全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (2) : 109～112
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 08 - 27 ; 修回日期 : 2001 - 11 - 12
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39830260)3 通讯作者。
根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因转化印度酸桔的
研究
石　玮　李东栋　邓秀新 3 　伊华林
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070)
摘 　要 : 通过根癌农杆菌介导将绿色荧光蛋白基因转入印度酸桔的胚性愈伤组织中 , 经潮霉素筛选 ,
获得抗性愈伤组织 , 并再生植株。对这些植株进行 GUS染色、PCR 分析、绿色荧光检测和 Sourthern 杂交验
证 , 结果表明绿色荧光蛋白已经在转基因植株中表达。
关键词 : 柑桔 ; 愈伤组织 ; 遗传转化 ; 绿色荧光蛋白基因 ; 根癌农杆菌介导
中图分类号 : S 666 ; Q 78 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0220109204
根癌农杆菌介导的遗传转化方法 , 可以在不改变现有品种遗传背景前提下引入新的目的基因。目
前国际上已有根癌农杆菌介导柑桔进行遗传转化的报道〔1～4〕, 但主要是采用实生苗的上胚轴、茎段等
作为外植体 , 而茎段作为转化的材料不仅容易产生嵌合体 , 并且由于经过有性过程 , 造成遗传背景不
清楚。因此 , 以愈伤组织为侵染材料有自身的优势。本研究通过根癌农杆菌介导的方法 , 将绿色荧光
蛋白基因导入印度酸桔的愈伤组织中 , 并获得转基因的再生植株。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
印度酸桔 (Cleopatra , Citrus reticulata) 胚性愈伤组织由美国佛罗里达大学 Grosser 博士惠赠 , 华中
农业大学作物遗传改良国家重点实验室细胞分室保存。根癌农杆菌菌株为 EHA105 , 质粒载体为
pCAMBIA1303。gus 与 mgfp5 3 位于同一个启动子 CaMV35S 下 , 以潮霉素抗性基因作为选择标记。其图
谱见图 1。头孢霉素 (Cefotaxime , Cef) 、潮霉素 ( Hygromycin , Hyg) 购自美国 Sigma 公司 , 其它分子
生物学试剂购自上海 Sangon 和美国 Promega 等公司。
图 1 　gfp 基因的表达载体 pCAMBIA1303
Fig. 1 　A linear map of the T - DNA region of pCAMBIA1303
1. 2 　方法
1. 2. 1 　材料和根癌农杆菌的准备　就印度酸桔胚性愈伤组织、胚状体、实生苗上胚轴对头孢霉素和
潮霉素的敏感程度进行浓度梯度试验。柑桔胚性愈伤组织在 MT固体培养基上继代培养 , 每 25 d 继代
1 次 , 取生长旺盛的愈伤组织在 MT液体培养基中悬浮培养 4 d 后作为接种用外植体。农杆菌划线培
养在含有 50 mg·L - 1卡那霉素的 YEB 选择培养基上进行 , 28 ℃暗培养 , 菌落长出后挑取单菌落在新选
择培养基上涂皿 , 取出培养 24 h 后的菌落群 , 用无卡那霉素的 MT液体培养基培养 2 h , 分光光度计
测量菌液的 OD600值 , 调整 OD600 = 0. 5 ～1. 0 进行接种。
1. 2. 2 　遗传转化 　将准备好的愈伤组织转入稀释后的菌液中浸泡 20 min , 用无菌滤纸吸干表面 , 转
到 MT基本培养基上 , 23 ℃共培养 2～3 d。共培养后的愈伤组织在无菌水中漂洗直至洗液变清为止 ,
再放入含有 400 mg·L - 1头孢霉素的无菌水浸泡 20 min , 倾去洗液 , 将外植体置于无菌滤纸上吸干 , 转
入筛选培养基 MTS (MT + Cef 400 mg·L - 1 + Hyg 60 mg·L - 1) , 26 ℃暗培养 , 继代数次后将新长出的部
分愈伤组织进行植株再生。
1. 2. 3 　gus 基因表达的检测 　共培养后 , 取部分愈伤组织检测 GUS 瞬时表达活性。5 个月后对抗性
材料进行 gus 基因稳定表达的检测。染色方法按 GUS 标准染色程序〔5〕进行。
1. 2. 4 　转化的柑桔材料的 PCR 鉴定 　质粒 DNA 的小量制备采用碱裂解法。采用 CTAB 法提取植株
DNA。根据 gfp5 3 基因编码区设计 5’端引物 (5 - TGGCCAACACTTGTCACTAC - 3) 和 3’端引物 (5 -
AGGACCATGTGGTCTCTCTT- 3) 。PCR 反应体系为 25μL , 其中模板0. 3 ～0. 5μg , dNTP 0. 2 mmol ,
MgCl2 1. 5 mmol·L - 1 , 1 ×Taq DNA 聚合酶 Buffer , 1U Taq DNA 聚合酶。循环反应为 94 ℃30 s , 55 ℃30 s ,
72 ℃ 1 min , 35 个循环。
1. 2. 5 　Southern 杂交分析　植株总 DNA 经 EcoR I酶切 , 随机引物法标记探针 , 依照文献 〔6〕的方法
进行电泳、转膜和杂交 , 放射自显影。
1. 2. 6 　转化的柑桔材料的荧光镜检　用 OLYMPUS AH23 型万能显微镜 B 档激发光 , 激发并检测转化
柑桔愈伤组织酶解得到的单细胞和转基因再生苗中 GFP 荧光的表达情况。
2 　结果与分析
2. 1 　筛选转化体的抗生素浓度的选择
培养基中加入一定浓度 (100～400 mg·L - 1) 的头孢霉素不影响柑桔胚性愈伤组织的生长。而胚
性愈伤组织对潮霉素敏感 , 在潮霉素浓度达到 60 mg·L - 1时完全抑制胚性愈伤组织的生长。
同一品种的不同外植体对潮霉素敏感程度不同。完全抑制印度酸桔的胚性愈伤组织、子叶型胚状
体、上胚轴生长分化的潮霉素浓度分别为 60、35 和 15 mg·L - 1。
2. 2 　柑桔抗性愈伤组织的选择培养和再生
试验表明 , 愈伤组织刚转移到筛选培养基上时 , 对照逐渐褐化 , 死亡。转化处理的愈伤组织中转
化部分逐渐长出新的抗性愈伤组织 (见插页 1 图版 , 1) 。将其转至新的筛选培养基上继代培养 , 当得
到的抗性胚性愈伤组织达到一定量时 , 将一部分转入 MT + 甘油2 % + Cef 50 mg·L - 1的胚状体分化固
体培养基上 , 2 周后开始出现球形胚状体 , 4 周后将胚状体转入 MT + ME 1500 mg·L - 1 + Cef 50 mg·L - 1
培养基上 , 胚状体长大形成子叶型胚状体 (见插页 1 图版 , 2) 。1 个月后将子叶型胚状体转入 MT +
Cef 50 mg·L - 1 + Hyg 35 mg·L - 1培养基上 , 再筛选 1 次。3 周后将具抗性的子叶型胚状体转入 MT +
Cef 50 mg·L - 1 + NAA 0. 1 mg·L - 1 + BA 0. 5 mg·L - 1 + KT 0. 5 mg·L - 1培养基上再生芽 , 1 个月后可见再
生芽 (见插页 1 图版 , 3) 。再生芽长到 2 cm 左右时 , 将其从基部切下转入 1/ 2 MT + Cef 50 mg·L - 1 +
Hyg 15 mg·L - 1 + NAA 0. 5 mg·L - 1 + IBA 0. 1 mg·L - 1 + 活性炭0. 5 g·L - 1培养基上生根 , 再生植株 (见
插页 1 图版 , 11) 。目前共获得再生完整植株 38 棵。
2. 3 　转基因植株的 PCR 分析
将获得的 38 棵再生植株各取叶片约0. 1 g , 分别提取总 DNA , 用 gfp5 3 引物进行 PCR 扩增。在 38
棵植株中有 34 棵得到了预期分子量 500 bp 的条带 , 与质粒 DNA 扩增出的条带完全相同 , 而未转化的
柑桔 DNA 未扩增出相应的条带 (图 2) 。
2. 4 　Southern 杂交检测
用32P 标记的 gfp5 3 基因片段为探针 , 分别与转基因植株、未转化的植株和质粒 DNA 进行杂交。
结果表明 : 被检测的转基因植株和质粒都有同源的杂交带出现 , 而未转化的植株则无杂交带出现 , 证
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明转基因植株中确实有 gfp 基因的整合 (图 3) 。
图 2 　转基因柑桔植株 DNA的 PCR扩增检测结果
M. Marker ; 1. 质粒 DNA ; 2. 对照 ; 3～8. 转基因植株。
Fig. 2 　PCR amplification results of transgenic plants
M. Marker ; 1. Plasmid DNA ;
2. Control ; 3 - 8. transgenic plants.
图 3 　转基因植株的 Southern 杂交结果
M. Marker ; 1. 阳性对照 ; 2. 阴性对照 ; 3～7. 转基因植株。
Fig. 3 　Southern blot results of transgenic plants
M. Marker ; 1. Positive control ;
2. Negative control ; 3 - 7. Transgenic plants.
2. 5 　gus 基因表达的检测
取部分共培养后的胚性愈伤组织进行 GUS 的瞬时表达检测 , 大部分都能染色 , 没有经转化处理
的对照无任何蓝色反应 (见插页 1 图版 , 4) 。
对经过多代筛选的抗性胚性愈伤组织进行 GUS 的稳定表达的检测 , 发现 90 %愈伤组织表现蓝色 ,
对经过多代筛选、分化得到的胚状体进行 GUS 稳定表达的检测 , 发现有 85 %的胚状体表现为阳性 ,
可能是潮霉素筛选不完全 , 或者因为转化体 gus 基因沉默等原因所造成。对 PCR 阳性植株进行 GUS
的稳定表达的检测 , 也都表现 GUS 阳性 , 且植株各部分器官都被染色 (见插页 1 图版 , 5、6) 。
2. 6 　gfp 基因表达的检测
在 20 倍物镜下检测筛选多代的抗性愈伤组织酶解得到的单细胞或细胞团的绿色荧光 , 同时设置
相同处理的未转基因材料对照。未转化细胞发出黄色荧光 , 而转化细胞发出较强的绿色荧光 (见插页
1 图版 , 7) 。直接对抗性愈伤组织在 10 倍物镜下观察并照相 (见插页 1 图版 , 8) 。以 PCR 证明含有
gfp 基因的 34 棵再生植株为检测对象 , 将再生苗的各部分器官分别放在载玻片上 , 滴加 10 %的甘油 ,
盖玻片压片 , 同时设置相同处理的未转基因材料对照 , 10 倍物镜下检测并照相。未转基因叶片由于
叶绿素的存在 , 呈现红色背景 , 未见有自发绿色荧光 , 但由于叶片表面绒毛的存在 , 出现有规则的黄
色荧光 , 而转基因叶片上则有自发绿色荧光的存在 (见插页 1 图版 , 9) 。虽然发光强度有所不同 , 但
约 80 %的植株都发出可检测的绿色荧光。发光部位有较大差别 , 所有植株的叶和茎都发出绿色荧光。
(见插页 1 图版 , 10) 。
3 　讨 论
过去在遗传转化中几乎无一例外的使用 gus 基因作为报告基因 , 同时 , gus 基因的表达也可以由
细胞的组织化学的方式进行检测〔7〕。然而 GUS 作为标记的一个主要的局限在于检测时对植物材料的
破坏性 , 这对于那些需要进一步进行基因表达的材料来说就显得更加不方便。为解决这一问题 , 人们
曾经尝试使用荧光色素酶基因 ( luc) 作为报告基因。这种方法是利用 luc 基因可以通过在组织内加入
一些荧光的底物进行活体检测〔8〕, 但由于其检测过程必须在黑暗中进行 , 并必须将一些荧光底物引入
植物内部 , 从而使植物的生理活动受到不同程度的干扰 , 使这种方法应用的范围受到一定的限制。以
上两种报告基因在应用上的不足则正是绿色荧光蛋白作为标记物的优势所在。因为绿色荧光蛋白基因
在组织中表达的检测不需要任何底物或协助因子的存在。1999 年 , Ellott 等应用不同的滤光片的荧光
显微镜对作为报告基因的绿色荧光蛋白进行检测〔9〕, 4 种不同的作物 (甘蔗、烟草、莴苣、大麦) 经
过农杆菌或基因枪轰击后在其组织中非常容易的检测到了 GFP 的表达。恢复生长的细胞团也可以较
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容易地进行 GFP 检测。同年 , 董越梅等成功的应用 GFP 为标记构建了一个新型载体 , 可以用作植物
体的转化〔10〕。gfp 基因同时可以和 gus 基因一起作为标记物使用 , 从而使二者的优点得以相互的补
充。1998 年 , Nicolette 等通过将 gfp 基因和 gus 基因二者的融合而构建的双功能的载体在植物的体内
得到了稳定的表达〔11〕, 并且在组织化学和活体检测两个方面均达到了预期目的。同时 , 绿色荧光蛋
白的运用给活体检测农杆菌接种的植物组织提供了可能 , 使得我们能够准确定位转化外植体上的转化
细胞或分化产生的转化愈伤组织和转化苗 , 促进这些转化体的生长发育 , 对提高转化频率是非常有效
的。
对于已经获得的转基因植株 , 虽然 GFP 对于柑桔本身的农艺和经济性状来讲并没有直接的意义。
但作为一种带有可见标记的特殊材料 , 还是存在进一步的应用价值。这种材料很有可能在作为授粉品
种应用时 , 成为鉴定柑桔珠心胚和合子胚的一种直接标记。
参考文献 :
1 　Pena L , Cervera M , Juarez J , et al . Genetic transformation of lime : factor affecting transformation and regeneration. Plant Cell Rep . , 1997 , 16 :
731～737
2 　Pena L , Cervera M , Juarez J , et al . Agrobacterium2mediated transformation of sweet orange and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Rep . ,
1995 , 14 : 616～619
3 　Pena L , Cervera M , Juarez J , et al . High efficiency of Agrobacterium2mediated transformation and regeneration of citrus. Plant Sci . , 1995 , 104 :
183～191
4 　Perez E , Molphe2Balch , Ochoa2Alejo N. Regeneration of transgenic plants of Mexican lime from Agrobacterium rhizogenes2transformed tissues. Plant
Cell Rep . , 1998 , 17 : 591～596
5 　Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants : the gus gene fusion system. Plant Mol . Biol . , 1987 , 5 : 387～405
6 　Clark M S. Plant molecular biology —a laboratory manual . Berlin : Springer2Verlag , 1998 (in Chinese) . 13～31
7 　Jefferson R A , Burgess S M , Hirsch D. β2Glucuronidase from Escherichia coli as a gene fusion marker. Proc. Natl . Acad. Sci . , 1986 , 83 : 8447
～8451
8 　Millar A J , Carre I A , Stryer C A , et al . Circadian clock mutants in Arabidopsis indentified by luciferase imaging. Science , 1995 , 267 : 1161～
1163
9 　Elliott A R , Campbell J A , Dugdale B , et al . Green fluorescent facilitates rapid in vivo detection of genetically transfromed plant cell . Plant Cell
Rep . , 1999 , 18 : 707～714
10 　董越梅 , 李久蒂 , 朱至清. 利用突变的绿色荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体. 植物学报 , 1999 , 41 (5) : 487～489
11 　Nicolette E M , Helmi R M S , Pieter C A , et al . Fusion between green fluorescent protein andβ2glucuronidase as a sensitive and vital bifunctional re2
porter in plants. Plant Mol . Biol . , 1998 , 38 : 861～873
The Transformation of gfp in Cleopatra ( Citrus reticulata ) Mediated by
Agrobacterium tumefaciens
Shi Wei , Li Dongdong , Deng Xiuxin , and Yi Hualin
( National Key Laboratory in Genetic Improvement of Crops , Huazhong Agriculture University , Wuhan 430070 , China)
Abstract : The callus of Cleopatra ( Citrus reticulata) , a citrus rootstock cultivar , was transformed by the
strain of Agrobacterium tumef aciens EHA105 carrying gfp gene. The callus of Cleopatra ( Citrus reticulata) was co2
cultivation with A . tumef aciens and selected with hygromycin , as led to the regeneration of resistant embryogenic
callus and later to plantlets. The plants were verified GFP2transgenic plants by GUS analysis , GFP2fluorescent de2
tection , PCR amplification and Southern hybridization.
Key words : Citrus ; Callus ; Green fluorescent protein gene ( gfp) ; Genetic transformation ; Agrobacterium2
mediated
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