全 文 ：temiclupuserythematosus:increasedinterleukin-2 butnot
interleukin-4mRNA[ J] .Lupus, 1994, 3(5):423-428.
[ 7] BetinottiMP, HartungK, DeicherH, etal.Polymorphism
ofthetumornecrosisfactorbetageneinsystemiclupuser-
ythematosus:TNFB-MHChaplotypes[ J] .Immunogenetics,
1993, 37(6):449-454.
(收稿日期:2008-11-20)
文章编号:1673-2995(2009)02-0073-03 ·论 著 ·
利用 RAPD标记分析长白山越桔的遗传多样性及亲缘关系
王 程 ,罗 军 ,田志杰 ,姜艳霞 ,李 妍 ,许 娜 ,芦晓晶 ,吕士杰＊ (吉林医药学院生物化学教研室 ,吉林 吉
林 132013)
摘 要:目的 分析长白山越桔遗传多样性及其亲缘关系。方法 用随机扩增多态 DNA(RAPD)标记方法对
1种野生越桔和 2种不同的栽培越桔进行遗传多样性检测和遗传分析。结果 采用 40个随机引物共检测 72
个位点 ,其中多态位点 27个 ,占 37.5%;相似系数矩阵表明野生越桔和栽培越桔 Ⅰ 、栽培越桔Ⅱ的遗传距离分
别为 0.764和 0.809;聚类图表明野生越桔和栽培越桔 Ⅱ亲缘关系较近 。结论 长白山越桔的遗传多样性水
平较低 ,野生越桔和栽培越桔之间的遗传变异不大 ,遗传因素在越桔形态变异上的作用小于环境因素 。
关 键 词:越桔;随机扩增多态 DNA;遗传多样性
中图分类号:Q781 文献标识码:A
Geneticdiversityanalysisofblueberryfrom theChangbaiMountainby
RAPDmarker
WANGCheng, LUOJun, TIANZhi-jie, JIANGYan-xia, LIYan, XUNa, LUXiao-jing, Lǜ Shi-jie＊ (Departmentof
Biochemistry, JilinMedicalColege, JilinCity, JilinProvince, 132013, China)
Abstract:Objective AnalyzesgeneticdiversityandsibshipofblueberyfromtheChangbaiMountain.Methods
Geneticdiversityexaminationandthegeneticanalysistoonekindofwildblueberryandtwokindofdiferentgarden
blueberybyrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)marker.Results Fromthefortyrandomprimers72 sites
weredetected, ofwhich27(37.5%)werepolymorphism.TheProximityMatrixindicatesGeneticProximityValuesbe-
tweenthewildblueberryandthegardenblueberyⅠ , thegardenblueberryⅡrespectivelyis0.764 and0.809, the
dendrogramindicatessibshipbetweenthewildblueberyandthegardenblueberyⅡ isnear.Conclusion Genetic
ProximityofblueberryfromtheChangbaiMountainarelower, betweenthewildblueberryandthegardenblueberry′s
hereditarychangeissmal, thehereditaryfactorsaresmalerthantheenvironmentalfactorintheblueberrymorphologi-
calchange′sfunction.
Keywords:blueberry;RAPD;geneticdiversity
越桔(bluebery)又名蓝莓 、地果 、甸果 、都柿等 ,
隶属杜鹃花科越桔属 ,为亚灌木野生植物 。越桔属全
基金项目:吉林省教育厅 “十一五 ”科学技术研究基金项目(吉教科
合字 2006 126号).
通讯作者:吕士杰(1960-),男(汉族),教授 ,硕士.
作者简介:王 程(1979-),男(汉族),助教 ,硕士.
世界共有 130多种 ,中国约有 20余种[ 1] ,主要集中在
大 、小兴安岭和长白山等地区。吉林省长白山地区主
要以野生笃斯越桔为主 ,分布广 、产量大 、资源丰富 。
当前 ,对笃斯越桔研究主要热点集中在治疗腹泻 、痢
疾 、口腔炎症 、眼科疾病 、血管障碍和糖尿病并发症
等 。随机扩增多态性 DNA(randomamplifiedpolymor-
—73—第 30卷 第 2期2009年 04月 吉 林 医 药 学 院 学 报Journal of Jilin Medical Colege Vol.30 No.2Apr.2009
phicDNA, RAPD)标记是 20世纪 90年代初发展起来
的一种分子标记技术 [ 2] ,广泛应用于药用植物研究
中 。本研究利用 RAPD技术对 3个来源于吉林产区
的越桔样品进行种质资源遗传多样性分析 ,旨在探讨
各品系间遗传关系 ,为越桔资源的合理利用和新品种
选育提供理论依据 ,也为越桔 DNA指纹图谱的构建
提供基础。
1 材料与方法
1.1 样 品
供试越桔集采地为吉林省安图县 ,采集时间为
2006年 8月;1号样品为野生笃斯越桔 , 2号样品为
栽培笃斯越桔(Ⅰ ), 3号样品为栽培笃斯越桔(Ⅱ),
原植物学名均为 VacciniumuliginosumL.。
1.2 仪器与试剂
PTC-240VAC型 PCR仪(美国 MJR公司), 3K30
型低温高速离心机(美国 sigma公司), EC250-90型
电泳仪(美国 EC-Apparatas公司), DDY-II-34A型电
泳槽(北京六一公司), 756MC型紫外分光光度计(上
海第三分析仪器厂)等 。植物基因组 DNA快速提取
试剂盒(A003-1), RAPDPCR试剂盒(A036), Marker
均购于北京鼎国生物技术服务有限公司。
1.3 DNA提取
取 300 μl果汁样品 ,严格按试剂盒操作 ,纯化
DNA样品于 -20℃贮存 ,用于 RAPD反应 。
1.4 DNA样品的检测
RAPD反应条件及程序 40个随机引物 A01 ～
A20、F01 ～ F20, 进行 RAPD-PCR反应 。反应体系
25 μl。反应程序:94℃预变性 4 min;94℃ 40 s, 37℃
45 s;72℃ 80s, 42个循环;72℃, 8 min。扩增产物用
1.5%琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)电泳 。
1.5 遗传多样性分析
电泳图谱的每条带(DNA片段),均为一个分子
标记 ,代表一个引物结合位点。根据各分子标记的迁
移率及其有无统计所有的二无数据 ,按条带有或无赋
值 ,有带(显性)记为 1,无带(隐性)记为 0 ,强 、弱条
带的均赋值 ,以此作为数据记录的标准。对于多态性
位点 ,仅在重复实验中能稳定出现差异的条带用于数
据分析 。RAPD反应条带转换成 “ 0, l”矩阵后 ,应用
SPSS11.5软件进行分析。
2 结 果
2.1 RAPD扩增结果分析
采用 40个 RAPD引物对供试的 3种越桔进行
RAPD-PCR扩增 ,筛选出电泳条带清晰的引物有 26
个 ,呈现多态性的引物 9个 , RAPD扩增图谱见图 1。
26个引物扩增的总带数及多态性条带数见表 1。
RAPD反应扩增片段大部分集中在 100 ～ 2 000 bp范
围内。 26个引物共扩增出 72条可区分的 DNA条
带 ,每个引物检测到的位点在 2 ～ 6之间 ,平均每个引
物可扩增出 3条带 。在这 72条 DNA扩增条带中 ,有
27条带呈多态性 ,占所观察到的总扩增带的 37.5%,
每个引物可增出 0 ～ 6条多态性带 ,平均每个引物产
生 1条多态性带。以上 RAPD数据分析结果表明 ,长
白山野生越桔种质资源的多态性较低 。
表 1 RAPD引物 、序列及扩增结果
引物名 序列(5′※ 3′) 总带数 多态性带数
A01 CAGGCCCTTC 3 0
A02 TGCCGAGCTG 2 0
A03 AGTCAGCCAC 3 3
A04 AATCGGGCTG 5 3
A06 GGTCCCTGAC 2 2
A09 GGGTAACGCC 4 0
A10 GTGATCGCAG 6 4
A11 CAATCGCCGT 2 2
A12 TCGGCGATAG 1 0
A14 TCTGTGCTGG 6 6
A16 AGCCAGCGAA 3 3
A17 GACCGCTTGT 2 0
A18 AGGTGACCGT 4 0
A19 CAAACGTCGG 2 0
F01 ACGGATCCTG 1 0
F02 GAGGATCCCT 3 0
F04 GGTGATCAGG 1 0
F06 GGGAATTCGG 4 0
F07 CCGATATCCC 2 1
F09 CCAAGCTTCC 2 0
F10 GGAAGCTTGG 3 0
F11 TTGGTACCCC 1 0
F12 ACGGTACCAG 1 0
F13 GGCTGCAGAA 3 0
F14 TGCTGCAGGT 1 0
F19 CCTCTAGACC 3 3
Total 72 27
—74— 吉林医药学院学报 2009年 04月 第 30卷
2.2 各品系亲缘关系分析
将获得的各品系 RAPD条带 ,转换为 “0, 1”矩阵
后 ,经 SPSS11.5转换分析 ,得到各品系相似系数矩
阵和亲缘关系的聚类图 ,见表 2、图 2。从遗传相似系
数矩阵可看出供试越橘品系间的相似系数为 0.704 ～
0.809,其 1号样品与 3号样品相似系数最高 , 为
0.809;2号样品与 3号样品相似系数最低 ,为 0.704,
这说明越橘各品系间相似性高 ,变异不明显。从聚类
图可看出 1号样品和 3号样品的亲缘关系更近 。
表 2 遗传相似系数
样品号 1 2 3
1 1.000
2 0.764 1.000
3 0.809 0.704 1.000
3 讨 论
RAPD分子标记由于其操作简便 、多态性强 ,在
PCR反应条件优化后 , RAPD扩增结果的可重复性和
稳定性得到了很大的提高 ,因此在果树品种的鉴定和
亲缘关系及种群进化和分类研究等方面应用较多 ,在
果树这样多年生遗传复杂的被子植物研究上显示了
一定的优势 。Levi[ 3]等首先应用了 RAPD标记和 IS-
SR标记技术进行越橘果树遗传标记 ,对 DNA序列的
同源程度分析。李晓红 [ 4]等采用 RAPD分子标记分
析了越橘的 7个栽培品系 ,扩增条带有较强的多态
性 ,各种群间遗传距离相对较远 。从越桔果实中提取
DNA与李晓红从越桔叶片中提取 DNA所作 RAPD
分子标记扩增的结果一致。
本实验主要研究长白山野生越桔和栽培越桔
DNA多态性和遗传相似性 ,相似系数矩阵和聚类图
来看 ,长白山越桔 RAPD标记的多态性检出率为
37.5%,野生越桔和栽培越桔Ⅰ 、栽培越桔 Ⅱ的遗传
相似系数分别为 0.764和 0.809,即遗传相似率为
70.4%和 80.9%之间。由此可看出长白山越桔的遗
传多样性水平较低 ,野生越桔和栽培越桔之间的遗传
变异不大 ,各品系间亲缘关系较近 ,遗传因素在越桔
形态变异上的作用小于环境因素。推测原因可能是
各地在大面积引种越桔时 ,主要是采集当地的野生资
源进行栽培 ,没有较多的异地引种使种质融合 ,扩大
越桔种群间的遗传多样性水平。
遗传因素和环境因素在越桔形成中均有一定作
用 ,因此遗传育种和改进栽培条件对改善越桔品质均
有重要意义 ,但环境尤为重要。野生越桔和栽培越桔
存在差异可能与其特有的地理位置和环境因素有关 ,
基因与环境之间的互作产生了一些变异的基因型个
体 ,导致不同地区的越桔在基因水平上存在差异 。一
般认为 ,果实由于保留生长分化组织和生长点 ,其未
分化的幼嫩组织在发育过程中始终受到环境条件的
影响 ,容易引起表型变异 ,由此相信 ,深入研究越桔独
特生存环境(土壤 、气候及动物 、植物和微生物)将为
培育越桔提供科学的指导。
参考文献:
[ 1] 刘淑兰 , 吕秀莲 ,王晓军 , 等.越橘的化学成分与药理活
性研究进展 [ J] .中医药学报 , 2006, 34(6):53-54.
[ 2] AgarwalM, ShrivastavaN, PadhH.Advancesinmolecular
markertechniquesandtheirapplicationsinplantsciences
[ J] .PlantCellRep, 2008, 27(4):617-631.
[ 3] LeviA, RowlandLJ.Identifyingblueberrycultivarsande-
valuatingtheirgeneticrelationshipsusingrandomlyampli-
fiedpolymorphicDNA(RAPD)andsimplesequencere-
peat-(SSR-)anchoredprimers[ J] .JAmerSocHaftSci,
1997, 122(1):74-78.
[ 4] 李晓红 , 李昌禹 ,乔金铎 , 等.越橘 RAPD研究 [ J] .特产
研究 , 2007, 29(4):30-47.
(收稿日期:2008-10-08)
—75—第 2期 王 程 , 等.利用 RAPD标记分析长白山越桔的遗传多样性及亲缘关系