全 文 ：假单胞菌菌株 CTN鄄3 对百菌清污染土壤
的生物修复*
王光利1,2 摇 陈宏宏1 摇 毕摇 萌1 摇 李顺鹏1**
( 1南京农业大学生命科学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室, 南京 210095; 2淮北师范大学生命科学学院资源植
物学安徽省重点实验室, 安徽淮北 235000)
摘摇 要摇 百菌清被美国环境保护署列为优先控制污染物,利用微生物的降解作用修复被污染
的土壤、清除环境中的污染物等具有重要的现实意义.假单胞菌(Pseudomonas sp. )菌株 CTN鄄
3 是一株从污染土壤中分离得到的百菌清降解菌,考察了其在实验室条件下对百菌清污染土
壤的生物修复能力及其影响因素.结果表明: 降解菌株在灭菌土壤中的降解效果略好于未灭
菌土壤;在外源添加降解菌 106 CFU·g-1、温度 15 ~ 30 益和 pH 5. 8 ~ 8. 3 条件下,该菌株能有
效降解土壤中 10 ~ 200 mg·kg-1的百菌清.菌株 CTN鄄3 在百菌清污染土壤的生物修复中具有
良好的应用前景.
关键词摇 百菌清摇 假单胞菌摇 生物修复摇 影响因素
文章编号摇 1001-9332(2012)03-0807-05摇 中图分类号摇 X53, X172摇 文献标识码摇 A
Bioremediation of chlorothalonil鄄contaminated soil by utilizing Pseudomonas sp. strain CTN鄄
3. WANG Guang鄄li1,2, CHEN Hong鄄hong1, BI Meng1, LI Shun鄄peng1 ( 1 Ministry of Agriculture
Key Laboratory of Microbiological Engineering Agricultural Environment, College of Life Science,
Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Anhui Province Key Laboratory of Plant
Resources and Biology, College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, An鄄
hui, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(3): 807-811.
Abstract: Chlorothalonil is the priority organic pollutant listed by the U. S. Environmental Protec鄄
tion Agency. To utilize the function of microbial degradation in the bioremediation of chlorothalonil鄄
contaminated soil is of practical significance. In this study, a chlorothalonil鄄degrading Pseudomonas
sp. strain CTN鄄3 isolated from pesticide鄄contaminated soil was used to examine the chlorothalonil鄄
degrading capacity of the strain and related affecting factors in a microcosm. In sterilized soil, the
effect of CTN鄄3 on chlorothalonil degradation was better than that in unsterilized soil. Various fac鄄
tors, including soil pH, temperature, initial chlorothalonil concentration, and inoculum size, af鄄
fected the degradation of chlorothalonil by the strain. With the inoculum size of 106 CFU·g-1soil,
the CTN鄄3 at 15-30 益 and pH 5. 8-8. 3 could effectively degrade 10-200 mg·kg-1 of chlorotha鄄
lonil, suggesting that the strain CTN鄄3 had great potential in the bioremediation of chlorothalonil鄄
contaminated soil.
Key words: chlorothalonil; Pseudomonas sp. ; bioremediation; affecting factor.
*国家自然科学基金项目(31100083,31070100)和中国热带农业科
学院环资所重大专项(2010hzszdzx001)资助.
**通讯作者. E鄄mail: lsp@ njau. edu. cn
2011鄄04鄄23 收稿,2011鄄12鄄08 接受.
摇 摇 百菌清(四氯间苯二腈)是一种广谱的氯代苯
芳香族化合物杀菌剂,在环境中较稳定,残效期长,
且具有明显的蓄积毒性,被美国环境保护署列为人
类潜在的致癌物质.其在农业生产中使用已 30 年之
久.在美国,百菌清是使用第二多的杀菌剂,年使用
量为 5000 t[1],我国百菌清年产量超过 8000 t.百菌
清主要用于防治蔬菜、瓜果、花生、水稻、小麦等作物
病害[2] .由于其使用广泛,土壤、水体、温室大棚气
体和农产品中均可检测到百菌清[3-6],其污染修复
是科研工作者关注的话题.
百菌清可以通过光化学和臭氧等方法降
解[7-9],然而这些方法成本较高,不适合于面源污染
的修复.微生物是环境中污染物降解的主力军,利用
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 3 月摇 第 23 卷摇 第 3 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Mar. 2012,23(3): 807-811
微生物或酶进行污染环境的修复被公认为是一种安
全、有效、廉价和无二次污染的方法,具有广阔的应
用前景.因此,研究百菌清农药的微生物降解与修复
具有重要的意义. Zhang 等[10]报道了一株蜡样芽胞
杆菌(Bacillus cereus)NS1 可以共代谢降解低浓度的
百菌清. Sato 等[11]发现,百菌清在土壤含水量为
60% 、温度为 30 益时可以发生快速降解,并同时发
现土壤中许多细菌也能够降解百菌清. Motonaga
等[12]分离到百菌清降解菌 TBI,能在外加碳源的情
况下将百菌清降解为羟基鄄三氯苯二腈(TPN鄄OH)和
Cl- . 尽管百菌清在土壤中的代谢已有一些报
道[11,13-15],但相关菌株仅能以共代谢的方式降解低
浓度的百菌清(臆0郾 5 mg·L-1 ) [10,16],而不依赖于
外加碳源的高效百菌清降解菌的微生物修复还未见
报道.本实验室在前期工作的基础上分离到 16 株百
菌清降解菌[17-20],本文选取其中降解效率最高的菌
株 CTN鄄3 作为研究对象,在实验室模拟条件下,研
究各种环境因子对其修复百菌清污染土壤效率的影
响,旨在为其在生物修复中的应用提供理论依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试土壤
中性土壤采自南京农业大学校园内菜园表层土
(0 ~ 15 cm),为棕壤土,pH 6郾 9,有机质含量 20郾 8
g·kg-1 .碱性土壤采自河南濮阳南乐县菜园表层土
(0 ~ 15 cm),为碱土, pH 8郾 0 ~ 8郾 5,有机质含量
16郾 8 g·kg-1 .酸性土壤采自福建漳州菜园土,为赤
红壤,pH 5郾 5 ~ 6郾 0,有机质含量 25郾 58 g·kg-1 . 以
上土壤均未使用过百菌清,土壤经风干、过筛 (5
mm),备用.
1郾 2摇 供试菌液
菌株 CTN鄄3 属假单胞菌属(Pseudomonas sp郾 ),
由本实验室从长期受百菌清污染的土壤中分离得
到,能不依赖于外加碳源在 12 h内几乎完全转化 20
mg·L-1的百菌清[18] .
菌悬液的制备:将 CTN鄄3 接种在 LB 液体培养
基中,于 30 益180 r·min-1摇床培养至对数生长后
期,6000 r·min-1离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液
洗涤 2 次,再用磷酸盐缓冲液重悬控制菌体浓度至
所需浓度备用.
1郾 3摇 试验设计
将百菌清按 104mg·L-1的浓度配成甲醇溶液
备用. 将供试土壤装入盆(上口径 8郾 5 cm、下口径
5郾 0 cm,高 7郾 5 cm)中,每盆 0郾 1 kg,加入 4 mL水,使
土壤中含水量达到 40% (V / W)左右.
1郾 3郾 1 CTN鄄3 对灭菌和未灭菌土壤百菌清降解的影
响试验摇 分别向灭菌和未灭菌土中施 50 mg·kg-1
百菌清,并加入 106 CFU·g-1菌剂 CTN鄄3,以不加农
药和菌剂 CTN鄄3 及加农药和灭活菌剂为对照.置于
30 益的恒温培养箱中培养.
1郾 3郾 2 土壤 pH对 CTN鄄3 降解百菌清的影响试验摇
分别向采自不同地区不同 pH 值的土样中加入 50
mg· kg-1 百菌清,均匀加入 106 CFU · g-1 菌剂
CTN鄄3,对照不加菌剂. 置于 30 益的恒温培养箱中
培养.
1郾 3郾 3 温度对 CTN鄄3 降解百菌清的影响试验摇 将加
有 50 mg·kg-1百菌清和 106 CFU·g-1菌剂 CTN鄄3
的供试土壤分别置于 15、20、25、30、35 和 40 益的恒
温培养箱中培养,对照不加菌剂.
1郾 3郾 4 接种量对 CTN鄄3 降解百菌清的影响试验摇 将
加有 50 mg·kg-1百菌清的供试土壤均匀地加入
104、105、106、107 和 108 CFU·g-1菌剂 CTN鄄3,置于
30 益的恒温培养箱中培养.
1郾 3郾 5 农药初始浓度对 CTN鄄3 降解百菌清的影响试
验摇 向加有 10、20、50、100、150 和 200 mg·kg-1百
菌清的供试土壤中均匀地加入 106 CFU·g-1菌株
CTN鄄3,置于 30 益的恒温培养箱中培养.
以上试验均 3 次重复,土壤含水量保持在 40%
(V / W)左右,黑色薄膜封口,避免农药的光解,留有
少许气孔,以维持水分并通气.期间每日取 5郾 0 g 土
壤样品进行分析.
1郾 4摇 土壤中百菌清的提取与测定
土壤中百菌清的提取参照 Motonaga 等[12]的方
法并作改进:将含有百菌清的土壤风干,称取土壤
5郾 0 g,加入 10 mL 丙酮 /水混合溶剂(V / V = 1 颐 1)
静止 30 min,充分混匀 5 min,将悬浊液过滤. 取 5
mL的过滤液分别用 5 mL 二氯甲烷提取 3 次,在室
温下用旋转蒸发器浓缩至干. 用色谱纯的甲醇溶解
后,用孔径 0郾 25 滋m 的有机相针头过滤器过滤,用
气相色谱法测定土壤样品中百菌清的含量. 气相色
谱测定条件:GC鄄14B 气相色谱仪,ECD 检测器,25
m长、大口径石英毛细管柱作为分离柱. 空气:50
mL·min-1;氢气: 40 mL·min-1;载气 ( N2 ): 150
mL·min-1;补偿气(N2):25 mL·min-1;检测器温
度:250 益;柱温:250 益;进样口温度:190 益;进样
量:1郾 0 滋L;正己烷作为溶剂,外标法按峰面积定量.
百菌清在土壤中的最小检测限为 1郾 0 伊 10-3
mg·kg-1 .
808 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
1郾 5摇 数据处理
试验数据采用 DPS V2郾 00 版软件进行统计分
析和显著性检验.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 CTN鄄3 对灭菌和未灭菌土壤中百菌清的降解
降解菌能否在自然条件下充分发挥其降解功
能,是该菌株能否真正走向大田应用的关键.从图 1
可以看出,空白处理中未检测到百菌清,表明供试土
壤中不存在百菌清,因此没有干扰试验结果的物质
存在;对照处理中,百菌清有所降解,但降解速度缓
慢,4 d降解率约为 20% ,表明百菌清在土壤中的自
然降解较慢.在灭菌土和未灭菌土中百菌清都有较
快的降解,能够在 5 d内几乎完全降解 50 mg·kg-1
百菌清,且灭菌土的降解速率比未灭菌土高.这可能
是由于土壤中的土著微生物对外源微生物有一定的
竞争抑制作用.
2郾 2摇 土壤 pH值对百菌清降解的影响
从图 2 可以看出,菌株 CTN鄄3 能够在 5 d 内较
好地降解不同 pH类型的土壤,且在 pH 6郾 9 土壤中
的降解速率较快,这和 Liang等[19]有关菌株 CTN鄄11
降解液体中百菌清的研究结果类似.表明 CTN鄄3 能
够对接近中性的土壤进行较好的生物修复,完全降
解土壤中的百菌清.
2郾 3摇 温度对百菌清降解的影响
从图 3 可以看出,菌株 CTN鄄3 在 15 ~ 40 益温度
条件下修复百菌清污染土壤时,前 5 d 降解速度较
快,降解率在 46% ~ 99% ;之后,高于 30 益温度条
件下百菌清降解缓慢,这可能与菌株CTN鄄3在高于
图 1摇 灭菌和未灭菌土壤中百菌清的降解
Fig. 1 摇 Degradation of chlorothalonil in the sterilized and un鄄
sterilized tested soils.
CK:对照 Control; 玉:未灭菌土+灭活菌 Unsterilized tested soil with
sterilized CTN鄄3; 域:灭菌土+降解菌 Sterilized tested soil with CTN鄄3;
芋:未灭菌土+降解菌 Unsterilized tested soil with CTN鄄3郾
图 2摇 土壤 pH值对 CTN鄄3 降解土壤中百菌清的影响
Fig. 2摇 Effect of soil pH on bioremediation of chlorothalonil in
the soil by CTN鄄3.
图 3摇 土壤温度对 CTN鄄3 降解百菌清的影响
Fig. 3摇 Effect of soil temperature on chlorothalonil degradation
by strain CTN鄄3.
30 益温度条件下的存活时间短、活性下降快有关.
在温度低于 30 益时,温度越低降解速率越慢,在 15
益时需要 10 d 才能完全降解. 表明菌株 CTN鄄3 在
15 ~ 30 益条件下能够对百菌清污染土壤进行较好
的生物修复,而高于 30 益时,其生物修复作用受到
抑制.
2郾 4摇 接种量对百菌清降解的影响
从图 4 可以看出,人工接种降解菌可以有效地
去除土壤中百菌清的残留,接种量越大,降解效果越
好.接种量与降解速率呈一定的正相关.在实际应用
中,考虑到成本,选择接入 106 CFU·g-1的降解菌,
就可达到较为理想的修复效果.
2郾 5摇 农药初始浓度对百菌清降解的影响
从图 5 可以看出,菌株 CTN鄄3 对 10 ~ 100
mg·kg-1浓度的百菌清具有较好的降解效果,而对
高于 100 mg·kg-1的百菌清降解效果稍逊. 当农药
浓度达到 200 mg·kg-1时,未投加降解菌的土壤中
10 d农药的自然降解率仅为16郾 0% ,而投加降解
9083 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王光利等: 假单胞菌菌株 CTN鄄3 对百菌清污染土壤的生物修复摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 接种量对 CTN鄄3 降解百菌清的影响
Fig. 4摇 Effect of inoculum size on chlorothalonil degradation by
strain CTN鄄3.
图 5摇 农药初始浓度对 CTN鄄3 降解百菌清的影响
Fig. 5摇 Effect of initial chlorothalonil concentration on its degra鄄
dation by CTN鄄3.
菌的土壤中农药的残留量仅为 60郾 12 mg·kg-1,生
物强化降解率达到 54% ,降解率提高了 3郾 38 倍.
3摇 讨摇 摇 论
污染物在土壤中的残留受到许多因素的影响,
如土著微生物的竞争作用、环境温度、pH值、接种量
和污染物的浓度等,这些因素决定着接种菌剂是否
能够在环境中发挥作用.本研究结果表明,接种菌株
CTN鄄3 能够克服土著微生物的竞争效应,在非灭菌
的风干土壤中发挥生物强化作用. 土壤 pH 对降解
有毒污染物有重要影响,因为其可能影响土著微生
物的生长代谢[21],也可能使污染物不稳定[19] .本研
究中 CTN鄄3 能够较好地降解 3 种不同 pH 类型的土
壤.温度是另一个影响生物修复效率和程度的非生
物因素,Leahy等[22]研究表明,降解率通常会随温度
的降低而降低.本研究中也出现了类似的现象,菌株
CTN鄄3 对百菌清的降解最适温度为 30 益,而常温
25 益下虽然其降解效率有所下降,但也具有较好的
修复效果.接种量是决定生物修复效果的重要因素.
合适的接种量不仅可以增加生物修复成功的几
率[23],而且可以减少成本支出[24-26] . 本研究结果表
明,当接种量为 106CFU·g-1时,可以很好地降解百
菌清.污染物的浓度对微生物降解活性有着很大的
影响.当百菌清的浓度低于 100 mg·kg-1时,菌株
CTN鄄3 能够完全降解百菌清. 当农药浓度高于 100
mg·kg-1时,土壤中会有部分百菌清残留,这可能是
由于百菌清降解过程中所累积的代谢产物羟基化百
菌清[18],对土壤微生物有一定的毒害作用,从而影
响到对百菌清的彻底降解.
到目前为止,能够降解羟基化百菌清的纯培养
物还未见报道[19] . 因此,在后续研究中,分离、筛选
能够矿化百菌清或能进一步降解羟基化百菌清的微
生物菌种资源或构建多功能百菌清降解菌株,对于
百菌清污染土壤的生物修复具有重要的意义.
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作者简介 摇 王光利,男,1978 年生,博士,讲师. 主要从事环
境污染物的微生物降解与修复研究,发表论文近 20 篇.
E鄄mail: wanf鄄3344@ 163. com.
责任编辑摇 肖摇 红
1183 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王光利等: 假单胞菌菌株 CTN鄄3 对百菌清污染土壤的生物修复摇 摇 摇 摇 摇