全 文 ：表 8 其他五味药物正交实验方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F值 临界值 显著性
A 0． 000 2 0． 000 3． 110
B 0． 001 2 4． 000 3． 110 *
C 0． 000 2 0． 000 3． 110
误差 0． 00 8
а = 0． 1
2． 7 工艺验证试验 以上述优化条件提取 3 批药品，得荷叶中总
黄酮的平均含量为 0． 072 01 g·g －1，RSD = 2． 08%;其他五味药
物中总黄酮的平均含量 0． 063 82 为 g·g －1，RSD = 1． 26%。表明
本工艺稳定性良好。
3 讨论
为提高药材的提取效果，药材需加入溶剂后浸泡 0． 5 h再提
取。
黄酮是荷叶、菊叶、桑叶和银杏叶和甘草中的主要成分之一，
选取其作为提取工艺的指标性成分有一定的代表性。
参考文献:
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收稿日期:2010-10-25; 修订日期:2011-03-01
基金项目:湖北省教育厅资助课题(No． D200716003)
作者简介:杨若婧(1985-) ，女(汉族) ，湖北武汉人，现为湖北中医药大学
硕士研究生，学士学位，主要从事中药品质资源与活性成分研究工作．
* 通讯作者简介:张秀桥(1965-) ，女(汉族) ，现任湖北中医药大学副教
授，博士学位，主要从事中药品质资源与活性成分研究工作．
* 通讯作者简介:刘焱文(1945-) ，男(汉族) ，现任湖北中医药大学教授、
湖北省中药资源与中药化学重点实验室主任，学士学位，主要从事中药资
源及其制剂有效成分分析研究工作．
大叶蛇葡萄石油醚提取物抗乙肝病毒体外实验研究
杨若婧1，陈夏静1，何枭宇1，饶 荣1，张秀桥1，2* ，刘焱文1*
(1．湖北省中药资源与中药化学重点实验室，湖北 武汉 430061;
2．湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065)
摘要:目的 研究大叶蛇葡萄石油醚提取物体外抗乙肝病毒(HBV)的作用。方法 将大叶蛇葡萄石油醚提取物作用于乙
肝病毒 DNA转染人肝癌细胞系 2215 细胞，以细胞病变(CPE)观察药物对 2215 细胞的毒性，用酶联免疫测定法(ELISA)
检测药物对培养 8 d的 2215 细胞分泌的表面抗原(HBsAg)和 e 抗原(HBeAg)表达的抑制作用。结果 石油醚提取物的
半数毒性浓度(TC50)为 99． 1 μg /ml，最大无毒浓度(TC0)为 62． 5 μg /ml;石油醚提取物对培养 8 d的 2215 细胞的 HBsAg、
HBeAg表达抑制作用的半数有效浓度(IC50)分别为 4． 2 μg /ml，26． 3 μg /ml，治疗指数(TI)值分别为 23． 6，3． 8。结论 大
叶蛇葡萄石油醚提取物具一定的体外抗乙肝病毒的作用，为有效部位。
关键词:大叶蛇葡萄; 石油醚提取物; 2215 细胞; HBV
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 09． 046
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)09-2153-02
大叶蛇葡萄 Ampelopsis megalophylla Diels et． Gilg 是葡萄科
蛇葡萄属的一种药用植物，曾收载于《湖北中草药志》［1］。现代
药理研究表明葡萄科蛇葡萄属部分药用植物具有降血压、保肝护
肝等药理作用［2，3］，但未见对大叶蛇葡萄及其提取物体外抗乙肝
病毒作用的研究报道。本课题组曾对大叶蛇葡萄化学成分进行
了较系统的提取分离［4］，本论文在此基础上研究了大叶蛇葡萄
石油醚提取物对 2215 细胞的 HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。
1 材料与仪器
1． 1 细胞株 乙肝病毒 DNA 转染人肝癌细胞(HepG2)的 2215
细胞系由暨南大学张惠英老师惠赠。
1． 2 药物 大叶蛇葡萄石油醚提取物由湖北省中药资源与中药
化学重点实验室提供。溶于适量的二甲基亚砜(DMSO)后再用
改良 RPMI － 1640 培养液稀释成不同浓度。
1． 3 试剂与仪器 改良 RPMI － 1640 培养基(美国 Hyclone 公
司) ;G － 418(美国 Gibco 公司) ;L － 谷氨酰胺、胰蛋白酶(上
海实生细胞生物技术有限公司分装) ;胎牛血清(杭州四季青
生物工程材料有限公司) ;青霉素、链霉素(上海先锋药业有
限公司产品) ;HBsAg、HBeAg检测试剂盒(上海科华生物工程
股份有限公司) ;DMSO(SIGMA 公司)。二氧化碳孵箱(美国
Shel － Lab公司) ;培养瓶、96 孔培养板(美国 costar 公司) ;超
净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司) ;RT － 2100C 酶
标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司) ;HH － 2 型恒温
水浴锅(金坛市新航仪器厂) ;TDL － 40C 低速台式离心机(上
海安亭科学仪器厂)。
2 方法
2． 1 改良 RPMI － 1640 培养液的制备 取 RPMI － 1640 干粉
10． 0 g，溶于 1 000 ml 双蒸水中，过滤除菌，培养细胞前加入灭活
的胎牛血清 10%，G － 418 200 μg /ml，青霉素 100 U /ml，链霉素
100 U /ml，3%谷氨酰胺 1%。
2． 2 2215 细胞的培养 在长满 2215 细胞的培养瓶内加 0． 25%
胰酶，37℃消化 5 min，加 RPMI － 1640 培养液吹散，1 ∶ 3 传代，
10d长满。
2． 3 药物的细胞毒性实验 实验分无药物细胞对照组和不同浓
度药物组，细胞消化后配制成每毫升 20 万个细胞，接种于 96 孔
板培养，每孔 0． 1 ml，于 37℃、5%CO2 条件下培养 24 h，细胞长成
单层后进行试验。药物用改良 RPMI － 1640 培养液配制成溶液，
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 9 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 9 期
2 倍稀释，共 8 个稀释度，每浓度 3 孔，4 d 换同浓度药物培养液
继续培养，以观察细胞病变(CPE)为指标，第 8 天显微镜下观察
CPE，破坏 100%为 4;75%为 3;50%为 2;25%为 1;无病变为 0。
计算每浓度药液 3 孔平均 CPE程度和抑制百分率(%)。
2． 4 药物细胞毒性的计算 按 Reed － Meuench法计算半数毒性
浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
TC50(%)= Antilog{B +
50 － ＜ 50%抑制百分率
＞ 50%抑制百分率 － ＜ 50%抑制百分率
× C}
式中，A = log ＞ 50%药物浓度;B = log ＜ 50%药物浓度;C = A
－ B
2． 5 药物对 HBsAg、HBeAg表达的抑制作用实验 实验设细胞对
照组、HBsAg阳性和阴性对照组、HBeAg 阳性和阴性对照组及不
同浓度药物组。2215 细胞按 1 × 105 个 / ml 的浓度接种于 96 孔
细胞培养板，每孔 0． 1 ml，于 37℃、5%CO2 条件下培养 24 h，在试
验药液无毒浓度下 2 倍稀释，共 5 个稀释度，每个浓度 3 孔，于
37℃、5%CO2 条件下培养 4 d后换原浓度药物培养液继续培养，
分别收集第 4，8 天培养液，－ 20℃冰冻保存。
2． 6 HBsAg、HBeAg的测定及药效计算 用 HBsAg、HBeAg 酶联
免疫试剂盒测定 HBsAg、HBeAg，方法照说明书，用酶标分析仪测
定每孔 OD值。计算细胞对照及试验药液每浓度 OD 值均值(珋x)
及标准差(S) ，与细胞对照组比较抗原抑制率(%) ，半数有效浓
度(IC50)及治疗指数(TI) ，以 t 检验法计算药液各稀释度 HB-
sAg、HBeAg和细胞对照组间 OD值的差别。
①抗原抑制百分率(%)= 细胞对照组 OD值 －给药组 OD值
细胞对照组 OD值
× 100%
②IC50 = Antilog{B +
50 － ＜ 50%抑制百分率
＞ 50%抑制百分率 － ＜ 50%抑制百分率
× C}
式中，A = log ＞ 50%药物浓度;B = log ＜ 50%药物浓度;C = A － B
③SI = TC50 / IC50
3 结果
3． 1 药物在 2215 细胞培养中的毒性 药物浓度依次为 1 000，
500，250，125，62． 5，31． 2，15． 6 μg /ml，第 8 天显微镜下观察 CPE。
大叶蛇葡萄石油醚提取物对 2215 细胞的 TC50为 99． 1 μg /ml，TC0
为 62． 5 μg /ml。
3． 2 药物在 2215 细胞培养中对 HBsAg、HBeAg 表达抑制作用
大叶蛇葡萄石油醚提取物对 2215 细胞的 HBsAg、HBeAg 表达的
抑制作用结果见表 1。石油醚提取物对培养 8 d 的 2215 细胞的
HBsAg、HBeAg表达抑制作用的 IC50分别为 4． 2 μg /ml，26． 3 μg /
ml，TI值分别为 23． 6，3． 8。
表 1 石油醚提取物对 2215 细胞的 HBsAg、HBeAg表达的作用试验结果(珋x ± s)
药物
药物浓度
C /μg·ml － 1
HBsAg
4 d
OD值(珋x ± s) 抑制率(%)
8 d
OD值(珋x ± s) 抑制率(%)
HBeAg
4 d
OD值(珋x ± s) 抑制率(%)
8 d
OD值(珋x ± s) 抑制率(%)
石油醚 62． 5 0． 330 0 ± 0． 007 1* 48． 3 0． 072 5 ± 0． 002 2＊＊ 61． 1 0． 206 0 ± 0． 004 2* 42． 0 0． 037 0 ± 0． 001 4＊＊ 64． 5
提取物 31． 2 0． 328 0 ± 0． 014 1* 48． 7 0． 075 5 ± 0． 002 3＊＊ 59． 5 0． 216 5 ± 0． 002 1* 39． 1 0． 045 5 ± 0． 002 1＊＊ 56． 3
15． 6 0． 480 5 ± 0． 006 4* 24． 8 0． 082 0 ± 0． 004 4＊＊ 56． 0 0． 219 0 ± 0． 001 4* 38． 3 0． 072 5 ± 0． 002 3* 30． 4
7． 81 0． 471 5 ± 0． 006 3* 26． 2 0． 084 0 ± 0． 004 5＊＊ 54． 9 0． 281 5 ± 0． 000 7 20． 8 0． 058 0 ± 0． 001 4* 44． 3
3． 91 0． 584 5 ± 0． 006 6 8． 5 0． 094 0 ± 0． 004 3* 49． 5 0． 319 5 ± 0． 014 8 10． 1 0． 094 0 ± 0． 004 2 9． 7
细胞对照 0． 639 0 ± 0． 007 1 0． 186 5 ± 0． 007 8 0． 355 3 ± 0． 031 1 0． 104 1 ± 0． 001 4
与细胞对照组比较，＊＊P ＜0． 01，* P ＜0． 05;n =3
4 讨论
HBV － DNA 克隆转染的人肝癌细胞(HepG2)的 2215 细
胞系经自行传代培养，细胞存活良好，并分泌大量的 HBsAg、
HBeAg，为评价抗 HBV 药物提供可靠的研究方法。用 TI 值来
判断药物在体外对乙肝病毒的作用，当 TI ＞ 2 时，为低毒有
效;2 ＞ TI ＞ 1 时，为高毒低效;TI ＜ 1 时为毒性作用强［5 ～ 7］。
本研究结果表明，大叶蛇葡萄石油醚提取物的 TC50为 99． 1
μg /ml;培养 8 d时，对 HBsAg的 IC50和 TI 分别为 4． 2 μg /ml，
23． 6;对 HBeAg的 IC50和 TI 分别为 26． 3 μg /ml、3． 8，提示大
叶蛇葡萄石油醚提取物对乙型肝炎病毒细胞转染的 2215 细
胞中的 HBsAg、HBeAg 均有一定的抑制作用，其中对 HBsAg
的抑制作用较强，且多数浓度组与细胞对照组比较对 HBsAg
的表达有极显著抑制作用(P ﹤ 0． 01) ，为体外的抗乙肝病毒
有效部位。为了进一步探索大叶蛇葡萄抗乙肝病毒的物质基
础，本课题组将在此药理实验的基础上进一步对石油醚提取
物进行单体成分的提取分离和活性筛选研究。
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