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筛选大叶蛇葡萄体外抗肿瘤活性物质



全 文 :筛选大叶蛇葡萄体外抗肿瘤活性物质
桂 春, 黄 静, 程佩佩, 方 玉, 夏 叶, 张秀桥*
(湖北中医药大学药学院,湖北 武汉 430000)
收稿日期:2014-08-18
基金项目:国家自然科学基金项目 (31170335) ;武汉市重点科技攻关计划项目 (201160823265)
作者简介:桂 春 (1989—) ,女,硕士,从事中药资源、品质及开发研究。Tel:15927207749,E-mail:gc19890703@ 163. com
* 通信作者:张秀桥 (1965—) ,女,博士,教授,博士生导师,从事中药资源、品质及开发研究。Tel:13871392318,E-mail:
qiaoxzh2000@ 163. com
摘要:目的 研究大叶蛇葡萄提取物对 HeLa细胞增殖的影响,筛选有效抗肿瘤活性物质。方法 采用 MTT法检测不
同质量浓度的大叶蛇葡萄石油醚、乙酸乙酯及水层萃取物和蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷、槲皮素及槲皮苷分别作用于
HeLa细胞 24、48、72 h后对细胞增殖的抑制作用。流式细胞仪检测蛇葡萄素对细胞周期的影响。结果 乙酸乙酯萃
取物、蛇葡萄素和杨梅素均有不同程度抑制 HeLa细胞增殖的作用,且在一定剂量范围内,具有时效或量效关系;碘
化丙啶单染法显示蛇葡萄素作用 HeLa细胞 12 h,G0 /G1 期细胞比率降低,S 期细胞比率增加。结论 乙酸乙酯提取
物、蛇葡萄素和杨梅素对 HeLa 细胞增殖有明显抑制作用,且蛇葡萄素可能通过阻滞 HeLa 细胞于 S 期而诱导细胞
凋亡。
关键词:大叶蛇葡萄;蛇葡萄素;杨梅素;抗肿瘤;HeLa细胞;细胞增殖;细胞周期
中图分类号:R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)07-1411-06
doi:10. 3969 / j. issn. 1001-1528. 2015. 07. 005
Screen of anti-tumor active substances in vitro from Ampelopsis megalophylla
GUI Chun, HUANG Jing, CHENG Pei-pei, FANG Yu, XIA Ye, ZHANG Xiu-qiao*
(School of Pharmaceutical Sciences,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,PR China)
ABSTRACT:AIM To investigate the inhibitory effect of extracts from Ampelopsis megalophylla on the prolifera-
tion of HeLa cells and to screen the anti-tumor activity in vitro. METHODS HeLa cells were treated with ether,
EtOAc and aqueous extracts of A. megalophylla as well as five compounds,ampelopsin,myricetin,myricetrin,
quercetin and quercetrin,with various concentrations,respectively. MTT method was used to evaluate the inhibito-
ry efficiency in 24 h,48 h and 72 h,respectively. Flow cytometry PI was used to measure their changes of cell cy-
cle under the condition of ampelopsin. RESULTS Experimental data showed EtOAc extract,ampelopsin and
myricetin all inhibited the cell proliferation in a dose-effect or time-effect relationship within a certain concentration
range. Propidium iodide (PI)staining method indicated that there were less cells at G0 /G1stage and more cells ar-
rested at S stage when incubated with ampelopsin. CONCLUSION EtOAc extract of A. megalophylla,ampelop-
sin and myricetin can inhibit the human cervical cancer cell line HeLa in vitro by inhibiting cell proliferation. May-
be ampelopsin induces cell apoptosis by arresting cells at S phase.
KEY WORDS:Ampelopsis megalophylla;ampelopsin;myricetin;anti-tumor;HeLa cells;cell proliferation;cell
cycle
大叶蛇葡萄 Ampelopsis megalophylla Diels et.
Gilg 是葡萄科蛇葡萄属植物,湖北西部地区民间常
用中草药。其药用部位是叶及嫩茎,因其嫩枝叶置
沸水中稍烫后,捞起后通风处吹干,表面会出现星
点白霜,故又称为霉茶[1]。该药曾收载于 《湖北
中草药志》[2],性平,味酸、涩,具有活血散瘀、
止血、清热解毒等功效。现代药理学研究表明其具
有降血脂、降血糖、降血压、抗病毒等[3-7]作用,
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但未见其对抗肿瘤作用的研究报道。
本实验采用 MTT[8-10]法观察大叶蛇葡萄 3 种不
同提取物对 HeLa细胞增殖抑制情况,分析不同提
取物对肿瘤细胞的影响。实验结果提示乙酸乙酯萃
取物对 HeLa细胞的增殖有较好的抑制作用,进而
将从乙酸乙酯萃取物分离得到的蛇葡萄素等 5 种化
合物分别采用 MTT法观察其对 HeLa细胞的抑制作
用,并将抑制作用最强的蛇葡萄素进行细胞周期分
布的研究,初步探讨其作用机制。
1 材料
1. 1 材料
1. 1. 1 药品和细胞株 大叶蛇葡萄采于湖北省恩
施州来凤县,经湖北中医药大学生药学教研室张秀
桥教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡萄 Am-
pelopsis megalophylla Diels et. Gilg,取其叶及嫩茎
为实验材料。实验所用宫颈癌细胞 HeLa 购于中国
典型培养物保藏中心,在武汉大学药学院细胞室传
代备用。
1. 1. 2 试剂 四甲基偶氮唑盐粉末 (MTT,美国
Amresco 公司) ,DMEM 培养基、磷酸盐缓冲液
(PBS)、青霉素-链霉素 (双抗)、胰蛋白酶 (美国
Thermo公司) ,小牛血清 (NBS,杭州四季青生物
工程材料有限公司) ,二甲基亚砜 (DMSO)、碘化
丙啶 (propidium iodide,PI)粉末 (美国 Sigma
公司)。
1. 1. 3 大叶蛇葡萄提取物的分离与溶液制备 称
取大叶蛇葡萄药材 8. 5 kg,粉碎,过 10 目筛,分
别以 10 倍量 95%和 75%乙醇各渗漉提取一次 (浸
泡 24 h,体积流量 10 mL /min) ,合并提取液,减
压回收乙醇并浓缩至小体积得乙醇提取物;加适量
水分散,依次用石油醚、乙酸乙酯和水进行萃取,
分别合并 3 种不同萃取液,最后依次浓缩干燥得到
石油醚、乙酸乙酯及水层提取物。取乙酸乙酯提取
物 200 g采用硅胶柱、Sephadex LH-20 柱色谱等技
术分离纯化,分别得到蛇葡萄素、杨梅素、杨梅
苷、槲皮素和槲皮苷。称取适量的提取物,用 DM-
SO配成适当浓度的供试液,4 ℃冰箱保存,实验
时用培养基稀释成所需药物浓度,提取物质量浓度
分别为 12. 5、25、50、100、200 μg /mL,单体的
摩尔浓度为 20、40、80、160、320 μmol /L。
1. 1. 4 实验仪器 Galaxy s + CO2 培养箱 (英国
RS Biotech公司) ;ClassⅡtype A2 超净工作台 (北
京东联哈尔仪器制造有限公司) ;IX51Olympus 倒
置显微镜 (日本 Olympus 公司) ;HEV-50 自动高
压灭菌器 (日本 Hirayama 公司) ;iMark 酶标仪
(美国 Bio-RAD 公司) ;TDZ4-WS 台式自动平衡离
心机 (长沙平凡仪器仪表有限公司) ;流式细胞仪
(美国 BD公司) ;BCD-188C 冰箱 (合肥美菱股份
有限公司) ;WG-136 电热鼓风干燥箱 (天津市泰
斯特仪器有限公司)。
2 实验部分
2. 1 细胞培养 HeLa 细胞采用 DMEM 培养基,
在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养,细胞呈贴壁生
长,用 0. 25%的胰酶消化传代,用于实验的细胞
均处于对数生长期。
2. 2 MTT法测定 HeLa 细胞的生长抑制率 选择
处于对数生长期的细胞,0. 25%胰蛋白酶消化后,
调整细胞计数为 5 × 103 个 /mL 接种于 96 孔板,每
孔 100 μL,然后将培养板置 37 ℃、5% CO2 培养
箱中 24 h后,吸取旧培养液,每孔加入 100 μL 的
药液,每个浓度设置 3 个复孔,并设置空白对照组
(含细胞、培养基及溶剂)和调零组 (含培养基和
溶剂)。分别在培养箱温孵 24、48、72 h 后,每孔
加入 20 μL MTT溶液,继续放入 37 ℃、5%CO2 培
养箱培养。4 h后吸去上清液,加入 100 μL的 DM-
SO,放置于摇床上低速振荡至每孔中结晶物完全
溶解。在酶标仪 490 nm 波长处测量各孔吸光度
(OD)。实验重复 3 遍。
细胞活性抑制率 = [1 - (OD试验组 - OD调零组)/
(OD对照组 - OD调零组) ]× 100%
2. 3 PI单染法检测 HeLa 细胞周期 选择对数生
长期的细胞,0. 25%胰蛋白酶消化后,调整细胞计
数为 2 × 105 个 /mL 接种于 6 孔板,每孔 2 mL。培
养 24 h 后,分别加入 0、30、40、50、60、70
μmol /L的蛇葡萄素药液,12 h 后收集细胞。离心
后用预冷的 PBS 洗涤 2 次后,加入 75%乙醇放置
- 20 ℃环境固定过夜,离心后 PBS 洗涤 2 次,加
入 30 μL 1 mg /mL RnaseA,37 ℃作用 30 min,加
入 50 μg /mL的 PI溶液,4 ℃避光染色 30 min用流
式细胞仪检测,细胞周期拟和软件分析结果[11-13]。
2. 4 统计学分析 采用 SPSS 17. 0 统计软件进行
分析,结果用 x ± s 表示,与对照组比较采用 t 检
验,P < 0. 05 表示差异有统计学意义,同时计算半
数抑制率 (IC50)值。
3 结果及分析
3. 1 提取物对 HeLa 细胞的生长抑制作用 一定
浓度范围内,3 种提取物分别作用于 HeLa细胞 24、
48 和 72 h。结果显示当药物作用时间为 48 h 时,
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在 25 ~ 200 μg /mL 范围内,石油醚提取物对 HeLa
细胞的抑制作用随质量浓度的升高而增强,表现剂
量依赖性;当药物作用时间为 72 h 时,在 12. 5 ~
200 μg /mL范围内,石油醚提取物对 HeLa 细胞的
抑制作用随质量浓度的升高而增强,表现剂量依赖
性。如图 1A所示。当药物作用时间为 48 h时,在
12. 5 ~ 200 μg /mL范围内,乙酸乙酯提取物对 HeLa
细胞的抑制作用随质量浓度的升高而增强,表现剂
量依赖性;当药物质量浓度为 50 μg /mL 时,乙酸
乙酯提取物对 HeLa 细胞的作用随时间的延长而减
弱,表现时间依赖性,即当药物作用时间为 24 h,
抑制作用最强。结果见图 1B。HeLa 细胞对水层提
取物不敏感,结果见图 1C。
注:与对照组 (含细胞、培养基及溶剂)比较,* P < 0. 05,
**P < 0. 01 (下同)
图 1 石油醚、乙酸乙酯、水层提取物对 HeLa细胞抑
制作用
Fig. 1 Inhibitory effect of ether,EtOAc,aqueous ex-
tract on cell proliferation in HeLa
3. 2 单体化合物对 HeLa 细胞的生长抑制作用
一定浓度范围内,5 种化合物分别作用于 HeLa 细
胞 24、48 和 72 h后,对细胞增殖的抑制作用结果
如图 2 ~ 6 所示。
图 2 蛇葡萄素对 HeLa细胞抑制作用
Fig. 2 Inhibitory effect of ampelopsin on cell proliferation
in HeLa
图 3 杨梅素对 HeLa细胞抑制作用
Fig. 3 Inhibitory effect of myricetin on cell proliferation in
HeLa
图 4 杨梅苷对 HeLa细胞抑制作用
Fig. 4 Inhibitory effect of myricetrin on cell proliferation
in HeLa
当药物作用 48 h,在 20 ~ 320 μmol /L范围内,
蛇葡萄素对细胞的抑制作用随浓度的升高而增强,
表现剂量依赖性;当药物作用 72 h,在 40 ~
320 μmol /L范围内,蛇葡萄素对细胞的抑制作用随
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图 5 槲皮素对 HeLa细胞抑制作用
Fig. 5 Inhibitory effect of quercetin on cell pro-
liferation in HeLa
图 6 槲皮苷对 HeLa细胞抑制作用
Fig. 6 Inhibitory effect of quercetrin on cell
proliferation in HeLa
剂量的升高而增强,表现剂量依赖性;当药物浓度
分别为 80、160 和 320 μmol /L时,蛇葡萄素对 He-
La细胞增殖的抑制作用均随时间的延长而增强,
分别表现时间依赖性;即当药物作用时间为 72 h
时,蛇葡萄素对 HeLa 细胞增殖的抑制作用最强,
如图 2 所示。经计算得蛇葡萄素作用 HeLa 细胞
24、48 和 72 h 的 IC50分别为 105. 30、90. 55 和
65. 58 μmol /L。
当药物作用 48 h,在 40 ~ 320 μmol /L范围内,
杨梅素对 HeLa 细胞的抑制作用随浓度的升高而增
强,表现剂量依赖性;当药物浓度分别为 80、160
和 320 μmol /L时,杨梅素对 HeLa细胞增殖的抑制
作用均随时间的延长而增强,表现时间依赖性;即
当药物作用时间为 72 h时,杨梅素对 HeLa细胞增
殖的抑制作用最强,如图 3 所示。计算得杨梅素作
用 HeLa细胞 24、48 和 72 h的 IC50分别为 108. 15、
93. 06 和 85. 44 μmol /L。
由图 4 可知,当药物作用 48 或 72 h,在 20 ~
160 μmol /L范围内,杨梅苷对 HeLa 细胞几乎无抑
制作用,当药物剂量逐渐升高至 320 μmol /L 过程
呈现一定的抑制作用。
当药物作用 24 或 48 h,在 40 ~ 320 μmol /L范
围内,槲皮素对细胞的抑制作用随浓度的增高而增
强,表现剂量依赖性;当药物作用 72 h,在 20 ~
320 μmol /L范围内,槲皮素对细胞的抑制作用随
浓度量的增高而增强,表现时间依赖性;如图 5 所
示。经计算得槲皮素作用 HeLa 细胞 48 和 72 h 的
IC50分别为 229. 38 和 158. 9 μmol /L。
由图 6 可知,HeLa细胞对槲皮苷不敏感。
3. 3 蛇葡萄素对 HeLa 细胞周期分布的影响 流
式细胞仪检测不同浓度的蛇葡萄素作用 HeLa 细胞
的 DNA水平揭示了 HeLa细胞周期分布的变化。如
图 7 所示,与空白对照组对照可知,G0 /G1 期,给
药组的 DNA水平随着药物剂量的升高逐渐降低;S
期,给药组的 DNA 水平呈现升高趋势;G2 /M 期,
在 30 ~ 60 μmol /L 范围内,给药组 DNA 水平随着
药物剂量的升高逐渐增大,当浓度为 70 μmol /L,
DNA水平减小。由此可知,高浓度时细胞凋亡较
多,蛇葡萄素可能造成 HeLa 细胞 S 期阻滞,从而
影响细胞周期正常进行。
4 讨论
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一[14],在
全球女性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌[15],它的发
病和死亡的 85%以上是在发展中国家[16]。作为发
展中国家,2010 年我国宫颈癌病例 27 000 ~
130 000例,若没有进行任何干预措施,到 2050 年
可能增加到 42 000 ~ 187 000 例[17]。由此可见,对
宫颈癌的有效治疗对女性健康的必要性和重要性。
随着现代社会的肿瘤患者的增多,西药治疗疗效相
对明显,但伴随毒副作用,且久用会产生耐药性,
而人们对身体的重视程度却在不断提高。我国中药
资源丰富,种类繁多,在治疗肿瘤方面积累了宝贵
的经验,因此从中筛选出高效低毒的抗宫颈癌药物
具有广阔前景。
本实验针对此问题,选取宫劲癌 HeLa 细胞对
大叶蛇葡萄的抗肿瘤活性进行了系列研究。根据图
1 比较可知,水层提取物对 HeLa 细胞几乎无抑制
作用,其他两种提取物在一定剂量、时间范围内都
表现相对的抑制作用。
当药物作用时间为 24 h 时,在 12. 5 ~ 200
μg /mL范围内,石油醚提取物对 HeLa 细胞无抑制
作用,乙酸乙酯提取物对 HeLa 细胞抑制作用呈加
强趋势,且抑制作用较强;当药物作用时间为 48
或 72 h时,石油醚提取物对 HeLa细胞抑制作用随
剂量的升高而加强,但只在最高剂量时抑制率达到
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图 7 蛇葡萄素对 HeLa细胞周期分布的影响
Fig. 7 Effect of ampelopsin on cell cycle distribution in HeLa
半数抑制率,而乙酸乙酯提取物对 HeLa 细胞抑制
作用随剂量的升高而加强,且抑制作用最高
达 90. 65%。
当药物质量浓度为 25 μg /mL 时,乙酸乙酯提
取物对 HeLa细胞作用 24 h时的抑制作用明显强于
石油醚提取物,且抑制率为 68. 20%;当药物质量
浓度为 50 μg /mL 时,乙酸乙酯提取物对 HeLa 细
胞作用 24 h的抑制作用亦明显高于石油醚提取物,
抑制率为 73. 64%;由此可见,3 种提取物中,乙
酸乙酯提取物对 HeLa 细胞的抑制作用最强,且通
过计算最强 IC50为 28. 55 μg /mL。
根据图 7 可知,HeLa 细胞对槲皮苷不敏感,
杨梅苷与槲皮素在高浓度时表现一定的抑制作用,
相比较可知蛇葡萄素与杨梅素对 HeLa 细胞的抑制
作用较强,且在一定的剂量、时间范围内呈现时
间-剂量效应关系。
当药物作用时间为 72 h,蛇葡萄素和杨梅素均
得到最低 IC50值,分别为 65. 58 和 85. 44 μmol /L。
当药物浓度为 40 μmol /L 时,蛇葡萄素对 HeLa 细
胞的抑制率为 20. 96%,而杨梅素对 HeLa 细胞生
长表现促进作用;当药物浓度为 80 μmol /L时,蛇
葡萄素和杨梅素对 HeLa 细胞的抑制率分别为
84. 53 和 61. 15%,前者抑制作用强于后者;当药
物浓度继续升高,此两种药物对 HeLa 细胞生长的
抑制作用变化不明显。由此可见,5 种化合物中,
蛇葡萄素对 HeLa细胞的抑制作用最强,且通过计
算最强的 IC50为 65. 58 μmol /L。
本研究中首先对大叶蛇葡萄的 3 种提取物进行
抗宫颈癌的活性筛选,发现乙酸乙酯提取物具有较
强的抑制作用,且在一定剂量、时间范围内,有良
好的时间-剂量效应关系。进一步对从乙酸乙酯提
取物分离得到的五种单体同样进行了抗宫颈癌活性
筛选,发现蛇葡萄素与杨梅素对 HeLa 细胞增殖有
较强的抑制作用,最小 IC50分别为 65. 58 和 85. 44
μmol /L,因蛇葡萄素作为大叶蛇葡萄含有量最高
的主要活性成分,且对 HeLa 细胞的 IC50小于杨梅
素,故选取蛇葡萄素作为代表物质进行下一步的细
胞周期实验表明,结果表明蛇葡萄素可能通过阻滞
HeLa细胞于 S 期而诱导其凋亡,该研究为后期大
叶蛇葡萄抗肿瘤作用机制的研究奠定了基础,同时
也为研制抗宫颈癌现代新药提供了新方向。
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筛选益母草注射液缩宫成分
李 燕, 谢晓芳* , 余泉毅, 袁 岸, 陈 蓉, 彭 成*
(成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地,四川 成都
611137)
收稿日期:2014-08-15
基金项目:国家自然基金项目 (81303209) ;四川省应用基础研究项目 (2012JYZ005) ;成都中医药大学科技发展基金重点项目
(2013) ;大学生科研实践创新课题 (ky2014-020)
作者简介:李 燕 (1990—) ,女,博生生,研究方向为中药物质基础以及药动学。Tel:15928979634,E-mail:993603736@ qq. com
* 通信作者:谢晓芳,女,讲师,医学博士,研究方向为中药药理。Tel:13980522864,E-mail:55091620@ qq. com
彭 成,男,教授,博士生导师,研究方向为疾病动物模型与中药复方。Tel: (028)61800018,E-mail:pengchengcao@
126. com
摘要:目的 采用大鼠离体子宫筛选益母草注射液 (益母草)缩宫活性成分。方法 从益母草注射液中分离到的 3-
羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸及总氨基酸作用于大鼠成年雌性未孕和流产的离体子宫并绘制子宫收缩曲线,计算给药前
后子宫收缩幅度、频率和活动力的变化。结果 益母草注射液、3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸和总氨基酸可明显升高
大鼠离体子宫收缩活动力及收缩幅度的最大值、最小值、平均值 (P < 0. 05 或 P < 0. 01)。结论 益母草注射液中存
在兴奋子宫的 3 个成分中以 N-异丁基缬氨酸活性更好。
关键词:益母草注射液;缩宫;离体子宫;子宫活动;活性成分
中图分类号:R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)07-1416-07
doi:10. 3969 / j. issn. 1001-1528. 2015. 07. 006
Screen of oxytocin ingredients from Yimucao Injection
LI Yan, XIE Xiao-fang* , YU Quan-yi, YUAN An, CHEN Rong, PENG Cheng*
6141
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
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