群落结构差异非常明显，但 Ｔ２、Ｔ３处
理氨氧化古菌群落结构差异不显著；第 ２ 主成分轴
上 Ｔ２、Ｔ３处理的氨氧化古菌群落明显区别于 Ｔ１与 Ｔ４
处理，但 Ｔ１与 Ｔ４之间无明显差异．表明不同种植方
式对土壤氨氧化古菌群落结构有显著影响．土壤氨
图 １　 不同种植方式土壤细菌（Ａ）、真菌（Ｂ）主成分分析
Ｆｉｇ．１　 ＰＣＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ （Ａ） ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ （Ｂ） ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ．
Ｔ１： 玉米连作 １０年 １０ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎ； Ｔ２： 小麦连
作 ８年⁃棉花连作 １０年 ８ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ
１０ ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ； Ｔ３： 棉花连作 １５ 年 １５ ｙｅａｒｓ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ； Ｔ４： 棉花 ６ 年⁃６ 年小麦 ／油葵轮作 ６
ｙｅａｒｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ６ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ／ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ
ｒｏｔａｔｉｏｎ． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图 ２　 不同种植方式土壤氨氧化古菌（Ａ）和氨氧化细菌（Ｂ）
主成分分析
Ｆｉｇ．２　 ＰＣＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＯＡ （Ａ） ａｎｄ ＡＯＢ （Ｂ） ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ
ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ．
氧化细菌在主成分 ＰＣ１ 和 ＰＣ２ 轴上分别代表总变
量的 ２７．２％和 １９．８％（图 ２Ｂ），在群落结构相似度为
５０％情况下，不同种植方式对氨氧化细菌群落结构
３９４２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 李　 锐等： 不同种植方式对绿洲农田土壤酶活性与微生物多样性的影响　 　 　 　 　 　
表 ３　 不同种植方式土壤细菌、真菌、氨氧化古菌、氨氧化细菌多样性指数
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｉｃｅｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｆｕｎｇｉ， ＡＯＡ ａｎｄ ＡＯＢ ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
细菌 Ｂａｃｔｅｒｉａ
Ｈ Ｅ
真菌 Ｆｕｎｇｉ
Ｈ Ｅ
氨氧化古菌 ＡＯＡ
Ｈ Ｅ
氨氧化细菌 ＡＯＢ
Ｈ Ｅ
Ｔ１ ３．０２±０．０３ａ ０．９６±０．００ａ ３．２０±０．１０ａ ０．９６±０．００ａ ２．８３±０．１６ｂ ０．９４±０．０１ｂ ２．２１±０．２６ａ ０．８７±０．０３ａ
Ｔ２ ２．９７±０．０８ａ ０．９６±０．００ａ ３．０３±０．１０ａ ０．９５±０．０１ａ ３．０５±０．０７ａ ０．９５±０．００ａ ２．０５±０．３６ａ ０．８５±０．０５ａ
Ｔ３ ３．０２±０．１５ａ ０．９６±０．０１ａ ３．０２±０．１６ａ ０．９５±０．０１ａ ３．１１±０．１１ａ ０．９５±０．０１ａ ２．１５±０．０６ａ ０．８７±０．０１ａ
Ｔ４ ２．９７±０．０８ａ ０．９６±０．００ａ ３．１４±０．０７ａ ０．９５±０．００ａ ２．９６±０．０１ａｂ ０．９４±０．０１ａｂ ２．２９±０．１５ａ ０．８９±０．０２ａ
Ｈ： Ｓｈａｎｎｏｎ指数 Ｓｈａｎｎｏｎ ｉｎｄｅｘ； Ｅ： Ｓｉｍｐｓｏｎ指数 Ｓｉｍｐｓｏｎ ｉｎｄｅｘ．
的影响与氨氧化古菌相似，但氨氧化细菌群落结构
对不同种植方式的响应更为敏感．
　 　 土壤微生物多样性是保持农田土壤生态系统稳
定性和土地生产力的基础． Ｓｈａｎｎｏｎ 指数 （Ｈ）和
Ｓｉｍｐｓｏｎ指数（Ｅ）常被用以表征微生物群落多样性．
由表 ３ 可知，不同种植方式下土壤细菌与真菌的
Ｓｈａｎｎｏｎ指数（Ｈ）、Ｓｉｍｐｓｏｎ指数（Ｅ）变化均不显著，
表明不同作物长期种植并未明显改变土壤细菌、真
菌群落的多样性．不同种植方式对氨氧化古菌多样
性指数影响显著，对氨氧化细菌多样性指数无明显
影响，各处理氨氧化古菌的多样性明显高于氨氧化
细菌．
３　 讨　 　 论
存在于农田土壤中的过氧化氢酶、蔗糖酶、芳基
硫酸酯酶、脱氢酶、蛋白酶，对土壤中 Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｓ 等主
要营养物质的循环转化起着重要的作用［１８］ ．棉花 ６
年⁃６年小麦 ／油葵轮作（Ｔ４）处理中过氧化氢酶、蔗
糖酶、芳基硫酸酯酶、脱氢酶活性均高于其他 ３个处
理，而蛋白酶活性则在小麦连作 ８ 年⁃棉花连作 １０
年（Ｔ２）处理出现最高值，其次为 Ｔ４，Ｔ１最低．原因可
能是 Ｔ２长期秸秆还田提供了充足的氮源和适宜的
根际微生态环境，所以有较高的蛋白酶活性．
土壤微生物群落功能与遗传结构多样性间存在
着复杂的关系，农田土壤功能的发挥依赖于稳定的
土壤生物群落结构和丰富的群落多样性．研究普遍
认为，长期连作会使土壤由“细菌型”向“真菌型”转
化．如董艳等［１９］研究发现，土壤真菌数量随设施大
棚年限增加而逐渐升高，种植 １０年和 ２０年的细菌 ／
真菌比（Ｂ ／ Ｆ）显著低于露地土壤．作物轮作则可明
显增加土壤细菌和放线菌数量，显著降低真菌数量，
且轮作方式下土壤微生物的多样性较高，尤其是土
壤细菌群落多样性明显提高．
本文主成分分析表明，棉花 ６ 年⁃６ 年小麦 ／油
葵轮作（Ｔ４）处理细菌的群落结构明显区别于棉花
连作 １５ 年（Ｔ３）处理，玉米连作 １０ 年（Ｔ１）、小麦连
作 ８ 年⁃棉花连作 １０年（Ｔ２）两处理细菌群落结构与
Ｔ３ 处理比较接近，但通过对 ＤＧＧＥ 指纹图谱的多样
性指数进一步分析发现，无论细菌还是真菌的多样
性指数（Ｓｈａｎｎｏｎ指数与 Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数）在各处理间
并无显著差异．轮作处理细菌多样性并没有明显优
于连作处理，反而是 Ｔ１和 Ｔ３的细菌多样性指数略高
于 Ｔ４，这与前人研究结果［１，４］不一致．可能是由于长
期连作条件下，土壤异养微生物对土壤化感物质的
分解能力增强而引起其多样性指数增加［２０－２１］，当连
作年限达到一定限度，土壤与作物根系环境筛选出
适宜的菌群，细菌多样性趋于新的相对稳定状态．此
外，新疆绿洲农田长期秸秆还田对土壤有机质含量
和组成有一定影响，加之根系分泌物参与腐殖质形
成，给土壤菌群繁殖生长提供了丰富的碳源与氮源，
这些因素均可改变土壤微生态环境，并影响微生物
群落与多样性．如李鑫等［２２］报道，盐碱土 ｐＨ和盐度
是制约微生物群落多样性的主要因素；Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ
等［２３］研究表明，施用有机肥可使细菌 ／真菌的比例
提高，且细菌群落多样性会受到土壤有机碳与 Ｃ ／ Ｎ
的影响．
氨氧化是硝化反应的第一步，也是限速步
骤［２４］，ＡＯＡ在陆地生态系统中分布非常广泛，目前
研究者在碱性沙地、森林土壤、牧草土壤、稻田土壤
等陆地生态系统中均检测到了 ＡＯＡ 的存在，且
ＡＯＡ数量比 ＡＯＢ 高出约 ２ ～ ３ 个数量级［２５］ ． Ｃｈｅｎ
等［２６］发现，ＡＯＡ对土壤氨氧化过程起着主导作用，
其 ａｍｏＡ 基因拷贝数以及转录水平均显著高于
ＡＯＢ．然而，也有研究认为，虽然氨氧化古菌 ａｍｏＡ基
因大量存在于陆地生态系统中，但并不意味着该基
因在驱动氨氧化过程中发挥主要作用［２７］ ．如 Ｊｉａ
等［２８］采用稳定性同位素原位示踪农田土壤氨氧化
微生物核酸 ＤＮＡ，发现 ＡＯＢ 是土壤硝化过程的主
要驱动者．本研究发现，不同种植方式对土壤氨氧化
古菌多样性指数有所影响，但对氨氧化细菌多样性
指数无明显影响，氨氧化细菌群落结构对不同种植
方式的响应更为敏感．干旱区绿洲农田土壤硝化势
４９４ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
强，硝化反应快，耕层土壤矿质态氮以 ＮＯ３
－为主，弄
清绿洲农田 ＡＯＡ和 ＡＯＢ群落多样性及其丰度在土
壤铵氧化反应的贡献，是调控硝化反应和滴灌农田
氮素管理的基础．但目前关于 ＡＯＡ 和 ＡＯＢ 对氨氧
化过程相对贡献率的研究尚存在不同观点，通过土
壤微生物分子生态研究手段，进一步定量 ＰＣＲ 和
１５Ｎ标记稳定探针技术（ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｐｒｏｂｅ，ＳＩＰ）结
合土壤硝化强度进行相关分析，阐明不同作物长期
种植对土壤关键微生物的影响、对绿洲农田土壤硝
化过程的生物学机制及氮素养分管理具有重要
意义．
参考文献
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作者简介　 李　 锐，女，１９９１ 年生，硕士研究生．主要从事土
壤微生物分子生态学研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｒｕｉｌｉｅｄｕ＠ １２６．ｃｏｍ
责任编辑　 肖　 红
６９４ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷