全 文 ：西北农业学报　２０１５，２４（４）：６－１２
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１５．０４．００２
网络出版日期：２０１５－０４－２１
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１５０４２１．２２４１．００２．ｈｔｍｌ
小花棘豆中毒对大鼠睾丸α－甘露糖苷酶的影响
收稿日期：２０１４－１０－０５　　修回日期：２０１４－１２－０１
基金项目：国家自然科学基金（３１４６０６７８）；新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题（ＨＳ２０１４０９）。
第一作者：贾琦珍，女，硕士，助理研究员，从事动物病理学方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｘｕｅ１９８４５２１＠１２６．ｃｏｍ
通信作者：王　帅，男，硕士，实验师，从事牧草资源开发利用方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｓｈｕａｉｄｋｙ＠１２６．ｃｏｍ
贾琦珍１，２，陈根元２，３，吴书奇２，王　帅２，３
（１．塔里木大学 生命科学学院，新疆阿拉尔　８４３３００；２．新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，
新疆阿拉尔　８４３３００；３．塔里木大学 动物科学学院，新疆阿拉尔　８４３３００）
摘　要　旨在探讨小花棘豆对大鼠睾丸α－甘露糖苷酶（ＡＭＡ）的影响，揭示小花棘豆的毒性作用机理。将７２
只大鼠随机分为４组，即对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后，按Ⅰ组添加１５０ｇ／ｋｇ（含苦马豆
素３０ｍｇ／ｋｇ）、Ⅱ组添加３００ｇ／ｋｇ（含苦马豆素６０ｍｇ／ｋｇ）、Ⅲ组添加４５０ｇ／ｋｇ（含苦马豆素９０ｍｇ／ｋｇ）的比例
制作混合饲料，饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后每７ｄ每组随机采集２只大鼠的睾丸，检测大鼠睾丸
ＡＭＡ活性及表达的变化。结果显示，在６３ｄ的试验过程中，试验组及对照组大鼠睾丸高尔基体α－甘露糖苷
酶Ⅱ（ＡＭＡ１）和溶酶体α－甘露糖苷酶（ＡＭＡ２）均有表达，但各试验组表达转录水平与对照组差异显著，试验
Ⅰ组大鼠ＡＭＡ１和ＡＭＡ２的表达与对照组差异不显著（Ｐ＞０．０５），但试验Ⅲ组大鼠 ＡＭＡ１和 ＡＭＡ２的表
达均显著低于对照，随着试验的进行，抑制效果愈加明显。说明，小花棘豆中毒可影响大鼠睾丸ＡＭＡ的活性
及其基因的转录表达。
关键词　 小花棘豆；苦马豆素；α－甘露糖苷酶；大鼠；睾丸
中图分类号　Ｓ８５６．９　　　文献标志码　Ａ　　　　　文章编号　１００４－１３８９（２０１５）０４－０００６－０７
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ　ＤＣ　Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ
ｏｎα－Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ　ｉｎ　Ｒａｔ　Ｔｅｓｔｉｓ
ＪＩＡ　Ｑｉｚｈｅｎ１，２，ＣＨＥＮ　Ｇｅｎｙｕａｎ２，３，ＷＵ　Ｓｈｕｑｉ　２　ａｎｄ　ＷＡＮＧ　Ｓｈｕａｉ　２，３
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｒｉｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｌａｒ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８４３３００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔａｒｉｍ　Ａｎｉｍａｌ
Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　＆Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ａｌａｒ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８４３３００，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｒｉｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｌａｒ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８４３３００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｉｓ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ　ＤＣ　ｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆα－ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ（ＡＭＡ）ｉｎ　ｔｅｓｔｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｏ．ｇｌａｂｒａ　ＤＣ．７２ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４ｇｒｏｕｐｓ　ｒａｎｄｏｍｌｙ（ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ－
ｔａｌ　ｇｒｏｕｐⅠ，Ⅱ，Ⅲ），Ｔｈｅ　ｄｒｉｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｏｆ　Ｏ．ｇｌａｂｒａ　ＤＣ　ｗａｓ　ｃｒｕｓｈｅｄ，ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒａｓｓ
ｐｏｗｄｅｒ（１５０ｇ／ｋｇ，３００ｇ／ｋｇ　ａｎｄ　４５０ｇ／ｋｇ，ｔｈｅ　ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　３０ｍｇ／ｋｇ，６０ｍｇ／ｋｇ，９０
ｍｇ／ｋｇ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｗｅｒｅ　ｍｉｘｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆｅｅｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｃｏｎｓｕｍｅｄ
ｔｈｅ　ｆｏｒａｇｅｓ　ｆｒｅｅｌｙ　ｕｎｔｉｌ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｓｙｍｐｔｏｍｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．２ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ
ｇｒｏｕｐ　ｅｖｅｒｙ　ｗｅｅｋ，ｔｈｅ　ｔｅｓｔｉｃｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＡＭＡ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｉｎ　６３ｄｔｅｓｔ　ｐｅｒｉｏｄ，Ｗｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ＡＭＡ　ｉｎ　ｇｏｌｇｉ　ａｎｄ　ｌｙｓｏ－
ｓｏｍａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｅｓｔｉｃｌｅｓ　ｏｆ　ａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐｓ，Ｏ．ｇｌａｂｒａ　ＤＣ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｓｔｉ－
ｃｌｅｓ　ＡＭＡ１ａｎｄ　ＡＭＡ２ｍＲＮＡ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｉｎ　ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐⅠａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５），ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＭＡ１ａｎｄ　ＡＭＡ２ｍＲＮＡ　ｄｅ－
ｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ Ⅲ ，ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｏ．ｇｌａｂｒａ　ＤＣ　ｈａｄ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＭＡ
ｉｎ　ｒａｔ　ｔｅｓｔｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ　ＤＣ；Ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ；α－Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ；Ｒａｔ；Ｔｅｓｔｉｓ
　　小花棘豆（Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ　ｇｌａｂｒａ　ＤＣ）广泛分布
于新疆和田、阿克苏等地区，目前已严重危害新疆
草原畜牧业的发展［１］。据不完全统计，仅阿克苏
地区的２７１．９７万ｈｍ２ 天然草场中广泛丛生小花
棘豆的面积已超过４０万ｈｍ２，每年因采食小花棘
豆而中毒的家畜占放牧家畜总数的５％～１０％，
中毒动物表现为机体的广泛性损伤，其中尤以神
经系统和繁殖系统损伤最为明显［２］。国内外研究
发现，苦马豆素（Ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ，ＳＷ）是小花棘豆的
主要毒性成分［３］，可通过抑制α－甘露糖苷酶（α－
ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ，ＡＭＡ）活性，导致机体甘露糖代谢
发生异常而发挥毒性作用［４－５］。研究表明，ＡＭＡ
是动物小花棘豆中毒特异性最强的指标［６］，小花
棘豆中毒动物的 ＡＭＡ活性受到显著抑制，但对
其转录、翻译、加工修饰等的影响尚不清楚，中毒
动物繁殖器官ＡＭＡ的变化未见报道。本研究以
新疆南疆地区小花棘豆为毒源，通过ＥＬＩＳＡ、免
疫组化和荧光实时定量ＰＣＲ法，研究小花棘豆攻
毒对大鼠睾丸ＡＭＡ活性、分布及表达的影响，为
揭示小花棘豆中毒机制提供资料。
１　材料与方法
１．１　材 料
小花棘豆由塔里木大学动物科学学院草业科
学学科组提供，采自新疆阿克苏市乌什县亚科瑞
克乡，样品为风干样。
ＡＭＡ检测试剂盒、Ｓ－Ｐ超敏组化试剂盒，均
为南京建成生物技术有限公司产品；总ＲＮＡ提
取试剂Ｔｒｉｚｏｌ、反转录试剂盒、ＰＣＲ扩增试剂盒
Ｈｏｔ－ｓｔａｒｔ　ＰＣＲ　Ｍｉｘ、实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒
ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ＰＣＲ　Ｍｉｘ，均为美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈ－
ｅｒ科技有限公司产品；其他试剂均为国产分析
纯，实验室用水为超纯水。
５３３１型ＰＣＲ仪、Ｒｅａｌｐｌｅｘ　２型实时荧光定量
ＰＣＲ仪，均为德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品；Ｃａｒｒｙ
１００型紫外－可见分光光度计，美国Ｖａｒｉａｎ技术
有限公司产品；ＤＹＹ－Ⅱ型电泳仪，北京六一仪器
厂产品；ＰＲＯ２５０型组织匀浆仪，美国Ｐｒｏ　Ｓｃｉｅｎ－
ｔｉｆｉｃ公司产品；ＧＥＬＤＯＣ－ＩＴ型凝胶成像分析仪，
美国ＵＶＰ公司产品；Ｑｕｂｉｔ　２．０型核酸蛋白定量
仪，美国Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ生物技术公司产品；
ＭＲ２３１型高速冷冻离心机，法国Ｊｏｕａｎ公司产
品；Ｄｉｒｅｃｔ－Ｑ３型超纯水系统，美国 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司
产品。
１．２　试验动物
３月龄ＳＰＦ级雄性 Ｗｉｓｔａｒ大鼠７２只，体质
量（２００±１５）ｇ，购自塔里木大学动物科学学院实
验站。
１．３　试验设计
随机分为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验
Ⅲ组，每组１８只。分笼饲养，自由采食和饮水。
对照组饲喂大鼠饲料，其组成为：面粉３００ｇ／ｋｇ，
玉米粉２９０ｇ／ｋｇ，豆饼２００ｇ／ｋｇ，麸皮１００ｇ／ｋｇ，
鱼粉５０ｇ／ｋｇ，酵母粉１０ｇ／ｋｇ，植物油１０ｇ／ｋｇ，
鱼肝油１０ｇ／ｋｇ，食盐１０ｇ／ｋｇ，骨粉１０ｇ／ｋｇ，矿
物质添加剂９ｇ／ｋｇ。维生素添加剂１ｇ／ｋｇ［２］；试
验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别饲喂小花棘豆质量分数
为１５０、３００和４５０ｇ／ｋｇ的混合饲料。根据气相
色谱法测定结果［７］，相当于ＳＷ 添加量为３０、６０
和９０ｍｇ／ｋｇ。试验持续６３ｄ。攻毒后每７ｄ每
组随机取２只大鼠，剖杀后取睾丸，部分进行免疫
组化染色分析，部分利用冰生理盐水制备１００
ｇ／Ｌ的组织匀浆液用于检测 ＡＭＡ活性，部分组
织用液氮保存用于检测ｍＲＮＡ水平表达的影响。
所有解剖工具及冻存管均预先用ＤＥＰＣ水处理。
１．４　ＡＭＡ在小花棘豆中毒大鼠睾丸组织中分布
的测定
大鼠睾丸使用４０ｍＬ／Ｌ多聚甲醛固定，梯度
酒精脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋。包埋组
织连续切片，片厚６μｍ，二甲苯脱蜡，梯度酒精复
水，然后按照试剂盒说明操作，其中抗体稀释比为
１∶１００，ＤＡＢ显色，以ＰＢＳ为阴性对照。常规脱
水，透明，封片，光镜下观察组织病理学变化，采用
Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ　６．０软件分析免疫组化获得的照片。
１．５　小花棘豆中毒大鼠睾丸ＡＭＡ在 ｍＲＮＡ表
达水平的测定
１．５．１　引物设计与合成　根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库
大鼠高尔基体α－甘露糖苷酶Ⅱ（ＡＭＡ１）、溶酶体
·７·４期 贾琦珍等：小花棘豆中毒对大鼠睾丸α－甘露糖苷酶的影响
α－甘露糖苷酶（ＡＭＡ２）和β－ａｃｔｉｎ基因的核苷酸
序列，采用Ｂｅａｃｏｎ　Ｄｅｓｉｇｎｅｒ软件设计引物，引物
由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物
信息见表１。
１．５．２　总ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ合成　参照Ｔｈｅｒ－
ｍｏ公司说明书提取大鼠睾丸总ＲＮＡ，然后用核
酸蛋白检测仪测定其ＯＤ２６０和ＲＮＡ浓度，采用１０
ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ的完整性。确认
提取的ＲＮＡ合格后采用反转录试剂盒进行反转
录反应。反转录反应体系见表２。其反应程序
为：９５℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５５℃退火
３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，反应４０个循环，７２℃最终
延伸１０ｍｉｎ［５］。
１．５．３　普通ＰＣＲ及基因测序　ＰＣＲ反应体系
见表３。其反应程序为：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ，
９４℃变性２０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，
反应３０个循环，７２℃最终延伸１０ｍｉｎ［５］。ＰＣＲ
产物用１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增阳性者
送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
１．５．４　实时荧光定量 ＰＣＲ 检测大鼠睾丸中
ＡＭＡ的相对表达　实时荧光定量ＰＣＲ反应体
系见表４。其反应程序为：９５℃预变性３ｍｉｎ，
９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，反
应３５～４０个循环，７２℃最终延伸１０ｍｉｎ［５］。
１．６　数据分析
采用ＳＰＳＳ　１６．０软件的 Ｏｎｅ－Ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ
方法进行单因素方差分析。
２　结果与分析
２．１　ＡＭＡ在大鼠睾丸组织中的分布
ＡＭＡ在大鼠睾丸精曲小管、精直小管、间质
细胞等均有分布，其中在精曲小管的分布较精直
小管和间质细胞等明显（图１）。小花棘豆攻毒大
鼠睾丸组织中ＡＭＡ分布下降，试验Ⅰ组与对照
表１　引物设计
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｄｅｓｉｇｎ
项目
Ｉｔｅｍ
引物和探针序列（５′→３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
产物大小／ｂｐ
Ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｔ
ＧｅｎＢａｎｋ编号
ＧｅｎＢａｎｋ　ＩＤ
ＡＭＡ１ Ｆ：ＴＣＡＧＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣ　 ＮＭ　０１２９７９．２
Ｒ：ＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＴＴ　 １８９ ＮＰ＿０３７１１１．２
ＡＭＡ２ Ｆ：ＡＡＡＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＧ　 ＮＭ　１９９４０４．１
Ｒ：ＴＴＴＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧ　 １２０ ＮＰ＿９５５４３６．１
β－ａｃｔｉｎ　 Ｆ：ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＴ　 ＮＭ　００７３９３．２
Ｒ：ＡＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧ　 １０４ ＮＰ＿０３１４１９．１
表２　反转录反应体系
Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
项 目　Ｉｔｅｍ 体积／μＬ　Ｖｏｌｕｍｅ
Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｓｕｐｅｒ　Ｍｉｘ　２× １２．５
模板ｃＤＮＡ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｃＤＮＡ　 １．０
上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　 １．０
下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　 １．０
ｄｄＨ２Ｏ　 ９．５
合 计　Ｔｏｔａｌ　 ２５．０
表３　ＰＣＲ反应体系
Ｔａｂｌｅ　３　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
项 目　Ｉｔｅｍ 体积／μＬ　Ｖｏｌｕｍｅ
Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　２× １２．５
模板ｃＤＮＡ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｃＤＮＡ　 ２．０
上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　 ２．０
下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　 ２．０
ｄｄＨ２Ｏ ６．５
合 计　Ｔｏｔａｌ　 ２５．０
表４　实时荧光定量ＰＣＲ反应体系
Ｔａｂｌｅ　４　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
项 目　Ｉｔｅｍ 体积／μＬ　Ｖｏｌｕｍｅ
Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭⅡ２× ７．５
模板ｃＤＮＡ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｃＤＮＡ　 １．０
上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　 ０．３
下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　 ０．３
ｄｄＨ２Ｏ　 ５．９
合 计　Ｔｏｔａｌ　 １５．０
组差异不显著（Ｐ＞０．０５），但试验Ⅱ组和试验Ⅲ组下
降明显，其中试验Ⅲ组在攻毒第３５天后ＡＭＡ免疫
组化染色极淡，表明其已经几乎不表达。
２．２　引物的可靠性验证
由图２可知，β－ａｃｔｉｎ在１００ｂｐ左右出现条
带，ＡＭＡ１和 ＡＭＡ２基因分别在在１００ｂｐ和
２００ｂｐ间出现２条清晰条带，与试验设计的目的
条带大小相符，表明引物设计良好。
·８· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
Ａ．对照组　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ－Ｃ．试验组　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐｓ
图１　ＡＭＡ在对照组和试验组大鼠睾丸的分布（ＩＨＣ×４００）
Ｆｉｇ．１　 Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＭＡ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｔｅｓｔｉｃｌｅ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐｓ（ＩＨＣ×４００）
　　Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；１．ＡＭＡ１引物　ＡＭＡ１ｐｒｉｍｅｒ；２．ＡＭＡ２引物
　ＡＭＡ２ｐｒｉｍｅｒ；３．β－ａｃｔｉｎ引物　β－ａｃｔｉｎ　ｐｒｉｍｅｒ
图２　引物ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．２　ＰＣＲ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ
２．３　大鼠睾丸ＡＭＡ活性的变化
在整个试验期内，对照组大鼠睾丸 ＡＭＡ活
性无明显变化，试验组大鼠睾丸 ＡＭＡ活性均有
一定程度地下降，但试验Ⅰ组与对照组差异不显
著（Ｐ＞０．０５）。攻毒第７天时，各试验组大鼠睾
丸 ＡＭＡ 活性与对照组差异均不显著 （Ｐ＞
０．０５）；攻毒第１４天时，试验Ⅲ组大鼠睾丸ＡＭＡ
活性显著低于对照（Ｐ＜０．０５）；攻毒第２１天时，
试验Ⅲ组和试验Ⅱ组大鼠睾丸ＡＭＡ活性均显著
低于对照和试验Ⅰ组（Ｐ＜０．０５）；攻毒第２８天
时，试验Ⅲ组和试验Ⅱ组大鼠睾丸 ＡＭＡ活性均
极显著低于对照和试验Ⅰ组（Ｐ＜０．０１），并持续
至试验结束（表５）。说明，长时间、高剂量的摄食
小花棘豆可显著影响大鼠睾丸ＡＭＡ活性。
表５　试验期内大鼠睾丸组织ＡＭＡ活性的变化
Ｔａｂｌｅ　５　Ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ＡＭＡ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｔｅｓｔｉｃｌｅ　ｉｎ　ｔｅｓｔ　ｐｅｒｉｏｄｓ　 ｎｍｏｌ／（ｓ·Ｌ）
时间
Ｔｉｍｅ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
试验Ⅰ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅠ
试验Ⅱ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅡ
试验Ⅲ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅢ
第７天　Ｄａｙ　７　 １５．４８±３．０３　 １５．０１±２．９１　 １４．６４±２．７４　 １３．０３±２．７１
第１４天　Ｄａｙ　１４　 １６．１７±２．９７ａ １５．１２±２．６９ａ １３．１９±２．８７ａｂ　 １１．６２±１．８３ｂ
第２１天　Ｄａｙ　２１　 １６．３１±２．７１ａ １４．８６±２．２３ａｂ　 １１．０５±２．１２ｂ １０．８６±１．７６ｂ
第２８天　Ｄａｙ　２８　 １６．１８±２．８３Ａａ　 １４．３７±２．６０ＡＢａ　 ９．７３±２．２５ＢＣｂ　 ８．０７±１．７１Ｃｂ
第３５天　Ｄａｙ　３５　 １６．０１±２．４４Ａａ　 １４．１４±２．７２Ａａ　 ８．１９±１．８２Ｂｂ　 ７．１２±１．２３Ｂｂ
第４２天　Ｄａｙ　４２　 １５．９３±２．６５Ａａ　 １３．７２±２．２４Ａａ　 ７．５０±１．６２Ｂｂ　 ５．４５±１．１６Ｂｃ
第４９天　Ｄａｙ　４９　 １５．６４±３．００Ａａ　 １３．２８±２．１６Ａａ　 ７．６４±１．５４Ｂｂ　 ４．５３±１．３７Ｂｃ
第５６天　Ｄａｙ　５６　 １６．３６±３．１５Ａａ　 １３．１４±１．９７Ａａ　 ７．１９±１．３８Ｂｂ　 ４．４２±１．０８Ｂｃ
第６３天　Ｄａｙ　６３　 １５．８７±２．５９Ａａ　 １２．８６±２．０３Ａａ　 ６．８５±１．２１Ｂｂ　 ４．０５±０．９６Ｂｃ
注：同行小写字母不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５），大写字母不同表示差异极显著（Ｐ＜０．０１）。下表同。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄａｔａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｒｏｗ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ｄａｔａ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｕｐｐｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｓ　ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｂｅｌｏｗ．
·９·４期 贾琦珍等：小花棘豆中毒对大鼠睾丸α－甘露糖苷酶的影响
２．４　大鼠小花棘豆中毒对睾丸ＡＭＡ１在ｍＲＮＡ
水平表达的影响
由表６可知，各试验组大鼠睾丸中ＡＭＡ１均
有表达。与对照组相比，攻毒第２１天时试验Ⅰ
组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组大鼠睾丸中 ＡＭＡ１
ｍＲＮＡ表达量分别下降 １１．６３％、２７．９１％ 和
３３．７２％，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组均与对照组差异不
显著（Ｐ＞０．０５），但试验Ⅲ组显著低于对照（Ｐ＜
０．０５）；第３５天时，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ
组大鼠睾丸中 ＡＭＡ１ｍＲＮＡ 表达量分别下降
１３．２５％、４２．１７％和４９．４０％，其中试验Ⅲ组和试
验Ⅱ组均显著低于对照（Ｐ＜０．０５）；第６３天时，
试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组大鼠睾丸中
ＡＭＡ１ ｍＲＮＡ 表 达 量 分 别 下 降 １８．０７％、
５１．８１％和６９．８８％，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组极显著
低于对照（Ｐ＜０．０１）。说明，小花棘豆中毒可显
著影响大鼠高尔基体α－甘露糖苷酶Ⅱ在 ｍＲＮＡ
水平的表达，从而导致其活性下降。
２．５　大鼠小花棘豆中毒对睾丸ＡＭＡ２在ｍＲＮＡ
水平表达的影响
由表７可知。通过小花棘豆的攻毒饲喂，各
试验组大鼠睾丸ＡＭＡ２ｍＲＮＡ表达量均有不同
程度地下降。攻毒试验第４２ 天时，各试验组
ＡＭＡ２ｍＲＮＡ 表达量均与对照组差异不显著
（Ｐ＞０．０５）；第４９天开始，试验Ⅲ组大鼠睾丸中
ＡＭＡ２ｍＲＮＡ表达量显著低于对照（Ｐ＜０．０５），
但直至攻毒试验结束，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组与对
照组差异不显著（Ｐ＞０．０５）。总体而言，小花棘
豆中毒对大鼠睾丸ＡＭＡ１ｍＲＮＡ表达量的影响
较为显著，对 ＡＭＡ２ｍＲＮＡ 表达量的影响不
明显。
２．６　大鼠小花棘豆中毒对 ＡＭＡ基因序列的
影响
经ＤＮＡＳｔａｒ软件分析及 ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ 比
对，试验Ⅰ组大鼠睾丸 ＡＭＡ与公布的基因序列
完全一致，表明低剂量小花棘豆中毒对大鼠睾丸
ＡＭＡ活性及表达无显著影响。试验Ⅱ组和试验
Ⅲ组大鼠睾丸ＡＭＡ与公布的基因序列有较大差
异，试验第６３天时，试验Ⅲ组大鼠睾丸ＡＭＡ１与
公布的基因序列重合率只有９０％。各试验组大
鼠睾丸 ＡＭＡ２与公布的基因序列重合率均在
９５％以上。说明，大剂量的小花棘豆中毒对高尔
基体α－甘露糖苷酶Ⅱ有显著影响。
表６　ＡＭＡ１ｍＲＮＡ在大鼠睾丸组织相对表达量
Ｔａｂｌｅ　６　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＭＡ１ｍＲＮＡ　ｏｎ　ｒａｔｓ　ｔｅｓｔｉｓ
时间
Ｔｉｍｅ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
试验Ⅰ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅠ
试验Ⅱ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅡ
试验Ⅲ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅢ
第７天　Ｄａｙ　７　 ０．８２±０．２１　 ０．７８±０．１８　 ０．７５±０．１６　 ０．６９±０．１６
第１４天　Ｄａｙ　１４　 ０．８６±０．２１　 ０．７８±０．１７　 ０．７０±０．２０　 ０．６３±０．１１
第２１天　Ｄａｙ　２１　 ０．８６±０．２０ａ ０．７６±０．１５ａｂ　 ０．６２±０．１４ａｂ　 ０．５７±０．１１ｂ
第２８天　Ｄａｙ　２８　 ０．８４±０．２０ａ ０．７５±０．１７ａｂ　 ０．５５±０．１５ａｂ　 ０．４６±０．１２ｂ
第３５天　Ｄａｙ　３５　 ０．８３±０．１８ａ ０．７４±０．１８ａｂ　 ０．４８±０．１１ａ ０．４２±０．０８ｂ
第４２天　Ｄａｙ　４２　 ０．８３±０．１９Ａａ　 ０．７２±０．１５Ａａ　 ０．４４±０．１０ＡＢｂ　 ０．３３±０．０７Ｂｂ
第４９天　Ｄａｙ　４９　 ０．８２±０．２０Ａａ　 ０．７１±０．１４Ａａ　 ０．４５±０．１０ＡＢｂ　 ０．２９±０．０９Ｂｃ
第５６天　Ｄａｙ　５６　 ０．８６±０．２１Ａａ　 ０．７０±０．１２ＡＢａ　 ０．４２±０．０９７ＢＣｂ　 ０．２８±０．０６Ｃｃ
第６３天　Ｄａｙ　６３　 ０．８３±０．１９Ａａ　 ０．６８±０．１３ＡＢａ　 ０．４０±０．０８ＢＣｂ　 ０．２５±０．０６Ｂｃ
表７　ＡＭＡ２ｍＲＮＡ在大鼠睾丸组织相对表达量
Ｔａｂｌｅ　７　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＭＡ２ｍＲＮＡ　ｏｎ　ｒａｔｓ　ｔｅｓｔｉｓ
时间
Ｔｉｍｅ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
试验Ⅰ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅠ
试验Ⅱ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅡ
试验Ⅲ组
Ｔｅｓｔ　ｇｒｏｕｐⅢ
第７天　Ｄａｙ　７　 ０．３６±０．０９　 ０．３５±０．０７　 ０．３５±０．０８　 ０．３４±０．０６
第１４天　Ｄａｙ　１４　 ０．３６±０．０８　 ０．３３±０．０６　 ０．３２±０．０７　 ０．３１±０．０６
第２１天　Ｄａｙ　２１　 ０．３７±０．０９　 ０．３２±０．０７　 ０．２９±０．０５　 ０．２９±０．０６
第２８天　Ｄａｙ　２８　 ０．３６±０．０８　 ０．３１±０．０７　 ０．２７±０．０６　 ０．２６±０．０５
第３５天　Ｄａｙ　３５　 ０．３６±０．０８　 ０．３１±０．０６　 ０．２５±０．０５　 ０．２４±０．０６
第４２天　Ｄａｙ　４２　 ０．３５±０．０６　 ０．３０±０．０７　 ０．２５±０．０４　 ０．２４±０．０４
第４９天　Ｄａｙ　４９　 ０．３７±０．０９ａ ０．２９±０．０７ａｂ　 ０．２５±０．０４ａｂ　 ０．２３±０．０６ｂ
第５６天　Ｄａｙ　５６　 ０．３６±０．０８ａ ０．２９±０．０６ａｂ　 ０．２５±０．０４ａｂ　 ０．２０±０．０６ｂ
第６３天　Ｄａｙ　６３　 ０．３７±０．０７ａ ０．２９±０．０７ａｂ　 ０．２６±０．０４ａｂ　 ０．２０±０．０３ｂ
·０１· 西　北　农　业　学　报 ２４卷
３　讨 论
３．１　ＳＷ对大鼠睾丸组织ＡＭＡ活性的影响
ＳＷ是小花棘豆的主要毒性成分，其半椅状
结构与甘露糖类似，可强烈的、特异性地与ＡＭＡ
结合，从而使机体甘露糖代谢发生异常，导致甘露
糖大量蓄积于细胞内而造成细胞空泡变性，最终
导致细胞损伤［８］。丁伯良等［９］研究认为，甘肃棘
豆（主要毒性成分为ＳＷ）中毒山羊睾丸、附睾等
组织细胞的空泡变性与 ＡＭＡ活性下降有关，本
研究发现，ＡＭＡ 在大鼠睾丸精曲小管、精直小
管、间质细胞等均有分布，小花棘豆中毒大鼠睾丸
组织ＡＭＡ活性显著下降，而且与时间－剂量呈
正相关，表明小花棘豆毒性成分ＳＷ 可通过影响
ＡＭＡ导致动物中毒。
３．２　ＳＷ对大鼠睾丸组织ＡＭＡ活性的影响机制
ＡＭＡ在机体糖蛋白合成和代谢方面具有重
要作用，可在 Ｎ－糖基化过程中对甘露糖进行加
工。该过程与蛋白的折叠、运输、成熟、构象维持、
半衰期及生物活性密切相关。ＡＭＡ既是Ｎ－聚糖
成熟的必要酶，也参与 Ｎ－聚糖的降解［１０］。荣
杰［５］、宋岩岩［１１］研究发现苦马豆素可显著影响中
毒大鼠 ＡＭＡ 在脑组织中的相对表达，张建军
等［１２］研究发现小花棘豆中毒可显著影响小鼠肝
脏组织内ＡＭＡ的相对表达，中、高剂量攻毒组可
显著降低肝脏组织内的ＡＭＡ基因相对表达。本
试验研究发现，小花棘豆毒性成分苦马豆素可显
著影响大鼠睾丸组织中高尔基体α－甘露糖苷酶
Ⅱ和溶酶体α－甘露糖苷酶在ｍＲＮＡ水平的表达，
而且其对高尔基体α－甘露糖苷酶Ⅱ的影响更为
显著，该结果与荣杰［５］、宋岩岩［１１］、张建军等［１２］的
研究结果一致。另外免疫组化试验发现，小花棘
豆中毒大鼠睾丸中ＡＭＡ蛋白表达均有一定程度
地下降，而且各试验组间差异显著，高剂量小花棘
豆攻毒可导致大鼠睾丸ＡＭＡ蛋白表达受到显著
抑制。α－甘露糖苷酶按其在亚细胞器的分布可分
为高尔基体α－甘露糖苷酶Ⅱ、溶酶体α－甘露糖苷
酶和细胞质α－甘露糖苷酶，动物小花棘豆中毒时
主要抑制哪种α－甘露糖苷酶尚不明确，对其转
录、翻译、加工修饰是否产生影响还不清楚。本研
究表明，小花棘豆毒性成分可从ｍＲＮＡ水平和蛋
白表达水平影响 ＡＭＡ的表达，从而为揭示小花
棘豆中毒的作用机理奠定基础。
ＡＭＡ活性受到抑制可导致细胞内糖蛋白的
Ｎ－糖基化合成、加工、转运等过程发生变化，临床
上表现为生殖功能、内分泌和免疫功能紊乱［１３］。
本研究表明，中、高剂量小花棘豆攻毒可对大鼠睾
丸ＡＭＡ基因序列造成显著影响，其中高剂量小
花棘豆攻毒大鼠睾丸组织高尔基体α－甘露糖苷
酶Ⅱ与公布的基因序列重合率只有９０％。张建
军等［１２］研究发现，高剂量小花棘豆中毒组小鼠肝
脏ＡＭＡ基因与正常对照的重合率较低，这与本
研究结果一致，其具体机理有待进一步研究。
４　结 论
小花棘豆中毒可导致大鼠睾丸ＡＭＡ活性与
表达水平显著下降，而且下降趋势与小花棘豆摄
入量呈极显著正相关。小花棘豆中毒对高尔基体
α－甘露糖苷酶Ⅱ的影响较为显著，可通过 ｍＲＮＡ
水平和蛋白表达水平影响高尔基体α－甘露糖苷
酶Ⅱ在机体中的作用。
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·１１·４期 贾琦珍等：小花棘豆中毒对大鼠睾丸α－甘露糖苷酶的影响
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檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼檼
２３２ ．
“的、地、得”的用法
　　 “的”常用在介宾词组，表达一种描述后的结果，通常用在名词、形容词后。例如，我们的祖国，强大
的祖国，漂亮的姑娘……
“地”常用在动宾词组，也是一种描述的后果，通常用在名词、动词、形容词后。例如，部队在快速地
推进、同志们紧张地开始工作……
“得”常表示一种后果，多出现在动补词组，表示一种状态，一种结果，通常用在动词后，作为动补状
语出现。例如，高兴得跳起来，打得你一佛出世二佛升天……
“的”后面跟的都是名词，如“他的妈妈，可爱的花儿，谁的橡皮，清清的河水……”
“地”后面跟的都是表示动作的词，如“用力地踢，仔细地看，开心地笑笑……”
“得”前面跟的多数是动词，后面跟的都是形容词，表示怎么怎么样的，如“扫得真干净，笑得多甜啊
……”
补充两点：１、如果“ｄｅ”的后面是“很、真、太”等这些词，十有八九用“得”。２、有一种情况，如“他高兴
得一蹦三尺高”这句话里，后面的“一蹦三尺高”虽然是表示动作的，但是它是来形容“高兴”的程度的，所
以也应该用“得”。
·２１· 西　北　农　业　学　报 ２４卷