全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (6) : 737～742
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 12 - 02 ; 修回日期 : 2004 - 03 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30270643)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : xieby @mail1caas1net1cn)
应用绿色荧光蛋白报告基因优化辣椒的遗传转化体系
杨国顺1 ,2 　谢丙炎1 3 　杨宇红1 　王晓武1 　卢向阳2 　蒋芳玲1 ,2
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081 ; 2 湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128)
摘 　要 : 以‘中椒 5 号’甜椒和‘湘研 10 号’辣椒子叶外植体为试料 , 绿色荧光蛋白 GFP 基因为报
告基因 , 通过观察检测愈伤组织的荧光表达与特异 PCR 扩增鉴定 , 分析了工程菌液 pH 值、共培养基中乙
酰丁香酮 (AS) 的浓度、共培养时的温度与共培养时间对农杆菌转化辣椒效率的影响。结果表明 , 在 pH
512、共培养基中加入 AS 200μmol·L - 1 、23 ℃黑暗条件下 , 农杆菌与辣椒子叶共培养 5 d , 有利于辣椒子叶
的遗传转化 ,‘中椒 5 号’、‘湘研 10 号’愈伤组织荧光表达率均达到了 40 %。
关键词 : 辣椒 ; 子叶 ; 绿色荧光蛋白基因 ; 遗传转化
中图分类号 : S 64113 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0620737206
Improvement of Genetic Transformation System by Using GFP as Reporter
Gene on Pepper
Yang Guoshun1 ,2 , Xie Bingyan1 3 , Yang Yuhong1 , Wang Xiaowu1 , Lu Xiangyang2 , and Jiang Fangling1 ,2
(1 Institute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Science , Beijing 100081 , China ; 2 Horticultural and Landscape
College , Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract : Effect of transferring efficiency of Agrobacterium tumef aciens pH value、concentration of AS added
in co2cultivation medium , temperature during co2cultural stage and days for co2cultivation were studied through PCR
amplification and observation of green fluorescent protein expression by used GFP as reporter gene on cotyledon of
‘Zhongjiao 5’and‘Xiangyan 10’. The results show that when pH value of Agrobacterium solution is 512 , trans2
formation efficiency of pepper cotyledon incubated on co2cultivation medium added 200μmol·L - 1 AS increased sig2
nificantly under 23 ℃and 5 days dark co2cultivation. The rate of expression of green fluorescent protein are up to
40 % on calli of cotyledon of both‘Zhongjiao 5’and‘Xiangyan 10’.
Key words : Pepper ; Cotyledon ; Green fluorescent protein ; Genetic transformation
辣椒基因工程自 1990 年Liu 等〔1〕首次通过根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens) 介导进行遗传转
化以来 , 已有许多学者试图利用该方法对辣椒进行品种改良 , 但获转基因植株的例子很少 , 辣椒遗传
转化率低是阻碍辣椒基因工程发展的主要原因 , 国内外学者〔2～4〕的研究 , 均未很好地解决“高效”的
问题。据前人研究报道〔5～8〕, 农杆菌液 pH值、共培养基中 AS (乙酰丁香酮) 浓度、共培养的温度与
共培养时间对转化有较大的影响。在植物遗传转化过程中 , 需要检测外源基因在受体细胞、组织或完
整植株内是否表达 , 过去常用荧光素酶基因 (LUX) 和β- 葡萄糖苷酶基因 ( GUS ) 作报告基因 , 但
LUX 检测时需要向试验材料内渗入荧光素 ; 对 GUS 进行组织化学分析时 , 需要昂贵的反应底物 4 -
甲基伞形花酮 -β- D - 葡萄糖苷酸 (X2Gluc) , 这些检测方法一般对植物材料都有破坏性。而绿色荧
光蛋白基因 ( GFP) 作为一种非酶报告基因正引起人们的广泛兴趣。GFP 含有特殊的六肽生色团结
构 , 当用蓝紫光激发时能发出肉眼清晰可见的绿色荧光 , 无需任何底物或辅助因子 , 因此作为有效的
报告基因用于植物的遗传转化比蛋白酶报告基因更为快捷方便。GFP 用于水稻、玉米、烟草等〔9～13〕
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作物的转化已有成功的报道。本研究应用农杆菌介导法 , 以 GFP 作为报告基因 , 研究农杆菌液 pH
值、AS、共培养时间及共培养温度对辣椒转化效率的影响 , 通过对愈伤组织的荧光检测和特异 PCR
扩增鉴定 , 建立稳定高效的辣椒遗传转化体系。
1 　材料与方法
111 　材料
‘中椒 5 号’甜椒和‘湘研 10 号’辣椒由育成单位提供 , Tag 酶和 dNTPs 购自北京清华天为时代
生物技术公司。
112 　菌株和质粒
根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumef aciens) LBA4404 为含 pBI121 质粒的侵染菌株 , 其质粒图谱如图
1 , 其中包含 35 s 启动子以及抗卡那霉素的 npt II基因。
←nos pro —npt Ⅱ (kmr) —nos ter —CaMV35s pro —mGFP —nos ter ←
图 1 　重组植物表达载体 pBI1212mGFP 图谱
Fig. 1 　A schematic diagram of the recombinant plant expression vector pBI1212m GFP
113 　农杆菌介导辣椒的转化
取 10～12 d 的辣椒子叶为外植体 , 在MB (MS + B5 有机) + 62BA 510 mg·L - 1 + IAA 110 mg·L - 1 +
3 %蔗糖 + 0165 %琼脂培养基上预培养 2 d 后 , 用制备好的农杆菌液 (OD600值为 014～016) 侵染 15
min , 外植体在灭菌滤纸上沥干菌液后 , 置培养基 MB + 62BA 510 mg·L - 1 + IAA 110 mg·L - 1 + Spm (精
胺) 100μmol·L - 1 + ABA (脱落酸) 013 mg·L - 1 + 3 %蔗糖 + 0165 %琼脂 + AS 上共培养 , 每皿放 10 个
外植体 , 正面朝上。共培养 3 d 后 , 转入选择性培养基 MB + 62BA 510 mg·L - 1 + IAA 110 mg·L - 1 + Spm
100μmol·L - 1 + ABA 013 mg·L - 1 + AgNO3 510 mg·L - 1 + 3 %蔗糖 + 0165 %琼脂 + Km (卡那霉素) 150 mg·
L - 1 + Carb (羧苄青霉素) 500 mg·L - 1。所用抗生素、AS 都预先过滤灭菌 , 培养基高压灭菌后冷却至
55 ℃左右时加入抗生素或 AS。
114 　试验处理
分别用 pH为 510、512、514、516、518 (灭菌后 pH 值) 的 MS 液体培养基悬浮农杆菌液至 OD600
值为 015 , 外植体预培养 2 d 后 , 用工程菌侵染 15 min , 共培养 3 d , 转入选择性芽分化培养基上培养
10 d 检测愈伤组织的荧光表达率。
AS 处理。预培养 2 d 的子叶外植体置于 pH 512 的MS 液体培养基侵染 15 min , 侵染后的外植体置
于共培养基 + AS (0～500μmol·L - 1) 上培养 3 d 后 , 转入选择性芽分化培养基 , 培养 10 d 后检测愈伤
组织的荧光表达。
共培养温度。预培养 2 d 的子叶外植体置于 pH 512 的 MS 液体培养基侵染 15 min , 转入共培养基
+ AS 200μmol·L - 1共培养 3 d , 设不同温度 (17～29 ℃) 处理 , 再转入抗性芽分化培养基 , 培养 10 d
后检测愈伤组织的荧光表达 ,
共培养时间。预培养 2 d 的子叶外植体置于 pH 512 的 MS 液体培养基侵染 15 min , 转入共培养基
+ AS 200μmol·L - 1共培养 (1～6 d) , 共培养温度为 23 ℃, 然后进行选择培养 , 10 d 后检测愈伤组织
的荧光表达。
115 　绿色荧光蛋白表达检测
每个处理接种 10 个外植体 , 重复 3 次。在Leica MPS 60 荧光显微镜下观察经农杆菌转化处理子叶
外植体愈伤组织 , 检测 GFP 基因的表达情况。选用 BP355 激发滤光片 , 用 Leica DM RA2 自动成像系
统拍照。以每个外植体为单位 , 统计愈伤组织表达绿色荧光的外植体个数 , 将产生荧光的外植体数除
以检测的总外植体数 , 计算其百分率 , 计算出平均数后作图。
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116 　转化愈伤组织的 PCR鉴定
采用 CTAB 法提取经 Km 筛选的抗性愈伤组织 DNA。根据 mGFP 全序列 , 用 DNAMAN 310 程序设
计一对特异引物 mGFP1 和 mGFP2 , 其核苷酸序列为 : mGFP1 : ATGGGAAAGGAGAACTTTT; mGFP2 :
CGCGGTACCGATAGATCTGTATAGTTCATC。引物由上海生工利用全自动 DNA 合成仪合成。在 MJ PTC2
200 热循环 PCR 仪上 , 用 mGFP1 和 mGFP2 进行 PCR 扩增 , PCR 反应体系为 25μL , 其中包括 10 ×PCR
Buffer、0125 mmol·L - 1dNTPs、mGFP1 与 mGFP2 Primers 分别为 10 pmol、215 UTaq 酶、50 ng 辣椒 DNA。
扩增反应程序 : 94 ℃变性 1 min , 5415 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸 1 min , 共 35 个循环 ; 最后 72 ℃延伸 10
min , 终止反应 ; 扩增后 112 %琼脂糖凝胶电泳检测 , 电压 3～4 V·cm- 1 , 凝胶成像系统中观察 , 拍
照。
2 　结果与分析
211 　绿色荧光蛋白基因在辣椒愈伤组织中的表达及 PCR检测
为了验证 GFP 基因在辣椒愈伤组织中的表达 , 采用含 pBI121 质粒的根癌农杆菌 LBA4404 侵染菌
株介导转化‘中椒 5 号’甜椒和‘湘研 10 号’辣椒的子叶 , 将 GFP 基因导入辣椒子叶愈伤组织细
胞 , 并选择抗卡那霉素的转化愈伤组织进行绿色荧光表达与 PCR 检测。在蓝光照射下均观察到用
pBI1212mGFP 转化的愈伤组织上开始出现明亮的绿色荧光点 , 而对照则发出黄色荧光 (图版 , 1、2) 。
在芽分化培养基上培养 20 d 分化芽 , 在蓝光照射下均观察到绿色荧光 (图版 , 3、4) , 这表明 GFP 基
因导入辣椒后可以高效表达 , 甜椒与辣椒基因型没有差异。PCR 扩增结果也证明 (图 2) : 转化的愈
伤组织中扩增出预期的目的片段 , 大小约为 650 bp , 在所检测的愈伤组织中 , 含有目的片段的愈伤组
织约占总检测数的 33 %。因此 , GFP 基因是优化辣椒高效遗传转化体系的理想报告基因。
图 2 　转 GFP 抗性愈伤 PCR检测结果
M: 100 bp DNA ; CK+ : 阳性对照 ; CK- : 阴性对照 ; 1～9 : 转化的愈伤组织。
Fig. 2 　The PCR detection result of resistant calli transferred GFP
M: 100 bp DNA ladder ; CK+ : Positive control ; CK - : Negative control ; 1 - 9 : Transferred calli .
212 　农杆菌菌液 pH值对转化的影响
试验结果 (图 3) 表明 : 工程菌液的 pH值不同 , 其转化效率有明显的不同。当 pH 值为 512 时 , 子
叶愈伤组织的荧光表达率最高 ,‘中椒 5 号’甜椒与‘湘研 10 号’辣椒分别为 10 %、1617 %; 而随着 pH
值升高 , 荧光表达率逐渐下降 , 当 pH 值高达 518 时 , 转化率极低 , 其中中椒 5 号未见表达荧光的愈伤
组织。Yuji Ishida 等〔8〕报道 , pH 512 的LS2inf 菌液与幼胚共培养后的 GUS表达率最高 , 而当LS2inf pH值
为 518 时 , 检测不到蓝斑。本试验结果与其一致 , 这说明农杆菌与外植体的互作环境需要较低的 pH值 ,
悬浮培养基 pH为 512 时有利于 vir 基因的诱导活化 , 从而有利于提高转化效率。
213 　共培养基中添加 AS 对转化的影响
从图 4 中可以看出 , AS 对辣椒子叶的转化具有明显的促进作用。当 AS 200～400μmol·L - 1时 , 中
椒 5 号的转化率为 2617 % , 湘研 10 号 2617 %～30 %。分别较对照提高了 167 %、60 %～80 %。而当
AS 为 500μmol·L - 1时 , 其荧光表达率略有下降。因此 , 在共培培养基中加入 200μmol·L - 1的 AS , 对
辣椒子叶的转化具有明显的促进作用。
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图 3 　悬浮培养基不同 pH值对转化的影响
Fig. 3 　The effect of different pH of suspended cultural
medium on transformation
图 4 　共培养基中不同 AS 浓度对转化的影响
Fig. 4 　The effect of different concentration of AS in
cocultural medium on transformation
214 　共培养时的温度对转化的影响
图 5 表明 : 共培养时当处于较低温度 (17～23 ℃) 下 , 随着共培养温度的升高其转化率提高。当
共培养温度为 23 ℃时 ,‘中椒 5 号’和‘湘研 10 号’的转化率分别为 3617 %、40 %。当共培养温度高
于 23 ℃时 , 荧光表达率明显降低 , 29 ℃时 , ‘湘研 10 号’的转化率仅为 313 % , 而‘中椒 5 号’未见
有荧光表达。因此 , 在辣椒子叶转化的共培养过程中 , 共培养温度以 23 ℃左右为最佳。
图 5 　不同共培养温度对转化的影响
Fig. 5 　Effect of different temperature during co2cultural
stage on transformation
图 6 　不同共培养天数对转化的影响
Fig. 6 　Effect of different days of co2cultivation
on transformation
215 　共培养时间对转化的影响
结果表明 (图 6) : 随着共培养时间的延长 , 愈伤组织荧光表达率升高 , 共培养 5 d 时 ,‘湘研 10 号’
和‘中椒 5 号’荧光表达率均达到 40 % , 农杆菌对外植体损伤少。共培养 6 d 时 , 转化率虽有进一步的
提高 , 但农杆菌生长过旺 , 外植体褐化明显 , 分化的愈伤组织虽有较高的荧光表达率 , 但大量外植体变
褐死亡。黎定军等〔3〕报道转化后共培养 2 d , 辣椒分化率最高。本试验证明共培养 5 d 为最佳共培养天
数。
3 　讨论
311 　关于绿色荧光蛋白的检测
对转化后代的筛选鉴定是基因工程的重要组成部分。虽然目的基因中一般含有筛选标记 , 例如
npt II , 但有些植物对此并不敏感 , 需借助于报告基因 GUS 等进一步验证。检测时需逐个取样 , 再经
保温、脱色、固定等繁琐步骤 , 如果转化后代群体有上百或上千个样品 , 按 GUS 检测方法 , 工作量
很大。而以 GFP 作为标记 , 转化后代的检测会变得简便许多。只需荧光照射外植体 , 转化外植体就
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能发出特定荧光 , 从而与对照区别开。
目前 , 已有许多荧光蛋白应用于植物转基因检测的报道。王泽宙〔10〕、许新萍〔11〕等采用基因枪方
法将适用于高等植物的绿色荧光蛋白基因转化到水稻愈伤组织之中 , 获得高效瞬时表达 , 在荧光显微
镜和激光共聚焦显微镜下观察到愈伤组织发出强烈绿色荧光。黄国存等〔12〕将 GFP 转入棉花幼胚中 ,
GFP 绿色荧光清晰可见 , 其下胚轴横切面也和对照存在明显差异。在检测 GFP 基因转化材料时 , 如
果背景荧光太强 , 荧光信号被背景信号遮盖 , 就很难检测到荧光信号。在植物中 , 叶绿体和细胞壁是
主要的自发荧光源 , 成为检测荧光信号的主要障碍。此外 , 转化材料的生理状态也会影响自发荧光的
强弱。为解决荧光信号与背景信号的矛盾 , 减少背景荧光的影响 , 需综合考虑多种条件。可取根部、
黄化幼苗或愈伤组织等非绿色组织进行观察〔11 ,13〕。本试验为减少背景荧光的影响 , 将外植体在选择
性培养基上继续培养 10 d 后检测抗性愈伤组织的荧光信号。在蓝光照射下 , 对照白色愈伤组织发出
黄色荧光 , 转化愈伤组织发出绿色荧光。将抗性愈伤组织提取 DNA 后进行 PCR 检测 , 结果与荧光检
测结果基本相符。
312 　共培养温度对转化效率的影响
早在 70 年以前 , 研究发现由农杆菌侵染所产生的植物冠瘿瘤的形成、发育与温度有十分密切的
关系。应用农杆菌接种侵染 , 当接种时温度高于 29 ℃时 , 不能导致冠瘿瘤的产生。当温度低于 29 ℃
时 , 冠瘿瘤的大小随着共培养温度的降低而增大 , 当共培养温度为 22 ℃时 , 冠瘿瘤最大。随后的试
验证明高温对冠瘿瘤发育的抑制不是由高温对植物的影响造成的 , 而是由于高温抑制了冠瘿瘤的诱
导。据 Willy Dillen 等〔6〕报道共培养时的温度对农杆菌的转化效率有明显的影响。当共培养时的温度
为19～22 ℃时 , GUS 瞬时表达效率最高 , 当温度从 22 ℃升至 25 ℃时 , GUS 瞬时表达效率随之显著降
低 , 当温度达到 27 ℃时 , GUS 瞬时表达效率很低 ; 当温度为 29 ℃时 , 就观察不到 GUS 的表达。据
Fuller 等报道〔14〕温度之所以能影响 T2DNA 的转移效率 , 其原因之一是影响农杆菌性丝的形成 , 而性丝
的形成则影响 T2DNA 的转移 , 当温度为 19 ℃时 , 能观察到性丝的形成 , 当温度升到 28 ℃时 , 则很少
有性丝形成。本试验表明当共培温度为 23 ℃时 , GFP 的荧光表达率最高 , 这与前人的研究结果一致。
本试验研究表明 , 以 GFP 为报告基因 , 当工程菌的 pH 值为 512 时 , 共培养基中添加 200μmol·
L - 1 AS , 共培温度为 23 ℃的黑暗中共培 5 d , 能较明显的提高辣椒的转化效率。
参考文献 :
1 　Liu W , Parrott W A , Hidebrand D F , et al . Agrobacterium induced gall formation bell pepper ( Capsicum annuum L. ) . Plant Cell Rep . , 1990 ,
9 (7) : 360～364
2 　Wolf D , T Matzevitch , B Steinitz , et al . Why is it difficult to obtain transgenic pepper plants ? Acta Hort . , 2001 , 556 : 229～233
3 　黎定军. 辣椒高效离体再生与遗传转化体系的建立及转抗病基因的研究 : 〔博士学位论文〕. 湖南 : 湖南农业大学 , 2000. 96 页
4 　Zhu Yu Xian , Ou Yang Wen Jun , Zhang Yi Feng , et al . Transgenic sweet pepper plants from Agrobacterium mediated transformation. Plant Cell
Reports , 1996 , 16 : 71～75
5 　Satorn M , Masaoki F. Agrobacterium tumefaciens2mediated gene transfer to tea plant ( Camellia sinensis) cells. Matsu. , 2002 , (3) : 428～431
6 　Willy D , Janniek D C , Jyoti K, et al . The effect of temperature on Agrobacterium tumefaciens2mediated gene transfer to plants. The Plant Journal ,
1997 , 12 (6) : 1459～1463
7 　Gustavo A de la Riva , Joel Gonza Lez2Cabrera , Camilo Ayra2Pardo , et al . Agrobacterium tumefaciens : A natural tool for plant transformation.
Molecular Biology and Genetics , 1998 , 1 (3) : 1～18
8 　Yuji Ishida , Hideaki Saito , Shozo Ohta , et al . High efficiency transformation of maize mediated by Agrobacterium tumefaciens . Nature Biotechnolo2
gy , 1996 , 14 : 745～750
9 　Davis S J , Vierstra R D. Soluble , highly fluorescent variants of green fluorescent variants of green fluorescent protein ( GFP) for use in higher
plants. Plant Mol . Biol . , 1998 , 3 (6) : 521～528
10 　王泽宙 , 邱全胜. 绿色荧光蛋白基因 mgfp4 在水稻愈伤组织中的瞬时表达. 北京师范大学学报 , 2000 , (36) : 385～389
11 　许新萍 , 黄　粤 , 卫剑文 , 等. 绿色荧光蛋白基因在水稻细胞中的高效表达. 植物学报 , 1998 , 40 (1) : 91～94
12 　黄国存 , 张寒霜 , 高　鹏 , 等. GFP 基因在棉花转化中的应用. 遗传 , 2001 , 23 (2) : 131～134
147　6 期 杨国顺等 : 应用绿色荧光蛋白报告基因优化辣椒的遗传转化体系 　
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
13 　Vain P , Worland B , Kohli A , et al . The green fluorescent protein ( GFP) as a vital screenable marker in rice transformation. Theor. Appl .
Genet . , 1998 , (96) : 164～169
14 　Fuller KJ , Lara J C , Nester E W. Pilus assembly by agrobacterium T2DNA transfer genes. Science , 1996 , 273 : 1107～1109
图版说明 : 1. 对照 ; 2. 转化位点表达荧光 ; 3. 表达荧光的愈伤组织 ; 4. 表达荧光的芽。
Explanation of plates : 1. Non2transferred calli ; 2. Expression of GFP on transferred site ; 3. Expression of GFP on transferred calli ;
4. Expression of GFP on transferred bud.
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