全 文 ：分析检测 食品工业科技Vol.29 , No.07 , 2008
2008年第 07期　　　　　239　
高效液相色谱法测定大兴安岭
野生红豆越桔中矢车菊色素含量
张晓松 ,冯志彪＊ ,李冬梅 ,孙艳梅
(东北农业大学理学院应用化学系 ,黑龙江哈尔滨 150030)
摘　要:建立了大兴安岭野生红豆越桔提取物中矢车菊色素含量的高效液相色谱测定方法 。采用 Agilent-1100 C18柱
(3.9×150mm)色谱柱;以甲醇∶甲酸水溶液(1∶9)=20∶80(v/v)作流动相;流速为 1.0mL· min-1 ;柱温为室温;检测波长
为 530nm。实验结果表明 ,野生红豆越桔提取物中的矢车菊色素含量为 0.24‰,平均回收率为 104.5%,相对标准偏差
(RSD)为 0.5% (n=5)。该方法快速 、准确 、重复性好 。
关键词:红豆越桔 ,高效液相色谱 ,矢车菊色素
Determinationofcyanidinchlorideextractedfrom
vacciniumvitis-idaealinbyHPLC
ZHANGXiao-song, FENGZhi-biao＊ , LIDong-mei, SUNYan-mei
(ApplicationChemistryDepartmentofNortheastAgricultureUniversity, Harbin150030 , China)
Abstract:Amethodforthedeterminationofcyanidinextractedfromvacciniumvitis-idaealinbyHPLCwasstudied.
Agilent-1100 C18 column(3.9×150mm)wasused.Cyanidinwereseparatedwithmobilephase:methanol∶methane
acid-H2O(1∶9)=20∶80(v/v);theflowratewas1.0mL· min-1;thecolumntemperaturewasambienttemperature;
theUVdetectionwavelengthwas530nm.Theresultsshowedthatthecontentofcyanidinchlorideinthe
vacciniumvitis-idaealinextractwas0.24‰.Theaveragerecoveriesofcyanidinchloridewere104.5% , andthe
relativestandarddeviationsofcyanidinchloridewere0.5%(n=5).Themethodwasrapid, accurateandwith
goodreproducibility.
Keywords:vacciniumvitis-idaealin;highperformanceliquidchromatography;cyanidinchloride
中图分类号:TS255.1　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2008)07-0239-03
收稿日期:2007-11-14　＊通讯联系人
作者简介:张晓松(1982-),男 ,硕士 ,研究方向:农产品加工及贮藏。
　　越桔(Vacciniumvitis-idaealin)又名红豆越桔 、牙
格 达 , 是 杜 鹃 花 科 (Erioaoeae)越 桔 亚 科
(Vaccinioideae)越桔属 (Vacinumsp)植物。越桔果
实中的色素类物质主要是花青素类 ,是其最重要的
生物活性成分 。成熟的越桔果中有 15种花色苷 ,全
部由 5种配糖体和 3种糖(葡萄糖 、半乳糖和阿拉伯
糖)组成。由于不同品种间配糖体的构成比例不同 ,
使越桔果的果皮有青紫至黑色的差异。大量研究表
明 ,花色苷具有很强的抗氧化作用 , 可以清除体内的
自由基;降低氧化酶的活性;可以降低高血脂大鼠
的甘油脂水平 , 改善高甘油脂脂蛋白的分解代谢;抑
制胆固醇吸收 , 降低低密度脂蛋白和胆固醇含量;
抗变异 、抗肿瘤 、抗过敏 、保护胃粘膜等多种功能。
日本等研究应用花青素中的矢车菊素-3-葡萄糖苷
进行大鼠饲喂实验 , 表明此花色苷可以降低血清蛋
白和脂质体的过氧化作用 , 并且对重灌流诱发的局
部贫血肝脏的氧化性损伤具有保护作用 。 20世纪
80年代 , 日本对从紫甘蓝中提取分离出的 4种花青
素稳定性进行了研究 。紫甘蓝在 4℃环境中贮藏 84d
后 , 其中的矢车菊色素-3-葡萄糖苷含量仍然保持
在 69～ 94mg/100g鲜重。矢车菊色素(Cyanidin, Cy)
是重要的生物活性物质 [ 1 ～6 ] , 样品中矢车菊色
素-3-葡萄糖苷经水解可以生成矢车菊色素。对于
大兴安岭野生红豆越桔中矢车菊色素含量的测定未
见报道 ,本研究以矢车菊色素为标准品 ,应用 HPLC
法测定大兴安岭野生红豆越桔中矢车菊色素(花青
素)含量 ,为进一步制备富含矢车菊色素系列的制品
奠定基础。矢车菊色素和矢车菊素-3-葡萄糖苷的
化学结构见图 1、图 2。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
大兴安岭野生红豆越桔　采于大兴安岭地区伊
春市乌衣岭;盐酸盐矢车菊色素(Cyanidin)标准品　
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2008.07.086
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry 分析检测
　　　2008年第 07期240　
购于 Sigma公司;甲醇　色谱纯;其余所用试剂　均
为国产分析纯 。
高效液相色谱仪　Agilent公司:Agilent-G1314A
泵 , Agilent-G1314A紫外检测器 。
1.2　实验方法
1.2.1　色谱条件　色谱柱:Agilent-1100C18柱(3.9×
150mm);检测器:Agilent-G1314A紫外检测器;检测
波长:530nm;柱温:室温;流动相:甲醇 ∶甲酸水溶液
(1∶9)=20∶80(v/v)梯度洗脱;流速:1.0mL· min-1;
进样量:5μL。
1.2.2　标准曲线的绘制　称取标准品矢车菊色素
(cyanidin)1mg,用 2%盐酸 -甲醇(色谱级)定容到
10mL容量瓶中 ,制成标准储备液。然后从标准储备
液中吸取一定量 ,用 2%盐酸-甲醇稀释到 2、4、6、8、
10μg/mL待测 ,进样分析 ,测定各浓度的峰面积。以
峰面积(Y)为纵坐标 ,矢车菊色素浓度(X)为横坐
标 ,以矢车菊色素浓度 X(μg·mL-1)对峰面积 Y进
行线性回归分析 ,绘制标准品的标准曲线。
1.2.3　样品的制备与分析　从大兴安岭野生红豆越
桔果实中提取红豆越桔提取物的工艺路线为:红豆越
桔※破碎※加入 2%盐酸-乙醇溶液※超声提取※离心※取
澄清上清液※冷却※乙酸乙酯萃取※冷冻干燥※野生红豆越
桔提取物
准确称取一定量的红豆越桔提取物 ,用 2%盐酸
-甲醇水解 2h,取水解液用 2%盐酸-甲醇配置成一
定浓度的溶液 ,经 0.45μm微孔滤膜过滤 ,滤液即可
用于高效液相色谱分析 。
2　结果与分析
2.1　矢车菊色素的标准曲线
用高效液相色谱法测定矢车菊色素标准品 ,得
标准曲线为 Y=5.645X+4.78,其中 X的线形范围为
1～ 5μg/mL,相关系数为 0.997。
2.2　矢车菊色素标准品的色谱图
图 3为用高效液相色谱法测定 cyanidin标准品
得到的色谱图 ,矢车菊色素保留时间为 4.263min。
2.3　提取物样品中的矢车菊色素含量
野生红豆越桔提取物样品中矢车菊色素的谱图
如图 4所示。
从图 4可知 ,野生红豆越桔提取物中含有矢车
菊色素 。根据矢车菊色素标样色谱图可知 ,保留时
间为 4.263min的是矢车菊色素。从图 4中还可看
到 ,除了矢车菊色素外 ,还有三个峰 ,根据文献 [ 12]
分析 , 在 2.734min的 峰 可 能 是 翠 雀 素 苷 元
(Delphindin, Dp), 4.748min和 9.441min的两个尖峰
分别为矮牵牛苷元 (Petunidin, Pt)和锦葵色素苷元
(Malvidin, Mv),在矮牵牛苷元和锦葵色素苷元之间
出现一个微峰 , 研究表明 , 此峰可能是芍药花苷元
(Peonidin, Dp)。有糖基时 ,出峰顺序按照保留时间
按如下顺序递增:半乳糖苷 <葡萄糖苷 <阿拉伯糖苷 。
将图 4中峰 2的峰面积(33.8)代入矢车菊色素
的标准曲线 ,计算得提取物中矢车菊色素的含量为
0.24‰。
2.4　回收率实验
分别精密吸取一定量的 cyanidin标准品溶液 ,加
入到一定量的已知 cyanidin浓度的样品中 ,按测定样
品含量的方法操作 、测试 ,测得 cyanidin的平均回收率
分别为 104.5%,相对标准偏差(RSD)为 0.7%(n=3)。
2.5　精密度实验
将一定浓度的 cyanidin标准品溶液连续进样 5
次 ,根据测定结果 ,计算得 cyanidin的相对标准偏差
为 0.5%(n=5)。
通过回收率实验和精密度实验结果可以看出 ,
高效液相色谱法测定大兴安岭野生红豆越桔 ,不但
具有较高的回收率和精密度 ,而且能将红豆越桔提
取物中的不同组分分离并定量分析 ,是一种效用较
高的定量分析方法 。另外 ,通过与矢车菊色素标准
品保留时间的比较 ,又可用于提取物的定性分析。
3　结论
本实验以大兴安岭野生红豆越桔为原料 ,通过
超声 、乙酸乙酯萃取 、水解 、冷冻干燥等方法提取出
红豆越桔提取物 ,并用高效液相色谱法进行了测定。
根据测定结果 ,大兴安岭野生红豆越桔提取物中矢
(下转第 242页)
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry 分析检测
　　　2008年第 07期242　
然后加入 4mL双缩脲试剂 。用漩涡混合器充分摇匀
后 ,在室温 (20～ 25℃)下放置 30min,于 540nm处进
行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为
空白对照液。取三组测定的平均值 ,以蛋白质的 mg
数为横坐标 ,吸光值为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,求回
归方程。
1.2.4　重复性分析及与凯氏定氮法比较　取大豆分
离蛋白样品 B、C、D、E1g左右 ,配制样品溶液 ,用双
缩脲法对同一样品蛋白质进行重复测定 , 比较差
异性 。
对大豆分离蛋白样品 F采用凯氏定氮法(GB/T
5009.5-1985)和双缩脲法测定其蛋白质含量 ,每组实
验 3个重复(n=3),用 T检验对结果进行比较 ,检验
其差异性 。
2　结果与讨论
2.1　线性关系与检测限的测定
将蛋白质质量为 0、 2.0、 4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、
14.0、16.0mg的样品与双缩脲试剂反应后 ,吸光值分
别为 0.000、 0.100、 0.205、 0.307、 0.405、 0.499、 0.596、
0.662、0.732。经线性回归分析可得 ,双缩脲法测量
大豆分离蛋白时 ,当蛋白质质量在 0～ 12.0mg范围
内 ,线性关系比较好 , y=0.0498x+0.0035(R2 =
0.999629), 此法测定大豆蛋白质的最大检测限
为 12mg。
2.2　准确性测定
对 B、C、D、E大豆分离蛋白样品在完全相同的
实验条件下 ,即在所用药品 、反应条件及检测设备都
表 1　分析方法的重复性研究
样品 分析次数(n)
蛋白质含量
(g/100g)
变异系数
CV(%)
B 5 86.14±0.36 0.42
C 5 87.12±0.45 0.52
D 5 84.32±0.76 0.90
E 5 84.18±0.25 0.30
相同的条件下 ,应用双缩脲法重复 5次测定 ,其蛋白
质含量结果见表 1。
　　由表 1分析结果可知 ,重复 5次测定四个样品 ,
双缩脲法组内变异系数较小 ,准确性好。
2.3　凯氏定氮法和双缩脲法比较
对大豆分离蛋白样品 F采用凯氏定氮法和双缩脲
法测定其蛋白质含量 ,每组实验 3次重复(n=3),用 T
检验对结果进行比较 ,检验其差异性 ,结果见表 2。
表 2　双缩脲法与凯氏定氮法的 T检验结果
方法 n Mean t df Sig.(双尾)
凯氏定氮法 3 84.34
双缩脲法 3 83.81 0.835 4 0.451
　　由表 2的 T检验结果可知 ,双缩脲法和凯氏定
氮法测定大豆分离蛋白蛋白质含量差异不显著(P>
0.05),这更进一步说明双缩脲法具有可靠性 。
3　结论
应用双缩脲法检测大豆蛋白质时 ,当蛋白质含
量在 0～ 12.0mg范围内 ,线性关系比较好 ,吸光值为
0～0.596,变异系数小 , 重复性好 。与凯氏定氮法比
较 ,二者差异不显著。应用双缩脲法检测大豆分离
蛋白的蛋白质含量 ,所需时间少(20～ 30min),分光光
度计所需能源微量 ,操作简单 ,对环境无污染 ,是一
种非常有前途的测定大豆蛋白质的方法 。
参考文献:
[ 1] GB/T5009.5-2003[ S] .
[ 2]石彦国 .大豆制品工艺学 [ M] .北京:中国工业出版
社 , 2000.
[ 3]大连轻工业学院等八大院校合编 .食品分析 [ M] .北京:
中国轻工业出版社 , 1994.
[ 4]王敏 .双缩脲法快速测定大豆分离蛋白粉中的粗蛋白
[ J] .大豆通报 , 2003, 13:32.
[ 5]李健武 ,等 .生物化学实验原理和方法(第一版)[ M] .北
京:北京大学出版社 , 1994.165.
(上接第 240页)
车菊色素含量为 0.24‰。大兴安岭野生红豆越桔提
取物中还含有翠雀素苷元 、矮牵牛苷元和锦葵色素
苷元等 ,另外检测出少量芍药花苷元 。由于缺少标
准品 ,本文未能对翠雀素苷元 、矮牵牛苷元和锦葵色
素苷元等进行定量分析 。
用高效液相色谱法测定矢车菊色素时 ,比较合
适的色谱条件是:用甲醇∶甲酸水溶液(1∶9)=20∶80
(v/v)梯度洗脱作流动相 ,流速为 1.0mL· min-1 ,检
测波长为 530nm,柱温:室温 ,进样量:5μL。在此条
件下 , cyanidin测定的平均回收率和精密度都很高。
该方法快速 、准确 、重现性好 ,为快速测定植物中有
效成分含量提供了重要参考 。
参考文献:
[ 1]李娟娟 .花青素研究进展 [ J] .中山大学研究生学刊 ,
2007, 28(2):1～ 5.
[ 2]李丹 ,林琳 .越桔食品资源的开发与利用 [ J] .食品与发
酵工业 , 2000, 4:76～ 81.
[ 3] YvindM.Andersen.AnthocyaninsinFruitsofVaccinium
UliginosumL[ J] .JournalofFoodScience, 1987(3):665～ 666.
[ 4] Cooper-DriverGA.ContrbutionsofJefreyHarborneand
coworkerstothestudyofanthocyanins[ J] .Phytochemistry,
2001, 56:229～ 236.
[ 5 ] LuigiaLongo, GiuseppeVasapollo, LeonardoRescio,
IdentificationofAnthocyaninsinRhamnusalaternusL.Beries
[ J] .AgricFoodChem, 2005, 53:1723～ 1727.
[ 6] AnnamaryjuDSarma.Antioxidantabilityofanthocyanins
againstascorbicacidoxidation[ J] .Phytochemistry, 1997, 45:671
～ 674.
[ 7] 高爱红 ,董华荣 .天然食用色素-花青素研究进展 [ J] .
保鲜与加工 , 2001(3):25.
[ 8] IchiyanagiT, HatanoY, MatsugoS, etal.Structural
Dependence ofHPLC Separation Patern ofAnthocyanins
fromBilberry(VacciniummyrtilusL.)[ J] .ChemandPharm
Bull, 2004, 52(2):628～ 630.