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华茶藨组织培养及试管苗繁殖的研究



全 文 :华茶藨组织培养及试管苗繁殖的研究
方 鹏1,宁淑香2 (1.铁岭师范高等专科学校,辽宁铁岭 112008;2.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连 116081)
摘要 [目的]对华茶藨组织进行培养,并研究试管苗的繁殖。[方法]以华茶藨为材料,采用嫩茎组织培养方法,进行愈伤组织诱导、增
殖、分化培养,以及试管苗生根、移栽、定植的研究。[结果]MS +35 g /L蔗糖 +0. 4 mg /L NAA +0. 4 mg /L ZT +1. 8 mg /L 2,4 - D为嫩茎
愈伤组织诱导培养的适宜培养基;MS +1. 6 mg /L 2,4 - D +0. 6 mg /L 6 - BA +0. 3 mg /L NAA的固态培养基是愈伤组织增殖培养的适宜
培养基;MS +0. 5 mg /L ZT +0. 1 mg /L NAA为愈伤组织分化培养和不定芽繁殖培养的适宜培养基。1 /2MS + 0. 6 mg /L IAA + 0. 1 mg /L
NAA +16 g /L蔗糖为试管苗培养和试管苗繁殖培养的适宜培养基。试管苗移栽成活率为 96. 7%;试管苗定植成活率为 98. 6%。[结
论]定植苗次年可 5月开花,10月结果,其他植物学性状均与野生华茶藨一致。
关键词 华茶藨(Ribes fasciculatum);试管苗;组织培养
中图分类号 S188;R282 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611(2013)34 -13117 -03
Study on Tissue Culture and Tube Seedlings’Propagation of Ribes fasciculatum
FANG Peng et al (Tieling Normal College,Tieling,Liaoning 112008)
Abstract [Objective]To conduct tissue culture of Ribes fasciculatum and study propagation of tube seedlings. [Method]With the method of
tissue culture,the tender stems of Ribes fasciculatum were used as materials to do the research on callus inducement,propagation and differen-
tiation;cultivation,transplantation of tube seedlings and stable planting. [Result]The results demonstrated that MS + sucrose 35 g /L + 0. 4
mg /L NAA + 0. 4 mg /L ZT + 1. 8 mg /L 2,4-D was the ideal medium for callus inducement;MS + 1. 6 mg /L 2,4-D + 0. 6 mg /L 6-BA + 0. 3
mg /L NAA was the ideal medium for callus multiplication;MS + 0. 5 mg /L ZT + 0. 1 mg /L NAA was the optimum medium for callus differen-
tiation cultivation and adventitious buds cultivation;The ideal medium for cultivation and propagation of tube seedlings was 1 /2MS + 0. 6 mg /L
IAA + 0. 1 mg /L NAA + 16 g /L sucrose. The transplanting survival rate of tube seedlings was 96. 7% and stable planting survival rate was
98. 6% . [Conclusion]The flowering of the tube seedlings stable planted the second year can be normal and it maintained all botany character-
istics of the wild Ribes fasciculatum.
Key words Ribes fasciculatum;Tube seedlings;Tissue culture
作者简介 方鹏(1976 - ) ,男,辽宁铁岭人,副教授,硕士,从事细胞生
物学研究。
收稿日期 2013-11-03
华茶藨(Ribes fasciculatum) ,又称大蔓茶藨,属虎耳草科
茶藨子属灌木植物,生长于山坡灌木林中,在中国的江苏、浙
江、湖北、河南和山东等地有分布[1],在辽宁大连的旅顺也有
分布[2],但分布区域小,其数量也很少,而当地人又有在每年
10月下旬摘取果实用于食用或酿酒的习惯,从而使这种野生
植物数量越来越少,已经成为辽宁地区的濒危植物[3]。为保
护这种野生资源,研究者以嫩茎为材料,对华茶藨进行了试
管苗繁殖的研究。此前已有关于茶藨子类植物研究的报告,
但都是关于传统繁殖技术的研究[4 -6],迄今关于茶藨子属植
物组织培养及试管苗培养研究鲜有报道。笔者以华茶藨为
材料,采用嫩茎组织培养方法,进行愈伤组织诱导、增殖、分
化培养,以及试管苗生根、移栽、定植的研究,以期为华茶藨
的进一步开发研究提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 将旅顺老铁山上生长较旺盛的华茶藨挖回来
后,栽到花盆中,春天当植株开始旺盛生长时,连续 4 d向根
部浇灌和向植株表面喷洒浓度为 3 mg /L 庆大霉素与 0. 3
mg /L NAA混合溶液。第 4 天处理完 24 h 后,将嫩茎剪下,
作为实验室中的试验材料。接种前的嫩茎采用翻白草灭菌
方法[7]进行彻底灭菌 。
1. 2 培养条件 与翻白草研究的培养条件一致[7]。
1. 3 嫩茎切口愈伤组织诱导培养 在无菌培养皿中,将灭
菌后的嫩茎先切成长0. 5 ~0. 7 cm的茎段,再从中间纵切开。
然后以材料的纵切面平放到培养基上的方式,将培养材料接
种到以 MS +35 g /L蔗糖 +0. 4 mg /L NAA为基本培养基,分
别附加浓度为0. 4、0. 8和1. 2 mg /L ZT与附加浓度分别为0.
6、1. 2、1. 8、2. 4和 3. 0 mg /L 5 种浓度 2,4-D的培养基上,进
行不同浓度 ZT与不同浓度 2,4-D的生长调节剂组合对嫩茎
愈伤组织诱导培养的试验。每种处理培养 15瓶,每瓶接种 6
个嫩茎段,试验重复 2 次。培养试验前 25 d进行暗培养,之
后进行光照培养。
1. 4 愈伤组织繁殖培养 将由嫩茎段培养的愈伤组织,从
培养瓶中全部取出称重后,直接接种到固态、液态 2 类、4 种
培养基上,进行不同状态、不同培养基对愈伤组织繁殖培养
的试验。在保证 2种状态培养的温度、光照条件不变的情况
下,液态培养基在放到 90 r /min的摇床上进行振荡培养。培
养到 46 d 时,进行称重统计观察。扩增培养试验重复了 2
次,液态、固态 2类培养基,每个培养瓶中接种的愈伤组织分
散为6 ~8块状,重量为0. 7 ~1. 2 g。每种培养基用于试验的
材料 20瓶,
1. 5 愈伤组织分化培养 将在 MS + 1. 6 mg /L 2,4-D + 0. 6
mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA固体培养基上增殖培养的嫩绿
色愈伤组织用解剖刀分割成长约 0. 4 cm的块状后,接种到
以 MS为基本培养基,附加浓度各异的 ZT与 NAA或 IBA的
不同生长调节剂组合的琼脂固体培养基上,进行黑暗和光照
两种环境中愈伤组织分化的培养。分化试验重复 2 次,每种
培养基用于试验的材料为 60块。
1. 6 生根培养 把由愈伤组织培养的不定芽在下部剪下,
形成独立不定芽后,在以 1 /3MS为基本培养基、与附加不同
碳源及不同生长素组合的培养基上,进行以不定芽为材料的
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2013,41(34):13117 - 13119 责任编辑 石金友 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.34.060
试管苗培养试验。此试验重复了 1 次重复,一种处理以 60
个不定芽为试验材料。
1. 7 试管苗移栽与定植 将重复培养 26 d的试管苗培养瓶
打开,在日光温室内炼苗4 d后,移栽到下半部与上半部分别
为河沙和炉灰渣的营养钵中。并在此后 10 d内保持无直射
光和 75% ~90%的湿度条件。以炉灰渣为移栽基质的移栽
了 80株,以河沙为移栽基质的移栽了 70 株,每个营养钵中
移栽 2株试管苗,共对 150株试管苗进行了移栽试验。将栽
成活的 140株试管苗,定植到旅顺山坡上的丛林旁,并进行
不定期地进行统计观察。
2 结果与分析
2. 1 不同浓度 ZT 与 2,4-D 的组合对愈伤组织培养的影
响 由表 1可知,在浓度为 0. 4、0. 8 和 1. 2 mg /L ZT与浓度
为 3. 0 mg /L的 2,4-D 组合的培养基上,培养材料不形成愈
伤组织,而在其他组合的培养基上,培养材料均可形成愈伤
组织。其中在浓度为 0. 4 mg /L的 ZT与浓度为 1. 8 mg /L 2,
4-D的培养基上,观察统计的愈伤组织生长率和长势均为最
好。观察表明,在这一培养基上培养的嫩茎段,培养到 7 d时
可见开始生长出愈伤组织,之后,随着愈伤组织块不断增大,
生长率迅速提高,培养到 50 d时,就可以培养出外观上嫩绿
色、由许多性状不规则颗粒组成的、大小为0. 5 ~1. 3 cm的愈
伤组织块。重复试验与初次试验的结果一致。这说明浓度
为 0. 4 mg /L ZT与 1. 8 mg /L 2,4-D 的生长调节剂组合为愈
伤组织诱导培养的适宜组合。由此说明,将培养材料接种到
MS +35 g /L蔗糖 +0. 4 mg /L NAA +0. 4 mg /L ZT +1. 8 mg /L
2,4-D这种培养基是诱导培养华茶藨嫩茎愈伤组织的适合培
养基。
表 1 不同浓度 ZT与 2,4-D的组合对愈伤组织培养的影响
ZT
mg /L
2,4-D
mg /L
接种培养茎
段个数
生长愈伤组
织茎段个数
生长率
%
愈伤组织
长势
0. 4 0. 6 90 26 28. 9 +
0. 8 0. 6 90 24 26. 7 +
1. 2 0. 6 90 31 34. 4 +
0. 4 1. 2 90 52 57. 8 + +
0. 8 1. 2 90 50 55. 6 +
1. 2 1. 2 90 43 47. 8 +
0. 4 1. 8 90 90 100. 0 + + +
0. 8 1. 8 90 78 86. 7 + +
1. 2 1. 8 90 65 72. 2 + +
0. 4 2. 4 90 21 23. 3 +
0. 8 2. 4 90 16 17. 8 +
1. 2 2. 4 90 13 14. 4 +
0. 4 3. 0 90 0 0 -
0. 8 3. 0 90 0 0 -
1. 2 3. 0 90 0 0 -
注:-为部分化;+为长势一般;+ +为长势较好;+ + +为长势旺盛。
2. 2 不同状态、不同培养基对愈伤组织增殖培养的影
响 由表 2可知,在 2 种状态的培养基上,固态培养基的效
果明显好于液态培养基。在本试验所进行的 4 种不同的固
体培养基研究中,在 MS + 1. 6 mg /L 2,4-D + 0. 6 mg /L
6-BA +0. 3 mg /L NAA这一培养基上所统计观察的 3项指标
中均为最好。观察还表明,在这种培养基上培养至 46 d时,
愈伤组织生长为嫩绿色的、由很多颗粒组成、且大小为 1. 5
cm左右的块状。结果表明,MS +1. 6 mg /L 2,4-D +0. 6 mg /L
6-BA +0. 3 mg /L NAA的固态培养基是华茶藨愈伤组织增殖
培养的合适培养基。
表 2 不同状态、不同培养基对愈伤组织增殖培养的影响
培养基状态 培养基 增重率∥% 愈伤组织质地、外观色泽、表面状态 愈伤组织长势
固态 MS +0. 8 mg /L 2,4-D +0. 3 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 316. 4 质地松软、淡黄色、较光滑 + +
固态 MS +1. 6 mg /L 2,4-D +0. 6 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 789. 4 质地适中、嫩绿色、不等颗粒状 + + +
固态 MS +2. 4 mg /L 2,4-D +0. 9 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 616. 0 较硬、黄间绿白相间、凸凹 + +
固态 MS +3. 2 mg /L 2,4-D +1. 2 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 163. 2 质地硬、绿间带白、凸凹 + +
液态 MS +0. 8 mg /L 2,4-D +0. 3 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 153. 3 松软、淡黄色、光滑 +
液态 MS +1. 6 mg /L 2,4-D +0. 6 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 306. 5 较软、淡黄色、光滑间有凸凹 +
液态 MS +2. 4 mg /L 2,4-D +0. 9 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 234. 8 上硬下软、淡黄色、大颗粒 +
液态 MS +3. 2 mg /L 2,4-D +1. 2 mg /L 6-BA +0. 3 mg /L NAA 146. 2 较硬、灰黄色、不均大小颗粒 +
注:+为长势一般;+ +为长势较好;+ + +为长势旺盛;生长调节剂单位为 mg /L。
2. 3 光暗条件与不同培养基对愈伤组织分化培养的影
响 由表 3可知,在黑暗的条件下进行培养,愈伤组织不分
化,而光照培养的条件下愈伤组织均能不同程度的分化。其
中在 MS + 0. 5 mg /L ZT + 0. 1 mg /L NAA的培养基上,愈伤
组织的分化率最高。对分化培养的过程进行观察还表明,在
MS + 0. 5 mg /L ZT + 0. 1 mg /L NAA 这一培养基上,培养至
第 5天时可见有的愈伤组织上部分化出芽点,之后随着芽点
逐渐长成为不定芽,其分化率也不断增加。待培养到 54 d时
每块愈伤组织上可生长出多个高 1. 2 cm左右的不定芽。并
且重复试验中也得到了基本一致的结果。结果表明,在光照
培养的条件下,MS + 0. 5 mg /L ZT + 0. 1 mg /L NAA 的培养
基就是华茶藨愈伤组织分化培养的合适培养基。把分化培
养的不定芽在下部与培养基接触的部位剪下后,再接种
MS +0. 5 mg /L ZT + 0. 1 mg /L NAA 这种培养基上进行3 ~5
次继代培养,每继代 1 次,就会繁殖培养出多个基部生长在
一起的不定芽,平均每代的繁殖系数为 3. 3。由此也说明
MS + 0. 5 mg /L ZT +0. 1 mg /L NAA这种培养基也为华茶藨
不定芽繁殖培养的合适培养基。
2. 4 不同碳源、不同生长素组合对不定芽生根培养的影
响 由表 4可知,3种不同的碳源都能不同程度的促进不定
芽生根生长为试管苗,其中蔗糖的效果最好。在 3种生长素
组合中,0. 6 mg /L IAA + 0. 1 mg /L 2,4-D 不生根,以 0. 6
81131 安徽农业科学 2013 年
mg /L IAA +0. 1 mg /L NAA这一组合的效果最好。在以蔗糖
为碳源、以 0. 6 mg /L IAA + 0. 1 mg /L NAA为生长素组合的
培养基上。其试管苗的茎平均粗度、叶片数和试管苗高度 3
项指标也均为最好。并且 2 次重复试验的结果几近相似。
这表明蔗糖是生根培养基的理想碳源,而 0. 6 mg /L IAA +
0. 1 mg /L NAA为不定芽试管苗生根培养的适宜生长素组
合。也就是说 1 /2MS + 0. 6 mg /L IAA + 0. 1 mg /L NAA + 16
g /L蔗糖这一培养基是华茶藨不定芽生根培养的适宜培养
基。把在这一培养基上培养的试管苗切成长约 1. 2 cm,至
少具有 2生长点(外观上是具有 2 个叶片)的茎段后,在这
一培养基上进行继代循环培养,就会繁殖出满足数量需要
的试管苗。统计观察表明:1个培养周期(32 d)繁殖系数为
2. 8,并且繁殖的试管苗生长得比使用不定芽为材料生根培
养的试管苗生长旺盛。这说明,1 /2MS + 0. 6 mg /L IAA +
0. 1 mg /L NAA + 16 g /L蔗糖也是华茶藨试管苗繁殖培养的
适宜培养基。
表 3 不同光照条件、不同培养基对愈伤组织分化培养的影响
光照
条件
培养基
分化率
%
平均每块愈
伤组织分化
不定芽个数
愈伤
组织
长势
光照 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 05 mg /L NAA 48. 3 3. 1 + +
光照 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 1 mg /L NAA 96. 7 6. 0 + + +
光照 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 3 mg /L NAA 56. 7 2. 3 + +
光照 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 5 mg /L NAA 51. 7 1. 6 +
光照 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 05 mg /L NAA 35. 0 2. 4 + +
光照 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 1 mg /L NAA 76. 7 3. 4 + +
光照 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 3 mg /L NAA 45. 0 1. 9 +
光照 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 5 mg /L NAA 31. 7 1. 9 +
暗 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 05 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 1 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 3 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +0. 5 mg /L ZT +0. 5 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 05 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 1 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 3 mg /L NAA 0 0 -
暗 MS +1. 0 mg /L ZT +0. 5 mg /L NAA 0 0 -
注:-为不分化;+为长势一般;+ +为长势较好;+ + +为长势旺盛。
表 4 不同碳源、不同生长素组合对不定芽生根培养的影响
碳源 生长素组合 接种不定芽个数 生根株数 生根率∥% 平均生根条数∥株 试管苗长势
葡萄糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L NAA 60 43 71. 7 5. 1 + +
葡萄糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L IBA 60 28 46. 7 3. 4 +
葡萄糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L 2,4-D 60 0 0 0 -
蔗糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L NAA 60 59 98. 3 7. 8 + + +
蔗糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L IBA 60 44 73. 3 5. 2 + +
蔗糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L 2,4-D 60 0 0 0 -
麦芽糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L NAA 60 23 38. 3 3. 1 +
麦芽糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L IBA 60 24 40. 0 3. 0 +
麦芽糖 0. 6 mg /L IAA +0. 1 mg /L 2,4-D 60 0 0 0 -
注:-不生根;+长势一般;+ +长势较好;+ + +长势旺盛。生长素单位:mg /L。
2. 5 试管苗移栽与定植 移栽后 35 d观察统计证明,以炉
灰渣为移栽基质的共移栽成活 77 株,移栽成活率为
96. 25%,以河沙为移栽基质的共移栽成活 68 株,移栽成活
率为 97. 1%。共移栽成活 145株,成活率为 96. 7%。以河沙
和炉灰渣为移栽基质均较易移栽成活。定植后统计观察证
明,定植的成活率为 98. 6%。成活后 50 d内生长较缓慢,此
后生长速度加快,且外观上旺盛。定植苗次年可 5 月开花,
10月结果,其他植物学性状与野生华茶藨相同。
3 讨论
相关研究表明,在植物组织培养研究中,常用的 4 种生
长素,2,4-D诱导愈伤组织作用的效果最好[8],有人甚至使用
的 2,4-D浓度达到了 5. 0 mg /L,但在试验中,出现了添加浓
度为 3. 0 mg /L 2,4-D愈伤组织就不生长的现象。这种现象
可能是由于以下原因引起:不同的植物或同一植物不同组
织,愈伤组织的诱导生长所需要的 2,4-D 浓度不同;高浓度
的 2,4-D会由于其毒害作用抑制愈伤组织的诱导生长;生长
调节剂之间的协同作用。愈伤组织的诱导培养的培养基中,
不仅需要添加生长素,而且还需要添加一定的细胞分裂素,
在已报道的愈伤组织诱导生长培养研究中,培养基中所添加
的细胞分裂素多是 6-BA 或 KT[9 -10],而试验添加的是 ZT。
由此可能出现在与 ZT协同作用时,在添加浓度为 3. 0 mg /L
2,4-D时就会完全抑制愈伤组织的诱导生长。
该研究中的定植苗不仅第 2年能正常开花结果,其他植
物性状完全与野生华茶藨一致,这说明用愈伤组织诱导培养
所获得的试管苗,可以作为濒危植物———华茶藨资源保护的
有效途径。
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