全 文 ：雷公藤内生细菌的促生作用及其
对雷公藤甲素生成的影响*
许进娇1 摇 宋摇 萍1**摇 封摇 磊2 摇 洪摇 伟1 摇 吴承祯1 摇 李国庆1 摇 赵希俊2 摇 葛恒懿1
( 1福建农林大学林学院, 福州 350002; 2福建农林大学资源与环境学院, 福州 350002)
摘摇 要摇 从健康雷公藤植株体内分离得到 23 株内生细菌,对其有益生物学特征及对小麦萌
发能力的影响进行评价,得出 3 株益生效果显著的内生细菌.这 3 株内生细菌均能产生植物
生长素和铁载体,其中 LG3、LJ10 具有溶磷特性,LG3、LY4 具有固氮功能并同时具有 1鄄氨基环
丙烷鄄1鄄羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)活性.经细菌 16S rDNA序列鉴定及同源性分析发现, LG3、
LY4 属于肠杆菌属,LJ10 属于泛菌属.回接试验表明,3 株内生细菌不但能够促进雷公藤植株
的生长,还能显著提高不同器官内雷公藤甲素的含量.
关键词摇 雷公藤摇 内生细菌摇 促生摇 次生代谢摇 雷公藤甲素
文章编号摇 1001-9332(2014)06-1681-07摇 中图分类号摇 Q946. 88摇 文献标识码摇 A
Growth鄄promoting effect and triptolide production regulation of endophytic bacteria from
Tripterygium wilfordii. XU Jin鄄jiao1, SONG Ping1, FENG Lei2, HONG Wei1, WU Cheng鄄zhen1,
LI Guo鄄qing1, ZHAO Xi鄄jun2, GE Heng鄄yi1 ( 1College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry
University, Fuzhou 350002, China; 2College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and
Forestry University, Fuzhou 350002, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(6): 1681-1687.
Abstract: A total of twenty鄄three endophytic bacteria were isolated from Tripterygium wilfordii,
among which three strains were selected for further studying based on their capabilities of growth鄄
promotion and wheat germination. All three isolated strains could produce phytohormone and
siderophore, and LG3 and LJ10 strains were capable of dissolving phosphorus. Additionally, LG3
and LY4 strains were both proved to have nitrogen鄄fixing function and 1鄄aminocyclopropane鄄1鄄
carboxy鄄late deaminase activity. Bacterial 16S rDNA sequence identification and homology analysis
suggested that LG3 and LY4 strains belonged to the Enterobacter and LJ10 belonged to the Pantoea.
The results of reinoculation experiment demonstrated that three endophytic bacteria could not only
promote the growth of Tripterygium wilfordii, but also improve the triptolide contents of different
organs significantly.
Key words: Tripterygium wilfordii; endophytic bacteria; growth鄄promotion; secondary metabolism;
triptolide.
*国家自然科学基金项目(31000264,30901131)、教育部科学技术研
究重点项目 ( K4112008A212089 )、福建省自然科学基金项目
(2010J01062)、福建省高校杰出青年科研人才培育计划项目
(JA10088)、福建农林大学林学院青年科学基金项目(6112C039U)
和福建省新世纪优秀人才计划项目(JA11070,JA12089)资助.
**通讯作者. E鄄mail: songpinghlj@ 163. com
2013鄄10鄄11 收稿,2014鄄03鄄11 接受.
摇 摇 雷公藤(Tripterygium wilfordii)属卫矛科雷公藤
属植物,是一种珍贵的药用植物,主要分布于我国的
福建、浙江、安徽、江西、台湾等省份.雷公藤甲素,又
名雷公藤内酯醇,是从雷公藤体内分离到的一种环
氧化二萜内酯化合物,具有抗肿瘤、抗白血病、抗风
湿及免疫调节等多种药理活性,是目前我国各种临
床雷公藤制剂的主要活性成分[1-2] . 由于具有良好
的药理活性,加之又是天然生物原料,市场上对雷公
藤的需求量与日俱增.然而,雷公藤内甲素成分含量
极低,加上雷公藤植株生长缓慢,因此远远无法满足
市场需求.
植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居并
对植物不造成实质性危害而与植物建立起和谐联合
关系的微生物[3] .几乎所有被研究植物的内部都存
在着内生细菌,内生细菌与植物的共生体因此被认
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 6 月摇 第 25 卷摇 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jun. 2014, 25(6): 1681-1687
为是自然界中的一种普遍现象[4-5] . 作为植物微生
态系统中的重要组成成分,内生细菌长期生活在植
物体内的特殊环境中并与宿主协同进化,其对宿主
植物的生理生化活动产生重要的影响[6-9] . 研究表
明,一些植物内生细菌扮演着有益生物学角色,它们
可以通过溶磷、固氮、产铁载体、分泌生长素等作用
促进宿主植物的生长,并在植物抗逆境、抗动物摄
食、抗病原菌等方面发挥着重要作用[10-14] .近年来,
随着对植物次生代谢过程研究的不断深入,一些研
究发现在植物体内广泛存在的内生菌可能在其中扮
演着重要角色. 自从 Stierle 等[15]于 1993 年首次从
短叶红豆杉(Taxus brevifolia)中分离出产紫杉醇的
内生真菌以来,国内外学者陆续从不同药用植物体
内筛选出对宿主次生代谢过程具有重要影响的内生
菌.它们不但自身能够产生特殊的活性物质,还能够
参与植物活性成分的合成,或者促进植物次生代谢
产物进行转化,从而为植物源药物的开发生产提供
了新思路[16] .目前为止,尚未见有关雷公藤内生菌
对宿主生长及活性物质生成影响的研究报道. 这与
当前雷公藤作为一种重要中药植物,急需解决其有
效成分含量低以及相关医药产业的发展需求极不
适应.
本文通过对雷公藤内生细菌进行分离,筛选鉴
定具有益生作用的内生细菌,并采用菌苗共生技术,
对目标细菌的实际促生效果及对甲素合成的影响进
行评价,其结果对于建立高效、稳定的雷公藤生长体
系及促进雷公藤药用资源的可持续利用具有重要
意义.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 材料
1郾 1郾 1 样品来源摇 分离内生细菌的雷公藤植株采自
福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室室
外种植基地,雷公藤组培苗为本实验室保藏,二者的
种源地均为福建泰宁.
1郾 1郾 2 主要仪器和试剂 摇 电子天平;PHS鄄2C 酸度
计;高压灭菌锅;智能摇床;冷冻离心机;人工超净
台;日本日立高效液相色谱仪 L鄄2000 系列(L鄄2130
型泵,L鄄2400 型紫外检测器,手动注射器架,浙江大
学智达信息工程有限公司 N鄄2000 色谱数据工作
站). ACC(A鄄3903)购自美国 Sigma 公司;雷公藤甲
素标准品(福建医科大学提供,W逸99. 5% ),甲醇
为色谱纯级;pH 7. 6 与 pH 8. 5 的 0. 1 mol·L-1 Tris鄄
HCl缓冲液;Sackowski显色剂;CAS检测液.
表 1摇 培养基种类
Table 1摇 Culture medium types
编号
No.
培养基
Medium
编号
No.
培养基
Medium
1 有氮培养基 5 DF培养基
2 无氮培养基 6 ADF培养基
3 无机磷培养基 7 1·2-1 MS培养基
4 大豆胨培养基(TSB) 8 NA培养基
1郾 1郾 3 培养基摇 根据不同研究目的,试验所需的培
养基见表 1.
1郾 2摇 雷公藤内生细菌的分离
分别选取健康雷公藤植株的新鲜根、茎和叶,
蒸馏水冲洗干净,晾干后每种各取 3 g,然后用 75%
乙醇表面消毒 1 min, 立即用无菌水反复冲洗 5 次,
再以 0. 1%升汞分别消毒根(2. 5 min)、茎(1 min)
和叶(1. 5 min), 用无菌水冲洗 5 次. 取 100 滋L 最
后一次无菌水冲洗液涂布接种于 NA 培养基上,重
复 3 次,放入培养箱中培养 48 h,观察有无菌落产
生,如无菌落长出, 则证明雷公藤组织表面消毒彻
底.将已消毒的组织晾干后剪碎, 置于灭菌的研钵
中研磨匀浆, 然后将组织匀浆倒入液体 NA 培养基
中,30 益摇床暗培养 36 h. 根据预试验,设置根、茎
和叶 10-5、10-6、10-7、10-8各 4 个浓度梯度, 吸取 50
滋L滴于 NA培养基涂布. 28 益温箱培养 36 h,选取
特征明显不同的单菌落, 反复划线纯化, 并保存.
1郾 3摇 内生细菌的有益生物学特性评价
1郾 3郾 1 氨基环丙烷羧酸(ACC)脱氨酶活性的测定摇
参考 Honma 等[17]的方法,将 1 min 形成 1 滋mol 琢鄄
丁酮酸的量定义为 1 个酶活单位. 蛋白质测定采用
Bradford法,以牛血清蛋白为标准蛋白.
1郾 3郾 2 菌株产生长素测定摇 菌株吲哚乙酸( IAA)的
测定采用 Bric 等[18]的方法.
1郾 3郾 3 菌株固氮能力测定摇 将菌株点接于无氮培养
基,28 益温箱培养,每 3 d转接一次,共转接 5 次,观
察菌落生长情况[19] .
1郾 3郾 4 菌株溶磷能力测定摇 将菌株点接于无机磷培
养基,28 益培养 7 d,观察有无溶磷圈并测定溶磷圈
直径(D)与菌落直径(d)的比值[20],比值为 1 表示
无解磷能力.
1郾 3郾 5 菌株产铁载体定量测定 摇 铁含量测定参考
Schwyn 等[21]的方法,用 CAS 比色法测定,将 A / Ar
比值作为定量指标,A / Ar 比值越小,反映产铁载体
能力越高.参考标准为:A / Ar 0 ~ 0. 2:+++++;A / Ar
0. 2 ~ 0. 4:++++;A / Ar 0. 4 ~ 0. 6:+++;A / Ar 0. 6 ~
2861 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
0. 8:++;A / Ar 0. 8 ~ 1. 0: +.
1郾 3郾 6 菌株平皿促发芽和促生试验摇 挑选饱满的小
麦种子,浸泡在 75%酒精中 1 min 后用无菌水冲洗
干净,表面消毒后放入铺有灭菌滤纸的无菌培养皿
中.促发芽试验每个平皿放 10 粒,促生试验每个平
皿放 200 粒,加入 5mL 菌悬液,菌悬液的浓度约为
107 cfu · mL-1,以加无菌水的处理为空白对照
(CK),每个处理重复 3 次,28 益下黑暗培养,2 d 后
观察种子的发芽情况,一周后测定小麦根长、下胚轴
长[22] .
1郾 4摇 菌落的形态特征观察及菌株鉴定
1郾 4郾 1 将菌株划线接种于 NA 培养基上,30 益培养
4 ~ 5 d,观察菌落形态.
1郾 4郾 2 挑取活化后菌体于 50 滋L TaKaRa Lysis Buffer
for Microorganism to Direct PCR(Code No. D304)中
80 益变性 15 min 后离心取上清作为模板. 使用
TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit
(Code No. D310)进行 PCR扩增目的片段. 50 滋L 的
反应体系中包含:1 滋L 变性反应液、25 滋L PCR
Premix、0. 5 滋L 20 pmol·滋L-1的正向引物、0. 5 滋L
20 pmol·滋L-1的反向引物、23 滋L 16S鄄free H2O,
PCR扩增程序为:预变性,94 益 5 min;循环条件为:
94 益 1 min、 55 益 1 min、72 益 1. 5 min,30 次循环,
最后 72 益延伸 5 min.
摇 摇 取 5 滋L样品进行 3%琼脂糖凝胶电泳,然后使
用 TaKaRa MiniBEST Agarose Ge I DNA Extraction
Kit Ver. 3. 0 (Code No. D823A)切胶回收目的片段
由宝生物公司进行 DNA 测序. 测序结果上传至
Genbank,用 Blast程序与已知的 16S rDNA序列同源
性分析后进行多序列比对,并采用邻接法构建 16S
rDNA基因系统发育树.
1郾 5摇 内生细菌对雷公藤生长及甲素合成的影响
试验
1郾 5郾 1 内生细菌与雷公藤组培苗共生体系的建立摇
将筛出的内生细菌接种于 NA 平板上,30 益培养 1
d,转接到含 50 mLNA液体培养基的 250 mL三角瓶
中,30 益恒温旋转培养 1 d(180 r·min-1),无菌水
稀释调整菌悬液浓度约为 107cfu·mL-1,备用.
选取长势一致的雷公藤 3 代无菌组培苗,在无
菌超净工作台上,采用蘸根处理后移入 1·2-1MS培
养基,每个组培瓶分装 30 mL培养基,每个处理重复
10 次,以不接菌的无菌组培苗为空白对照,光照强
度 1500 lx,光照时间 12 h·d-1,温度(25依2) 益,分
别培养 10、20、30 d后,测定雷公藤组培苗的生物量
及其根、茎、叶中甲素含量.同时,取处理后组培苗的
根、茎、叶,表面消毒后碾碎涂布于 NA培养基,纯化
生长出的菌种,比较与相应加入菌株的异同,若相
同,则表明确实是所加菌株起的作用.
1郾 5郾 2 雷公藤甲素含量的测定 摇 将组培苗 60 益烘
干至恒量,碾碎后称取根、茎、叶粉末各 0. 1 g,甲醇
溶解定容至 3 mL,自然浸提 24 h 后,经 0. 22 滋m微
孔滤头过滤,得到待测液.测定所用色谱柱:XB鄄C18
柱(5 滋m,4. 6 mm 伊 250 mm);流动相 颐 甲醇鄄水
(65 颐 35,体积比);流速设定为 1. 0 mL·min-1;柱
温为室温,进样量为 20 滋L,每个处理重复 3 次.
1郾 6摇 数据处理
采用 Microsoft Excel 2003 软件对数据进行处理
和绘图,采用 SPSS 17. 0 统计分析软件进行差异显
著性分析(LSD法).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 雷公藤植株中内生细菌的分离
从雷公藤组织中共分离到 23 株内生细菌.其中
由叶片分离出 4 株,占总菌株数的 17. 4% ;由茎部
分离出 13 株,占总菌株数的 56. 5% ;由根部分离出
6 株,占总菌株数的 26. 1% (表 2). 可见,内生细菌
在雷公藤植物中普遍存在,且地上部分高于地下
部分.
2郾 2摇 菌株的生物学特性
对雷公藤内生细菌的有益生物学特征进行评
价.由表 3 可知,23 株分离自雷公藤的内生细菌均
能够产生植物生长素( IAA),其中产量较高的菌株
为 LG2、LG3、LG4、LY3、LY4、LJ3、LJ6、LJ10. 从铁载
体指标来看,雷公藤内生细菌中能分泌铁载体的菌
株有 12 株,其中 LY3、LY1、LG4、LG3 具有较高的合
成能力.将内生细菌接于无氮培养基上,发现有 12
株能够生长,表明这些内生细菌具有固氮的能力.而
将内生细菌点种于无机磷培养基后,发现部分菌株
具有溶磷特性,根据溶磷圈比值大小,确定溶磷能力
表 2摇 雷公藤不同部位内生细菌的分离结果
Table 2摇 Separation result of the endophytic bacteria from
different parts of Tripterygium wilfordii
植株部位
Plant part
菌株数
Number of
strains
百分率
Percentage
叶 Leaf 4 17. 4
茎 Stem 13 56. 5
根 Root 6 26. 1
38616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 许进娇等: 雷公藤内生细菌的促生作用及其对雷公藤甲素生成的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 3摇 内生细菌的生物学特性
Table 3摇 Results of growth鄄promoting indices of endophytic
bacteria
菌株
Strain
固氮
Nitrogen
fixation
溶磷
Phosphate
solubili鄄
zation
吲哚乙酸
Indole
acetic acid
(IAA, mg
·L-1)
铁载体
Sidero鄄
phores
ACC脱氨酶
ACC
deaminase
(U·mg-1)
LG1 - 1 1. 0 + -
LG2 + 2 17. 8 + -
LG3 + 1. 4 2. 9 +++ 0. 057
LG4 + 1. 5 13. 5 +++ -
LG5 + 1 2. 2 - -
LG6 + 1. 3 1. 0 + -
LJ1 - 1 1. 0 - -
LJ2 - 1 1. 0 - -
LJ3 + 3. 2 8. 9 ++ -
LJ4 - 1 0. 4 - -
LJ5 - 1 0. 8 - -
LJ6 + 1. 6 9. 8 + -
LJ7 + 1 6. 6 + -
LJ8 - 1 1. 9 - -
LJ9 - 1 2. 5 - -
LJ10 - 2. 3 8. 8 +++ -
LJ11 - 1 0. 3 - -
LJ12 + 2. 3 4. 1 ++ -
LJ13 - 1 1. 2 - -
LY1 + 3 1. 2 ++++ -
LY2 - 1 3. 0 - -
LY3 + 2. 6 15. 8 +++++ -
LY4 + 1 1. 8 - 0. 062
LG: 分离自雷公藤根部的内生细菌 Endophytic bacteria isolated from
Tripterygium wilfordii root; LJ: 分离自雷公藤茎部的内生细菌 Endo鄄
phytic bacteria isolated from Tripterygium wilfordii stem; LY: 分离自雷
公藤叶部的内生细菌 Endophytic bacteria isolated from Tripterygium
wilfordii leaf. 下同 The same below.
高的菌株为 LG2、LY1、LY3、LJ3、LJ10、LJ12. 另外,
以 ACC为唯一氮源的 ADF 培养平板检测发现, 内
生细菌中共有 2 株具有 ACC 脱氨酶活性, 一株为
分离自根部的 LG3, 另一株为来源于叶片 LY4,其
酶活分别为 0. 057 和 0. 062 U·mg-1 .
2郾 3摇 菌株的促发芽和促生长能力
不同雷公藤内生细菌对小麦种子萌发及生长的
影响各不相同. 由表 4 可知,LG1、LG3、LG5、LJ5、
LJ7、LJ10、LJ11、LY3、LY4 等 9 株内生细菌对小麦种
子均有不同程度的促发芽作用,其中 LJ5、LJ7、LJ10、
LJ11、LY3、LY4 的促发芽效果更为明显. 内生细菌
LG1、 LG2、LG3、LG4、LJ1、LJ3、LJ8、LJ9、LJ10、LJ12、
LJ13、LY4 均对小麦胚根长和胚轴长具有明显的促
进作用,其中 LG2、 LG4、 LJ1、 LJ3、 LJ8、 LJ9、 LJ10、
LJ12、LJ13、LY4 的促生长效果尤为明显.
表 4摇 内生细菌对小麦的促生能力
Table 4摇 Growth鄄promoting capacity of endophytic bacteria
on wheat
菌株
Strain
小麦发芽率
Wheat germination
rate (% )
胚轴长度
Hypocotyl length
(cm)
胚根长度
Radicle length
(cm)
LG1 81. 0依4. 6cd 6. 0依1. 2e 7. 9依0. 5e
LG2 64. 0依1. 7fg 9. 1依0. 8c 12. 7依0. 3b
LG3 84. 5依3. 5bc 4. 8依0. 2f 5. 8依0. 6f
LG4 55. 0依1. 7g 7. 6依0. 3d 8. 8依0. 9de
LG5 82. 5依2. 3c 2. 2依0. 2gh 3. 5依0. 1gh
LG6 60. 0依2. 0g 2. 4依0. 3gh 3. 7依0. 2gh
LJ1 69. 0依2. 6ef 9. 1依1. 2c 9. 1依0. 4d
LJ2 78. 0依2. 6d 3. 9依0. 5fg 2. 7依0. 6h
LJ3 65. 5依1. 8f 10. 9依1. 6ab 8. 9依0. 5de
LJ4 70. 0依1. 0ef 1. 0依0. 7h 2. 2依0. 4h
LJ5 85. 0依2. 6bc 3. 0依0. 5g 2. 9依0. 5h
LJ6 71. 5依1. 3e 2. 5依0. 3gh 5. 4依0. 3fg
LJ7 85. 0依2. 6bc 4. 0依0. 5fg 3. 5依0. 4gh
LJ8 60. 0依2. 0g 9. 3依0. 8bc 10. 8依0. 8c
LJ9 73. 0依2. 0e 10. 5依1. 0b 11. 0依2. 2c
LJ10 95. 5依1. 8a 11. 7依0. 5ab 14. 5依1. 2a
LJ11 85. 0依2. 6bc 3. 1依0. 8g 3. 6依0. 3gh
LJ12 64. 0依2. 6fg 11. 9依1. 1a 12. 1依0. 5bc
LJ13 75. 0依2. 6de 11. 1依0. 6ab 9. 5依0. 4d
LY1 66. 0依2. 6f 2. 5依0. 2gh 2. 4依0. 3h
LY2 71. 0依1. 0e 3. 1依0. 2g 5. 6依1. 1fg
LY3 87. 0依2. 0b 1. 6依1. 2h 2. 8依0. 5h
LY4 95. 0依2. 6a 6. 6依0. 3de 7. 6依0. 5e
对照 CK 80. 0依1. 7cd 4. 2依0. 1fg 4. 4依0. 2g
同列不同字母表示差异显著(P<0. 05) Different letters in the same
column meant significant difference at 0. 05 level.
2郾 4摇 菌落形态特征及菌种鉴定结果
综合内生细菌有益生物学特性和促生能力的研
究结果,选择 LG3、LJ10、LY4 等 3 株内生细菌作为
目标菌株,对其做进一步的研究. 菌株 LJ10 单菌落
呈圆形凸起,边缘整齐,表面光滑,为黄色的中型菌
落;菌株 LG3 单菌落边缘整齐,表面湿润光滑,为灰
白色的小型菌落;LY4 单菌落呈圆形,边缘整齐,为
表面湿润的乳白色中型菌落. 采用 16S rDNA 细菌
鉴定方法,对 3 株筛选出的内生细菌进行 PCR 扩增
和 DNA 测序(登陆号: KC759398. 1、KC759399郾 1、
KC759400. 1),并在 GenBank中进行 Blast比对分析
(表 5),同时通过邻接法构建 LG3、LJ10、LY4 等 3
株内生细菌与 GenBank中序列同源度较高微生物的
系统发育树,进行系统发育分析(图 1),结果表明,
LG3和 LY4 分别与阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloa鄄
cae)和肠杆菌属(Enterobacter sp. )的相似度达到了
99%,而 LJ10与泛菌属的 Pantoea eucrina的相似度达
到了 99% .
4861 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 5摇 雷公藤内生细菌的鉴定结果
Table 5 摇 Critical results of endophytic bacteria isolated
from Tripterygium wilfordii
菌株
Strain
登录号
Accession No.
最高相似度菌株
Most similar strain
相似度
Similarity
(% )
LG3 KC759398. 1 E. cloacae subsp.
(GU191924. 1)
99
LJ10 KC759399. 1 Pantoea eucrina
CT194 (HQ455824. 1)
99
LY4 KC759400. 1 Enterobacter sp. WAB1915
(AM184256. 1)
99
图 1摇 具有促生能力的雷公藤内生细菌菌株的 16S rDNA系
统发育树
Fig. 1摇 Neighbor鄄joining tree showed phylogenetic relationships
among 16S rDNA sequences of growth鄄promoting endophytic bac鄄
teria.
2郾 5摇 内生细菌对雷公藤组培苗生长的影响
将筛选出的 3 株内生细菌回接于雷公藤组培
苗,构建菌苗共生体,研究内生细菌对宿主雷公藤的
促生影响(图 2). 结果发现,在接菌初期(10 d),由
于植物与内生菌尚处于相互适应阶段,3 株细菌的
促生效果并不明显,生长最好的为接种 LJ10 菌株的
组培苗,平均质量增加 0. 67 g,而无菌雷公藤组培苗
(对照)平均增加 0. 47 g.随着内生细菌在雷公藤体
内定殖时间的延长,其逐渐适应了植物体内的生长
图 2摇 接菌后雷公藤植株的鲜质量
Fig. 2摇 Fresh mass of Tripterygium wilfordii after inoculation.
图 3摇 接菌 30 d雷公藤植株的生长情况
Fig. 3摇 Growth situation of Tripterygium wilfordii 30 days after
vaccination.
环境,促生效果逐渐显现,接菌处理 30 d 后,3 株内
生细菌均不同程度地促进了雷公藤组培苗的生长,
其中促生效果最好的依然是 LJ10 菌株,经该菌株接
种的雷公藤组培苗长势良好,根系发达,平均质量增
加 3. 97 g,是空白对照的 1. 63 倍(图 3);而接种
LY4 的组培苗也具有明显的生长优势,平均质量增
加为对照的 1. 36 倍;LG3 的促生能力相对较弱,平
均质量增加为对照的 1. 16 倍.将试验组雷公藤组培
苗表面消毒后碾碎涂布于 NA 培养基,经纯化后所
得菌株与 1. 5. 1 中相对应的接种菌株一致. 即仍为
LG3、LJ10、LY4.
2郾 6摇 内生细菌对雷公藤甲素生成的影响
由图 4 可知,雷公藤不同器官内甲素的含量因
内生细菌种类及接种时间的不同而呈现出不同的变
化趋势.对雷公藤根部而言,LG3 菌株对甲素含量的
影响最大,在接种 20 d 时甲素含量达到了峰值
(9郾 80 滋g·g-1),为对照峰值的 9. 27 倍,而 LY4 和
LJ10 菌株对根部雷公藤甲素的含量影响不大,仅略
高于对照;雷公藤茎部甲素的含量则受 LJ10 菌株的
影响较大,在接种 10 d 时达到了峰值 ( 1郾 63
滋g·g-1),为对照峰值的 1. 75 倍,其次为 LY4 菌株,
在接种 10 d时达到峰值 1. 33 滋g·g-1,为对照峰值
的 1郾 43 倍,接种 LG3 菌株的茎部甲素含量则在初
期小于对照,在后期略高于对照;雷公藤叶部甲素含
量受LJ10和LY4菌株的影响较大,接种10 d时二
58616 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 许进娇等: 雷公藤内生细菌的促生作用及其对雷公藤甲素生成的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 雷公藤不同器官甲素含量菌株的变化
Fig. 4摇 Triptolide content from different organs.
a)根 Root; b)茎 Stem; c)叶 Leaf.
者的甲素含量达到最高值 2. 14 和 1. 14 滋g·g-1,是
对照峰值的 3郾 94 和 2. 10 倍,而 LG3 菌株则在接种
后期对叶部甲素含量略有促进作用.
3摇 讨摇 摇 论
内生细菌是蕴藏在植物体内的一类重要微生物
资源,对植物的生长发育具有重要的调控作用.本研
究从雷公藤中分离出 23 株内生细菌,对其有益生物
学特征及小麦发芽能力进行评价,发现大多数细菌
都具有一定的促生特性. 选取 LG3、LJ10 和 LY4 等
株内生细菌进行研究,主要是由于 LJ10 菌株具有较
好的溶磷、产生 IAA 和铁载体的能力,并且与其他
菌株相比,对小麦发芽促生的效果最好; LG3 和
LY4 除了具有较好的促生表现以外,还具有 ACC 脱
氨酶活性,能降低植物体内乙烯合成,促进植物根和
茎伸长生长,提高养分吸收及光捕获面积,促进植物
的生长.回接试验结果表明,3 株内生细菌均能促进
雷公藤组培苗的生长,并且与小麦发芽试验类似,仍
然是 LJ10 菌株对雷公藤组培苗的促生效果最好.产
生这种结果的原因可能是与另外两株细菌相比,
LJ10 菌株在 IAA 生成及溶磷能力方面具有明显的
优势,而 LG3 与 LY4 虽然具有能产生 ACC 脱氨酶
的优势,但对雷公藤生长并没有明显的影响或是酶
活性太低,没有产生明显的促生效应. 另外,内生细
菌除了可以利用自身的固氮溶磷、产生铁载体和合
成植物生长激素等益生功能直接促进宿主植物的生
长发育外,还可以通过改善植物对矿质营养元素的
吸收利用率,以及提高植物对不利环境条件的抵抗
能力等方式间接促进植物生长[23-25] .因此 3 株内生
细菌对雷公藤促生能力的差别,除了受上述直接因
素影响以外,也可能与这些菌株在改善雷公藤组培
苗吸收养分等间接促生因素方面存在差异有关.
除了促生作用以外,内生菌对宿主植物特别是
药用植物次生代谢的影响也一直是国内外关注的热
点.目前,包括红豆杉、薄荷及大戟等在内的多种药
用植物体内都被证明存在着促进次生活性产物生成
的内生菌[15,26-27] .本研究所筛选的 3 株促生内生细
菌虽然都能促进雷公藤体内主要活性成分雷公藤甲
素的生成,但在不同器官内各菌株的影响程度有所
不同.植物体是一个复杂的微生态环境,不同器官可
以看作是生存条件迥然不同的生态位,而一些微生
物之所以能在某一器官成功定殖生存,说明该器官
是植物体内最适合这些微生物生长及功能发挥的部
位.本研究中 LG3 菌株对雷公藤根部的甲素生成具
有最好的促进作用,而该菌株又恰好是从雷公藤根
部分离得到的,这说明根部是 LG3 的适合生态位,
在该部位 LG3 能充分发挥其对宿主的影响,可以明
显提升甲素的生成. 而对茎叶器官中甲素含量影响
较大的 LJ10 和 LY4 分别是从茎、叶器官中分离得
到的,因此这两株内生细菌对其寄居部位的甲素生
成也有较好的促进作用,特别是 LJ10 菌株不但能快
速促进雷公藤植株的生长,也可以在较短时间内提
高雷公藤甲素的生成,说明该菌株与雷公藤植物之
间具有良好的适应性. 内生菌可通过不同方式对植
物次生代谢施加影响.例如,一些内生菌在与宿主植
物长期互惠共生时通过相关基因的直接传递,获得
了产生与宿主相同或相似次生代谢产物的能力,从
而促进了该类次生物质在植物体内的含量;还有一
些内生菌能够产生催化作用的酶或代谢前体物,进
而改变宿主内某一反应的方向来影响植物次生代谢
产物的合成[28] .而本研究中 3 株内生细菌究竟是如
何提高雷公藤甲素生成的还有待于进一步研究. 另
外,作为雷公藤的主要活性成分,雷公藤甲素在植物
6861 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
体内主要分布在根部已被文献所证实[29] .本研究再
次证实了这一点,即无论接种内生细菌与否,雷公藤
甲素在根部的含量都是最高的.
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作者简介摇 许进娇,女,1988 年生,硕士研究生.主要从事植
物地理学研究. E鄄mail: jojo. xu@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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