全 文 ：中图分类号:R114 文献标识码:B 文章编号:1002 － 3127(2013)01 － 0075 － 03 ·短篇报道·
假单胞菌产蓝色素粗提物的三项毒性试验
吴向华，吴雨龙
(南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171)
关键词:假单胞菌;蓝色素;提取;毒性
基金项目:林业总局公益性行业科研专项经费(200904001)
作者简介:吴向华，博士，讲师，研究方向:微生物的教学与研究。
色素是指能够使被媒染物着色的物质，也称为着色
剂。目前，国内外使用的色素有化学合成和天然 2 种，
均已广泛用于食品着色剂、日用化妆品及饲料添加剂等
方面［1］。合成色素由煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯
胺等芳烃类化合物为原料进行合成，都有程度不同的毒
性。随着科学技术的发展和人类对自身健康的重视以
及对合成色素危害性认识的逐步加深，天然色素的优点
越来越受到重视。蓝色素是重要的基本色素之一，国际
上被正式批准生产的天然蓝色素种类很少，而用微生物
发酵生产蓝色素更少［2］。本研究对从盐土中分离获得
的 1 株产蓝色素假单胞菌所产的蓝色素进行分离。通
过液体发酵获得的粗品，并对其进行了毒性研究。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1. 1． 1 试验菌种:假单胞菌 (Pseudomonadaceae)
NJYS-02，由南京晓庄学院生物化工与环境工程学院动
植物检验检疫教研室筛选、分离、保藏。
1. 1． 2 培养基:PDA 固体培养基和 PDA 液体培养基。
1. 1． 3 试验动物:昆明种小鼠(Ⅱ级)150 只，动物合
格证号:CXK 苏 2007700001，体重 18 ～ 25 g，由南京盛
民科研动物养殖场提供。
1. 1． 4 试验仪器与试剂:尼康 50I 荧光显微镜(日
本) ，超声波清洗仪(KQ． 250B，江苏省昆山市超声仪
器有限公司) ，旋转蒸发仪(RE-5299，上海雅荣生化仪
器设备有限公司) ，试剂均为分析纯。
1． 2 方法
1． 2. 1 蓝色素的制备 (1)菌株的液体发酵。在 PDA
固体斜面上加入无菌水，将菌苔洗下，转接到装液量为
80 ml /250 ml 三角瓶 PDA 液体培养基的中，30 ℃下
培养 2 ～ 3 d，取长势较好的发酵液(表现为深蓝色)作
为种子液备用［3］。以 2%的接种量接种到 150 ml /500 ml
的三角瓶中 30℃下扩大培养 3 d，待形成色素后，备
用。(2)色素提取方法。将 50 ml 发酵液在 4 000 rpm
下离心 15 min，弃上清液，在沉淀物中加入乙酸 5 ml，
用旋涡混合器将其混匀，然后在 200 W 超声波清洗器
中振荡 0. 5 h，将振荡液在 4 000 rpm 下离心 15 min，得
到色素的乙酸溶液。若仍有色素残留在细胞残渣中，
可重复上述操作步骤，直至不再能提取出色素为
止［2，4］。将所得到的乙酸溶液真空干燥，即得到蓝色
素的粗提物。(3)色素纯度测定。将发酵液稀释 10
倍，580 nm 处测得吸光度(A)值 0. 50，即发酵液色价 A
值 5. 0。发酵液离心去上清，破壁，沉淀物冷冻干燥后
获色素粗品。色素的粗品色价(0. 2%的醇溶液)A 值
0. 95。
1． 2. 2 经口急性毒性试验:取 50 只精神状态良好的
小鼠，雌雄各半，在室温(22 ± 3)℃，湿度 30% ～ 70%，
自由摄食、饮水的饲养条件下，适应性饲养 5 d 后，随
机分成 5 组，每组 10 只，其中第Ⅰ ～Ⅳ组为试验组，第
Ⅴ组为空白对照组，正式给药前禁食 8 h，不禁水。称
重各个小组小鼠体重，记录。采用改良寇氏法，根据预
试验 的 剂 量，分 别 以 16 000、8 000、4 000 和
2 000 mg /kg，4 个不同剂量组进行灌胃，分 3 次灌胃给
予受试物，间隔 8 h。空白对照组分 3 次灌服相同体积
的生理盐水。给药后正常饲养，连续观察 14 d。每天
观察小鼠的进食、活动、大小便、精神等全身反应状况
及死亡情况，并及时记录。第 14 天时称重各组小鼠体
重后，剖检存活小鼠，观察主要脏器是否有病变［5-6］。
1． 2. 3 小鼠精子畸形试验:(1)剂量与分组。取精神
状态良好的雄性小鼠 50 只，随机分为 5 组，每组 10
只，设阴性对照组、阳性对照组和 3 个试验组。试验组
采用蓝色素粗品经灌胃染毒，染毒剂量分别为低剂量
组:2 000 mg /kg;中剂量组:9 000 mg /ml;高剂量组:
16 000 mg /kg。每天按时给药，连续 5 d，阴性对照组灌
·57·毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 J Toxicol February 2013 Vol. 27 No. 1
DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2013.01.014
服同体积生理盐水，阳性对照组采用环磷酰胺 20 mg /kg
腹腔注射，每天 1 次，连续 5 d。(2)试验方法。于染
毒后第 35 天取样，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取出二
侧副睾，放入盛有 1 ml 磷酸盐缓冲液的平皿中。用眼
科剪将副睾剪碎，静止 3 ～ 5 min 后轻轻摇动。用四层
擦镜纸滤去组织碎片［5-6］。滤液以 1000 r /min 离心
5 min，去除大部分上清液，剩约 0. 5 ml 液体与沉淀物
摇匀后，用滴管吸取 1 滴将其滴于洁净的载玻片上，涂
片，每只小鼠涂 5 张玻片，在空气中干燥后，用甲醇固
定 5 min。干燥后用 2%伊红染色 1 h，用水轻冲，干燥
备检。每张玻片需计数 1000 个精子，取其平均值，精
子畸形率按下式计算［5］:
精子畸形率(%)=精子畸形总数 /检查精子总数
× 100
1． 2. 4 小鼠骨髓细胞微核试验:(1)剂量与分组。取精
神状态良好的小鼠 50 只，雌雄各半，随机分为 5 组，每
组 10 只，设阴性对照组、阳性对照组和 3 个试验组。
其中阴性对照组经口灌服生理盐水，阳性对照组采用
环磷酰胺 45 mg /kg 腹腔注射。3 个试验组分别按
2000、9000 和 16000 mg /kg 进行灌胃给药。连续给药
2 次，间隔 24 h。(2)试验方法。在第 2 次给予受试药
物后 6 h，将小鼠脱颈处死，取小鼠两侧股骨，剔去肌
肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉碎片，剪去股骨两
端，用注射器吸取小牛血清约 0. 05 ml 反复冲洗骨髓
腔数次［7］。将冲洗液滴在载玻片上推片。每个股骨
推片 5 张，自然干燥。在干燥的玻片上滴加 1 滴甲醇，
自然干燥。将固定好的涂片用 1∶ 10 的姬姆萨氏-磷酸
盐缓冲液(pH = 6. 4)染色 25 min，用蒸馏水冲洗，干燥
备检。嗜多染红细胞(PCE)呈灰蓝色，成熟正染红细
胞呈红色。每只小鼠需计数 1000 个嗜多染红细胞，并
计算含微核的嗜多染红细胞数，取其平均值，在一个细
胞中出现 2 个或多个微核，仍按 1 个微核细胞计算。
微核率按下式计算［8］，并以千分率表示:
嗜多染红细胞微核率(‰)= 含微核的嗜多染红
细胞数 /嗜多染红细胞总数 × 1000
1 ． 3 统计学方法 采用 SPSS 10. 0 软件进行分析，计
算(x ± s )并进行 t 检验，显著性水准为 α = 0. 05。
2 结果
2. 1 经口急性毒性试验结果 在灌服不同浓度的蓝
色素粗品后各组小鼠外观特征基本正常，未见毛色差、
精神萎靡、毛松等异常表现，也未见耳、眼、口、鼻有异
样分泌物，呼吸道反应正常，未见咳嗽、哮喘现象，四肢
活动和走动正常，试验组与对照组各小鼠状态无明显
差异，各组小鼠未见死亡。整个试验过程中未见小鼠
出现明显的中毒症状。各组小鼠平均体重呈增长趋
势，实验组与对照组相比差异。剖检存活小鼠可以看
出实验组与对照组相比主要内脏器官均未出现肉眼可
见的明显病变无统计学意义(P ＞ 0. 05)。
2. 2 小鼠精子畸形试验结果 于最后 1 次染毒后第
35 天将小鼠全部处死，取附睾精子涂片，计算精子畸
形率。各剂量组与阴性对照组相比差异无统计学意义
(P ＞ 0. 05) ，各剂量组与阳性对照组相比差异有统计
学意义(P ＜ 0. 05) ，各个剂量组之间差异均无统计学
意义(P ＞ 0. 05)。
2. 3 小鼠骨髓细胞微核试验结果 于第 2 次染毒后
6 h 将各组小鼠全部处死，取骨髓细胞液涂片，镜检并
计算微核率，由表 1 可知，各剂量组与阴性对照组相比
差异无统计学意义(P ＞ 0. 05) ，各剂量组与阳性对照
组相比差异有统计学意义(P ＜ 0. 05) ，各个剂量组之
间差异均无统计学意义(P ＞ 0. 05)。
表 1 小鼠微核试验结果(珋x ± s)
组别
剂量
(mg /kg)
检测 PEC 数
(n)
微核率
(‰)
试验组 1 2 000 10 000 2. 8 ± 1. 31 #＊＊
试验组 2 9 000 10 000 3. 2 ± 1. 42 #＊＊
试验组 3 16 000 10 000 3. 4 ± 1. 56 #＊＊
阴性对照组 — 10 000 2. 7 ± 0. 82
阳性对照组(环) 50 10 000 22． 3 ± 2． 36
注:与阴性对照组比较，# P ＞ 0. 05;与阳性对照组比较，＊＊P ＜
0. 01;n = 10。
3 讨论
虽然目前大多数天然蓝色素产品仍是以动植物材
料为原料制取的，但是这类材料的获取容易受到季节、
气候、产地等因素的制约，从而使得天然蓝色素的产量
非常有限，因而价格昂贵，难以普及应用。微生物生长
迅速，而且自然界中能够产生色素的微生物种类非常
丰富，利用微生物资源生产天然色素基本不受资源、环
境、时间和空间的限制，因而具有利用动植物来源的材
料生产天然色素所无法比拟的优越性，采用微生物生
产天然色素终将会成为天然色素来源的主流［9］。
在急性毒性试验过程中，小鼠没有发生死亡情况且
生长情况良好，体重呈增长趋势，由此证明蓝色素未干
扰小鼠代谢系统，未影响食物的吸收利用。剖检存活小
鼠后，未见心、肝、脾、肺、肾等主要内脏器官出现肉眼可
见的病变，由此证明短期内蓝色素对小鼠安全。急性
毒性试验研究是评价药物安全性的一项重要指标，本试
·67· 毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 J Toxicol February 2013 Vol. 27 No. 1
验采用改良寇氏法通过经口给药设计了急性毒性试验，
观察了蓝色素的急性毒性。灌胃的最大剂量达到
16 g / kg体重，超过了安全剂量 15 g / kg 体重以上，且没
有引起小鼠死亡，可认为该受试物急性毒性试验是安全
的，不必测定其 LD50，表明蓝色素属于无毒类
［5］。
在精子畸形试验中，剂量组中有畸形精子出现，但
各剂量组与阴性对照组比较差异无统计学意义，各剂量
组之间比较差异也无统计学意义，且各剂量组、阴性组
与阳性组比较差异有统计学意义。说明蓝色素对雄性
小鼠的精子无致畸变作用。在微核试验中，剂量组中有
微核出现，但各剂量组与阴性对照组比较差异无统计学
意义，各剂量组之间比较差异也无统计学意义，且各剂
量组、阴性组与阳性组比较差异有统计学意义。说明蓝
色素对小鼠骨髓细胞染色体无致突变作用。综上所述，
该色素是一种很有开发前景的微生物天然蓝色素。
参考文献
［1］ 邹志飞，蒲民，李健军，等 ． 各国(地区)食用色素的使用
现况与比对分析［J］． 中国食品卫生杂志，2010，22(2) :
112-121．
［2］ Mar galith PZ． Pigment Microbiology ［M］． London:
Chapman and Hall，1992:111-114．
［3］ 张和春，陈亮 ． 产蓝色素放线菌的初步鉴定和蓝色素性
质研究［J］． 无锡轻工大学学报(食品与生物技术) ，
1999，18(3) :23-28．
［4］ 张和春，季文明 ． 天蓝色链霉菌胞内蓝色素提取方法研
究［J］．生物技术，2000，10(3) :19-22．
［5］ 李建科 ． 食品毒理学［M］． 北京:中国计量出版社，
2011:133．
［6］ 雷湘，陈刚，陈科力，等 ． 大黄素对小鼠的急性毒性研究
［J］．中药药理与临床，2008，24(1) :29-30．
［7］ 沈建中 主编 ．动物毒理学［M］． 北京:中国农业出版社，
2002:227-234．
［8］ 王丽平，江善祥 ． 硫酸粘杆菌素的急性毒性及对小鼠骨
髓细胞的微核效应［J］．畜牧与兽医，2003(1) :8-10．
［9］ 王君，张宝善 ．微生物生产天然色素的研究进展［J］． 微
生物学通报，2007，34(3) :580-583．
(收稿日期:2012 － 05 － 23)
中图分类号:R994. 4 文献标识码:B 文章编号:1002 － 3127(2013)01 － 0077 － 03 ·短篇报道·
角鲨烯软胶囊的安全性毒理学评价
邱春媚，殷光玲
(汤臣倍健股份有限公司，广东 广州 510663)
作者简介:邱春媚，研发专员，研究方向:保健食品开发与研究。
关键词:角鲨烯;急性毒性;遗传毒性;30d 喂养试验;安全性
角鲨烯又名鲨烯，鲨萜，是一种高度不饱和烃类化
合物，最初由日本人 Tsujimoto 于 1906 年在黑鲨鱼肝
油中分离得到，也是人类动物组织中最早发现的烃类
化合物。多年来的研究发现，角鳖烯作为一种脂质不
皂化物，广泛分布于生物体中，但目前，角鲨烯最主要
的来源依然是深海鱼类［1］。各方面的研究表明，角鲨
烯具有较强的生物活性，在血液中输送活性氧的能力
很强，可增强机体生理功能，提高免疫力，还可帮助抵
抗紫外线伤害，是性能优良的血液输氧剂和生物抗氧
化剂。其用途多种多样，广泛应用于医药、美容、化妆
品、保健食品等领域［2］。为了解角鲨烯作为保健食品
长期食用的安全性，本研究依照《保健食品检验与评
价技术规范》(2003 年版)对其食用安全性进行评价。
1． 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 受试物:角鲨烯软胶囊，为某公司提供，内容
物为黄色油状液体，以色拉油配制成相应的浓度供研
究用。人体每日推荐剂量为 2. 0 g / kg·BW。
1. 1. 2 实验动物:选用第一军医大实验动物中心提
供的 SPF 级 NIH 小鼠 100 只，SPF 级大鼠 100 只，雌雄
各半。实验期间，选用新疆医科大学实验动物中心提
供的全价颗粒饲料，实验室级别为 SPF 级，实验环境
温度为 21 ℃ ～ 25 ℃，湿度为 40% ～ 45%。
1. 2 方法
1. 2. 1 检验依据:《保健食品检验与评价技术规范》
(2003 年版)中的提高缺氧耐受力功能检验方法。
1. 2. 2 剂量设计:大小鼠急性经口毒性试验剂量为
人体推荐剂量的 300 倍，即 10. 0 g / kg·BW 设计，30 d
·77·毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 J Toxicol February 2013 Vol. 27 No. 1