全 文 ：华茶藨组织培养及试管苗繁殖的研究
方 鹏1，宁淑香2 (1．铁岭师范高等专科学校，辽宁铁岭 112008;2．辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116081)
摘要 ［目的］对华茶藨组织进行培养，并研究试管苗的繁殖。［方法］以华茶藨为材料，采用嫩茎组织培养方法，进行愈伤组织诱导、增
殖、分化培养，以及试管苗生根、移栽、定植的研究。［结果］MS +35 g /L蔗糖 +0． 4 mg /L NAA +0． 4 mg /L ZT +1． 8 mg /L 2，4 － D为嫩茎
愈伤组织诱导培养的适宜培养基;MS +1． 6 mg /L 2，4 － D +0． 6 mg /L 6 － BA +0． 3 mg /L NAA的固态培养基是愈伤组织增殖培养的适宜
培养基;MS +0． 5 mg /L ZT +0． 1 mg /L NAA为愈伤组织分化培养和不定芽繁殖培养的适宜培养基。1 /2MS + 0． 6 mg /L IAA + 0． 1 mg /L
NAA +16 g /L蔗糖为试管苗培养和试管苗繁殖培养的适宜培养基。试管苗移栽成活率为 96． 7%;试管苗定植成活率为 98． 6%。［结
论］定植苗次年可 5月开花，10月结果，其他植物学性状均与野生华茶藨一致。
关键词 华茶藨(Ｒibes fasciculatum);试管苗;组织培养
中图分类号 S188;Ｒ282 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2013)34 －13117 －03
Study on Tissue Culture and Tube Seedlings’Propagation of Ｒibes fasciculatum
FANG Peng et al (Tieling Normal College，Tieling，Liaoning 112008)
Abstract ［Objective］To conduct tissue culture of Ｒibes fasciculatum and study propagation of tube seedlings． ［Method］With the method of
tissue culture，the tender stems of Ｒibes fasciculatum were used as materials to do the research on callus inducement，propagation and differen-
tiation;cultivation，transplantation of tube seedlings and stable planting． ［Ｒesult］The results demonstrated that MS + sucrose 35 g /L + 0． 4
mg /L NAA + 0． 4 mg /L ZT + 1． 8 mg /L 2，4-D was the ideal medium for callus inducement;MS + 1． 6 mg /L 2，4-D + 0． 6 mg /L 6-BA + 0． 3
mg /L NAA was the ideal medium for callus multiplication;MS + 0． 5 mg /L ZT + 0． 1 mg /L NAA was the optimum medium for callus differen-
tiation cultivation and adventitious buds cultivation;The ideal medium for cultivation and propagation of tube seedlings was 1 /2MS + 0． 6 mg /L
IAA + 0． 1 mg /L NAA + 16 g /L sucrose． The transplanting survival rate of tube seedlings was 96． 7% and stable planting survival rate was
98. 6% ． ［Conclusion］The flowering of the tube seedlings stable planted the second year can be normal and it maintained all botany character-
istics of the wild Ｒibes fasciculatum．
Key words Ｒibes fasciculatum;Tube seedlings;Tissue culture
作者简介 方鹏(1976 － ) ，男，辽宁铁岭人，副教授，硕士，从事细胞生
物学研究。
收稿日期 2013-11-03
华茶藨(Ｒibes fasciculatum) ，又称大蔓茶藨，属虎耳草科
茶藨子属灌木植物，生长于山坡灌木林中，在中国的江苏、浙
江、湖北、河南和山东等地有分布［1］，在辽宁大连的旅顺也有
分布［2］，但分布区域小，其数量也很少，而当地人又有在每年
10月下旬摘取果实用于食用或酿酒的习惯，从而使这种野生
植物数量越来越少，已经成为辽宁地区的濒危植物［3］。为保
护这种野生资源，研究者以嫩茎为材料，对华茶藨进行了试
管苗繁殖的研究。此前已有关于茶藨子类植物研究的报告，
但都是关于传统繁殖技术的研究［4 －6］，迄今关于茶藨子属植
物组织培养及试管苗培养研究鲜有报道。笔者以华茶藨为
材料，采用嫩茎组织培养方法，进行愈伤组织诱导、增殖、分
化培养，以及试管苗生根、移栽、定植的研究，以期为华茶藨
的进一步开发研究提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 将旅顺老铁山上生长较旺盛的华茶藨挖回来
后，栽到花盆中，春天当植株开始旺盛生长时，连续 4 d向根
部浇灌和向植株表面喷洒浓度为 3 mg /L 庆大霉素与 0． 3
mg /L NAA混合溶液。第 4 天处理完 24 h 后，将嫩茎剪下，
作为实验室中的试验材料。接种前的嫩茎采用翻白草灭菌
方法［7］进行彻底灭菌 。
1． 2 培养条件 与翻白草研究的培养条件一致［7］。
1． 3 嫩茎切口愈伤组织诱导培养 在无菌培养皿中，将灭
菌后的嫩茎先切成长0． 5 ～0． 7 cm的茎段，再从中间纵切开。
然后以材料的纵切面平放到培养基上的方式，将培养材料接
种到以 MS +35 g /L蔗糖 +0． 4 mg /L NAA为基本培养基，分
别附加浓度为0． 4、0． 8和1． 2 mg /L ZT与附加浓度分别为0．
6、1． 2、1． 8、2． 4和 3． 0 mg /L 5 种浓度 2，4-D的培养基上，进
行不同浓度 ZT与不同浓度 2，4-D的生长调节剂组合对嫩茎
愈伤组织诱导培养的试验。每种处理培养 15瓶，每瓶接种 6
个嫩茎段，试验重复 2 次。培养试验前 25 d进行暗培养，之
后进行光照培养。
1． 4 愈伤组织繁殖培养 将由嫩茎段培养的愈伤组织，从
培养瓶中全部取出称重后，直接接种到固态、液态 2 类、4 种
培养基上，进行不同状态、不同培养基对愈伤组织繁殖培养
的试验。在保证 2种状态培养的温度、光照条件不变的情况
下，液态培养基在放到 90 r /min的摇床上进行振荡培养。培
养到 46 d 时，进行称重统计观察。扩增培养试验重复了 2
次，液态、固态 2类培养基，每个培养瓶中接种的愈伤组织分
散为6 ～8块状，重量为0． 7 ～1． 2 g。每种培养基用于试验的
材料 20瓶，
1． 5 愈伤组织分化培养 将在 MS + 1． 6 mg /L 2，4-D + 0． 6
mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA固体培养基上增殖培养的嫩绿
色愈伤组织用解剖刀分割成长约 0． 4 cm的块状后，接种到
以 MS为基本培养基，附加浓度各异的 ZT与 NAA或 IBA的
不同生长调节剂组合的琼脂固体培养基上，进行黑暗和光照
两种环境中愈伤组织分化的培养。分化试验重复 2 次，每种
培养基用于试验的材料为 60块。
1． 6 生根培养 把由愈伤组织培养的不定芽在下部剪下，
形成独立不定芽后，在以 1 /3MS为基本培养基、与附加不同
碳源及不同生长素组合的培养基上，进行以不定芽为材料的
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(34):13117 － 13119 责任编辑 石金友 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.34.060
试管苗培养试验。此试验重复了 1 次重复，一种处理以 60
个不定芽为试验材料。
1． 7 试管苗移栽与定植 将重复培养 26 d的试管苗培养瓶
打开，在日光温室内炼苗4 d后，移栽到下半部与上半部分别
为河沙和炉灰渣的营养钵中。并在此后 10 d内保持无直射
光和 75% ～90%的湿度条件。以炉灰渣为移栽基质的移栽
了 80株，以河沙为移栽基质的移栽了 70 株，每个营养钵中
移栽 2株试管苗，共对 150株试管苗进行了移栽试验。将栽
成活的 140株试管苗，定植到旅顺山坡上的丛林旁，并进行
不定期地进行统计观察。
2 结果与分析
2． 1 不同浓度 ZT 与 2，4-D 的组合对愈伤组织培养的影
响 由表 1可知，在浓度为 0． 4、0． 8 和 1． 2 mg /L ZT与浓度
为 3． 0 mg /L的 2，4-D 组合的培养基上，培养材料不形成愈
伤组织，而在其他组合的培养基上，培养材料均可形成愈伤
组织。其中在浓度为 0． 4 mg /L的 ZT与浓度为 1． 8 mg /L 2，
4-D的培养基上，观察统计的愈伤组织生长率和长势均为最
好。观察表明，在这一培养基上培养的嫩茎段，培养到 7 d时
可见开始生长出愈伤组织，之后，随着愈伤组织块不断增大，
生长率迅速提高，培养到 50 d时，就可以培养出外观上嫩绿
色、由许多性状不规则颗粒组成的、大小为0． 5 ～1． 3 cm的愈
伤组织块。重复试验与初次试验的结果一致。这说明浓度
为 0． 4 mg /L ZT与 1． 8 mg /L 2，4-D 的生长调节剂组合为愈
伤组织诱导培养的适宜组合。由此说明，将培养材料接种到
MS +35 g /L蔗糖 +0． 4 mg /L NAA +0． 4 mg /L ZT +1． 8 mg /L
2，4-D这种培养基是诱导培养华茶藨嫩茎愈伤组织的适合培
养基。
表 1 不同浓度 ZT与 2，4-D的组合对愈伤组织培养的影响
ZT
mg /L
2，4-D
mg /L
接种培养茎
段个数
生长愈伤组
织茎段个数
生长率
%
愈伤组织
长势
0． 4 0． 6 90 26 28． 9 +
0． 8 0． 6 90 24 26． 7 +
1． 2 0． 6 90 31 34． 4 +
0． 4 1． 2 90 52 57． 8 + +
0． 8 1． 2 90 50 55． 6 +
1． 2 1． 2 90 43 47． 8 +
0． 4 1． 8 90 90 100． 0 + + +
0． 8 1． 8 90 78 86． 7 + +
1． 2 1． 8 90 65 72． 2 + +
0． 4 2． 4 90 21 23． 3 +
0． 8 2． 4 90 16 17． 8 +
1． 2 2． 4 90 13 14． 4 +
0． 4 3． 0 90 0 0 －
0． 8 3． 0 90 0 0 －
1． 2 3． 0 90 0 0 －
注:－为部分化;+为长势一般;+ +为长势较好;+ + +为长势旺盛。
2． 2 不同状态、不同培养基对愈伤组织增殖培养的影
响 由表 2可知，在 2 种状态的培养基上，固态培养基的效
果明显好于液态培养基。在本试验所进行的 4 种不同的固
体培养基研究中，在 MS + 1． 6 mg /L 2，4-D + 0． 6 mg /L
6-BA +0． 3 mg /L NAA这一培养基上所统计观察的 3项指标
中均为最好。观察还表明，在这种培养基上培养至 46 d时，
愈伤组织生长为嫩绿色的、由很多颗粒组成、且大小为 1． 5
cm左右的块状。结果表明，MS +1． 6 mg /L 2，4-D +0． 6 mg /L
6-BA +0． 3 mg /L NAA的固态培养基是华茶藨愈伤组织增殖
培养的合适培养基。
表 2 不同状态、不同培养基对愈伤组织增殖培养的影响
培养基状态 培养基 增重率∥% 愈伤组织质地、外观色泽、表面状态 愈伤组织长势
固态 MS +0． 8 mg /L 2，4-D +0． 3 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 316． 4 质地松软、淡黄色、较光滑 + +
固态 MS +1． 6 mg /L 2，4-D +0． 6 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 789． 4 质地适中、嫩绿色、不等颗粒状 + + +
固态 MS +2． 4 mg /L 2，4-D +0． 9 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 616． 0 较硬、黄间绿白相间、凸凹 + +
固态 MS +3． 2 mg /L 2，4-D +1． 2 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 163． 2 质地硬、绿间带白、凸凹 + +
液态 MS +0． 8 mg /L 2，4-D +0． 3 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 153． 3 松软、淡黄色、光滑 +
液态 MS +1． 6 mg /L 2，4-D +0． 6 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 306． 5 较软、淡黄色、光滑间有凸凹 +
液态 MS +2． 4 mg /L 2，4-D +0． 9 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 234． 8 上硬下软、淡黄色、大颗粒 +
液态 MS +3． 2 mg /L 2，4-D +1． 2 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L NAA 146． 2 较硬、灰黄色、不均大小颗粒 +
注:+为长势一般;+ +为长势较好;+ + +为长势旺盛;生长调节剂单位为 mg /L。
2． 3 光暗条件与不同培养基对愈伤组织分化培养的影
响 由表 3可知，在黑暗的条件下进行培养，愈伤组织不分
化，而光照培养的条件下愈伤组织均能不同程度的分化。其
中在 MS + 0． 5 mg /L ZT + 0． 1 mg /L NAA的培养基上，愈伤
组织的分化率最高。对分化培养的过程进行观察还表明，在
MS + 0． 5 mg /L ZT + 0． 1 mg /L NAA 这一培养基上，培养至
第 5天时可见有的愈伤组织上部分化出芽点，之后随着芽点
逐渐长成为不定芽，其分化率也不断增加。待培养到 54 d时
每块愈伤组织上可生长出多个高 1． 2 cm左右的不定芽。并
且重复试验中也得到了基本一致的结果。结果表明，在光照
培养的条件下，MS + 0． 5 mg /L ZT + 0． 1 mg /L NAA 的培养
基就是华茶藨愈伤组织分化培养的合适培养基。把分化培
养的不定芽在下部与培养基接触的部位剪下后，再接种
MS +0． 5 mg /L ZT + 0． 1 mg /L NAA 这种培养基上进行3 ～5
次继代培养，每继代 1 次，就会繁殖培养出多个基部生长在
一起的不定芽，平均每代的繁殖系数为 3． 3。由此也说明
MS + 0． 5 mg /L ZT +0． 1 mg /L NAA这种培养基也为华茶藨
不定芽繁殖培养的合适培养基。
2． 4 不同碳源、不同生长素组合对不定芽生根培养的影
响 由表 4可知，3种不同的碳源都能不同程度的促进不定
芽生根生长为试管苗，其中蔗糖的效果最好。在 3种生长素
组合中，0． 6 mg /L IAA + 0． 1 mg /L 2，4-D 不生根，以 0． 6
81131 安徽农业科学 2013 年
mg /L IAA +0． 1 mg /L NAA这一组合的效果最好。在以蔗糖
为碳源、以 0． 6 mg /L IAA + 0． 1 mg /L NAA为生长素组合的
培养基上。其试管苗的茎平均粗度、叶片数和试管苗高度 3
项指标也均为最好。并且 2 次重复试验的结果几近相似。
这表明蔗糖是生根培养基的理想碳源，而 0． 6 mg /L IAA +
0． 1 mg /L NAA为不定芽试管苗生根培养的适宜生长素组
合。也就是说 1 /2MS + 0． 6 mg /L IAA + 0． 1 mg /L NAA + 16
g /L蔗糖这一培养基是华茶藨不定芽生根培养的适宜培养
基。把在这一培养基上培养的试管苗切成长约 1． 2 cm，至
少具有 2生长点(外观上是具有 2 个叶片)的茎段后，在这
一培养基上进行继代循环培养，就会繁殖出满足数量需要
的试管苗。统计观察表明:1个培养周期(32 d)繁殖系数为
2． 8，并且繁殖的试管苗生长得比使用不定芽为材料生根培
养的试管苗生长旺盛。这说明，1 /2MS + 0． 6 mg /L IAA +
0. 1 mg /L NAA + 16 g /L蔗糖也是华茶藨试管苗繁殖培养的
适宜培养基。
表 3 不同光照条件、不同培养基对愈伤组织分化培养的影响
光照
条件
培养基
分化率
%
平均每块愈
伤组织分化
不定芽个数
愈伤
组织
长势
光照 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 05 mg /L NAA 48． 3 3． 1 + +
光照 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 1 mg /L NAA 96． 7 6． 0 + + +
光照 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 3 mg /L NAA 56． 7 2． 3 + +
光照 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 5 mg /L NAA 51． 7 1． 6 +
光照 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 05 mg /L NAA 35． 0 2． 4 + +
光照 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 1 mg /L NAA 76． 7 3． 4 + +
光照 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 3 mg /L NAA 45． 0 1． 9 +
光照 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 5 mg /L NAA 31． 7 1． 9 +
暗 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 05 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 1 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 3 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +0． 5 mg /L ZT +0． 5 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 05 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 1 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 3 mg /L NAA 0 0 －
暗 MS +1． 0 mg /L ZT +0． 5 mg /L NAA 0 0 －
注:－为不分化;+为长势一般;+ +为长势较好;+ + +为长势旺盛。
表 4 不同碳源、不同生长素组合对不定芽生根培养的影响
碳源 生长素组合 接种不定芽个数 生根株数 生根率∥% 平均生根条数∥株 试管苗长势
葡萄糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L NAA 60 43 71． 7 5． 1 + +
葡萄糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L IBA 60 28 46． 7 3． 4 +
葡萄糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L 2，4-D 60 0 0 0 －
蔗糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L NAA 60 59 98． 3 7． 8 + + +
蔗糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L IBA 60 44 73． 3 5． 2 + +
蔗糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L 2，4-D 60 0 0 0 －
麦芽糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L NAA 60 23 38． 3 3． 1 +
麦芽糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L IBA 60 24 40． 0 3． 0 +
麦芽糖 0． 6 mg /L IAA +0． 1 mg /L 2，4-D 60 0 0 0 －
注:－不生根;+长势一般;+ +长势较好;+ + +长势旺盛。生长素单位:mg /L。
2． 5 试管苗移栽与定植 移栽后 35 d观察统计证明，以炉
灰渣为移栽基质的共移栽成活 77 株，移栽成活率为
96. 25%，以河沙为移栽基质的共移栽成活 68 株，移栽成活
率为 97． 1%。共移栽成活 145株，成活率为 96． 7%。以河沙
和炉灰渣为移栽基质均较易移栽成活。定植后统计观察证
明，定植的成活率为 98． 6%。成活后 50 d内生长较缓慢，此
后生长速度加快，且外观上旺盛。定植苗次年可 5 月开花，
10月结果，其他植物学性状与野生华茶藨相同。
3 讨论
相关研究表明，在植物组织培养研究中，常用的 4 种生
长素，2，4-D诱导愈伤组织作用的效果最好［8］，有人甚至使用
的 2，4-D浓度达到了 5． 0 mg /L，但在试验中，出现了添加浓
度为 3． 0 mg /L 2，4-D愈伤组织就不生长的现象。这种现象
可能是由于以下原因引起:不同的植物或同一植物不同组
织，愈伤组织的诱导生长所需要的 2，4-D 浓度不同;高浓度
的 2，4-D会由于其毒害作用抑制愈伤组织的诱导生长;生长
调节剂之间的协同作用。愈伤组织的诱导培养的培养基中，
不仅需要添加生长素，而且还需要添加一定的细胞分裂素，
在已报道的愈伤组织诱导生长培养研究中，培养基中所添加
的细胞分裂素多是 6-BA 或 KT［9 －10］，而试验添加的是 ZT。
由此可能出现在与 ZT协同作用时，在添加浓度为 3． 0 mg /L
2，4-D时就会完全抑制愈伤组织的诱导生长。
该研究中的定植苗不仅第 2年能正常开花结果，其他植
物性状完全与野生华茶藨一致，这说明用愈伤组织诱导培养
所获得的试管苗，可以作为濒危植物———华茶藨资源保护的
有效途径。
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9113141卷 34期 方 鹏等 华茶藨组织培养及试管苗繁殖的研究