全 文 ：用均匀设计法优化蛇葡萄素的提取与纯化工艺
何志峰 ,曾　飒 ,侯娟娟 ,刘德育*
(中山大学药学院 ,广东广州 510089)
　　摘要　目的:优选蛇葡萄素的提取工艺。 方法:采用均匀设计法安排实验 , 以蛇葡萄素得率及纯度为评价指
标 , 考察乙醇浓度 ,回流次数及时间对蛇葡萄素提取率的影响 , 同时考察石油醚萃取次数 , 活性炭用量及重结晶次
数对蛇葡萄素纯化程度的影响 ,优选出合理的提取工艺。结果:提取优化条件:乙醇浓度 90%, 回流 4次 , 每次 1. 5
h;纯化优化条件:石油醚萃取 3次 ,每 100 g原药材加活性炭 1 g,重结晶 3次。结论:本工艺稳定可行 , 提取率高 ,
可作为提取蛇葡萄素生产工艺的参考。
关键词　均匀设计;蛇葡萄素;提取工艺
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)07-0718-03
基金项目:广东省科技计划项目资助课题(项目编号:2003C10403)
　　*通讯作者:刘德育 ,教授 , E-m ail:liudeyu@m ai l. sysu. edu. cn, Tel:020-87331476。
　　蛇葡萄素是从葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄
Ampelopsis cantoniensis(又名无莿根)或显齿蛇葡萄
(又名藤茶 )中提取出来的具有抗氧化 、抗肿瘤 、抗
病毒等多种药理活性的黄酮类化合物 。蛇葡萄素的
提取方法〔1〕主要有醇提与水提 ,水提法粗产物杂质
较多 ,纯化较困难 ,且提取率偏低。如采用水提取乙
醇沉淀色谱柱分离的方法所得提取率仅约 2%〔2〕 ,
且步骤繁杂 。我们曾采用甲醇提取 、氯仿萃取及活
性炭吸附 ,再用水重结晶方法 ,使提取率提高到约
10.3%〔3〕。本文即在此基础上 ,采用均匀设计法对
蛇葡萄素的提取及纯化工艺进一步优化 ,并用乙醇
代替甲醇 ,石油醚代替氯仿 ,使实验更安全 ,获得了
简单 、高效且经济的提取方法 ,所得单体药用纯度
高 ,为蛇葡萄素生产工艺的参数选择提供实验依据 。
1 　仪器及实验材料
U-2000型分光光度计 (日本 H itach i);高效液相
色谱仪 (日本岛津 );蛇葡萄素对照品 (本研究室制
备 ,纯度 98%以上 )。 60型薄层层析硅胶 GF254(青
岛海洋化工集团 );石油醚 (60℃-90℃)及三氯化铁
(广州化学试剂厂 );甲醇(汕头兴华化学厂 )。所有
试剂均为分析纯 。
2 　实验方法
2.1 　蛇葡萄素含量的测定方法 〔4〕　精密称取对照
品 20.0 mg, 用甲醇溶解并稀释至 100 m l, 分别取
0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50 m l,用甲醇稀释
至 10 m l,用分光光度计于 291 nm测定吸光度 ,得回
归方程 。
分别取原料药材 50 g,按照均匀设计安排 (表
1)进行提取实验 。将得到的 9份提取物样品分别
精确称取 1 g,用甲醇溶解并稀释至 100 m l,取 2.00
m l,用甲醇稀释至 100 m l。再取 2.00 m l,用甲醇稀
释至 10 m l,用分光光度计于 291 nm测定吸光度 ,测
定结果代入回归方程 ,计算蛇葡萄素含量。
分别取上述粗提混合物各 5 g,按照均匀设计安
排(表 2)进行纯化实验。分别精密称取纯化样品
20mg,用甲醇溶解并稀释至 100 m l;再取 0.50 m l,
用甲醇稀释至 10m l,按上文的标准曲线法进行含量
测定 。
2.2　提取实验与纯化工艺
2.2.1 　根据文献 〔5、6〕及预实验结果 ,确定提取工
艺考察的因素及范围如下:乙醇浓度 (70% ～
90%)、回流时间 (1.5 ～ 2 h),回流次数 (2 ～ 4次 ),
将上述各因素分成 3个水平 ,选择 U9(96)表 ,将对
应的各因素的水平数填入表中。各取原材药料 50
g,按 U9(96)表安排的条件进行回流提取实验。每
试验号分别做 3次 ,其含量测定结果取平均值 ,填入
表 1中。
2.2.2 　根据文献〔7〕及预实验结果 ,确定纯化工艺
考察因素及范围如下:石油醚提取次数 (3 ～ 5次 )、
活性炭用量(0.1 ～ 0.3 g),重结晶次数 (3 ～ 5次 ),
将上述各因素分成 3个水平。采用 U9(96)表 ,将对
应的各因素的水平数填入表中。各取提取工艺所得
的粗品混合物 5 g,按 U9(96)表安排的条件进行实
验。每试验号分别做 3次 ,其含量测定结果取平均
值 ,填入表 2中 。
2.3　验证实验　按照提取和纯化的优化条件 ,采
用同批原料进行验证实验。将验证实验产物做正相
薄层色谱分析及做 HPLC分析。
2.4　验证实验产物的纯度检测
2.4.1 　薄层层析法:精密称取对照品 20.0 mg,用
甲醇溶解并称释至 100m l,作对照液;将 7份纯化样
品分别精密称取 20mg,甲醇溶解并稀释至 100 m l,
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作为样品液 。将对照液及样品液点于硅胶 H板 ,展
开剂为醋酸乙酯-氯仿-甲酸 /10∶6∶1 ,挥干溶剂后用
1%FeC l3乙醇溶液显色。
2.4.2　高效液相色谱法:色谱条件:sh im-pack VP-
ODS柱(150×4.6 mm);流动相:甲醇∶水 =24∶76
(v /v), H3 PO 4调节 pH至 3;流速 (1 m l /m in);检测
波长 (291 nm );进样体积 (10 μl);色谱工作站
(C lass-Vp, 6.12 SP1)。
精密称取标准品适量 ,用甲醇溶解 ,配制成 0.5
mg /m l的对照品溶液 。精密称取样品适量 ,用甲醇
溶解 ,配制成 0.5mg /m l的样品溶液。
3 　实验结果
3.1　提取与纯化工艺结果　将表 1的数据用 SPSS
10.0 forw indow统计软件进行多元线形回归 ,采用
Enter法拟合得回归方程:Y =-1.575 +0.142A 1-
1.153B1 +0.562C1(R=0.915, F =8.54, P<0.05)。
分析上述方程式 , 在考察范围内 , 用较低浓度
(70%)的乙醇提取 ,提取物的纯度较高 ,但提取率
却较低;而用较高浓度 (90%)的乙醇提取 ,提取物
的纯度较低 ,但提取率却较高 。综合考虑提取率及
纯度 ,选择的提取条件是:乙醇浓度 90%(500 m l /
100 g药材)、回流时间 1.5 h /次 、回流次数 4次 。预
测值 Y =23.46%,此时的提取率虽然高 ,但是纯度
较低 ,只是粗提取物 ,需经过纯化才能得到纯度较高
的蛇葡萄素 。
　表 1 　蛇葡萄素提取优化条件及实验结果
号数 乙醇浓度
A 1
时间
B1
次数
C1
提取量(g) ABS 纯度% 获取率%
1 70 2 4 11. 3 0. 922 65. 70 14. 84
2 70 2.5 3 10. 8 0. 907 64. 45 13. 92
3 70 1.5 2 14. 2 0. 819 57. 13 16. 22
4 80 2.5 2 11. 0 0. 900 63. 87 11. 06
5 80 1.5 4 16. 8 0. 784 54. 21 18. 22
6 80 2 3 14. 7 0. 893 63. 29 18. 60
7 90 1.5 3 20. 3 0. 741 50. 64 20. 56
8 90 2 2 15. 0 0. 850 59. 71 17. 92
9 90 2.5 4 23. 0 0. 672 44. 89 20. 64
　表 2 　蛇葡葡素纯化优化条件及实验结果
号数 石油醚提取次数 A
活性炭量
B
重结晶
C
获得量(g) 纯度% 提取量(g) 获取率%
1 3 0.2 5 0. 777 94. 3 0. 737 14. 7
2 3 0.3 4 1. 016 91. 2 0. 927 18. 5
3 3 0.1 3 1. 246 92. 1 1. 148 23. 0
4 4 0.3 3 1. 006 91. 3 0. 918 18. 4
5 4 0.1 5 0. 926 88. 5 0. 820 16. 4
6 4 0.2 4 0. 656 96. 8 0. 635 12. 7
7 5 0.1 4 0. 906 94. 0 0. 852 17. 0
8 5 0.2 3 1. 546 92. 6 1. 432 28. 6
9 5 0.3 5 1. 036 90. 6 0. 939 18. 8
　　将表 2的数据进行多元线形回归 ,采用 En ter
法拟合得回归方程:Y=1.345+0.0450A +0.217B-
0.159(R=0.662, F =1.298, P =0.372>0.10),方
程无显著性意义 。再用 BACKWARD法拟合 ,得 Y
=1.338+0.0450A-0.159C(F =2 , 268 , P =0.185 >
0.10),方程无显著性意义;Y =1.568-0.159C(F =
4.641 , P=0.068<0.10),方程有显著性意义。提示
获取量 Y与重结晶次数关系最大 ,重结晶次数越
多 ,提取量越少 。综合考虑蛇葡萄素纯度及得率 ,选
择优化条件为:石油醚提取次数 3次 、活性炭 0.25
g /5 g粗样品(相当于活性炭 1.0 g /100 g原药材 )、
重结晶次数 3次。
3.2　验证实验产物的纯度检测结果　见图 1 ～ 4。
测得蛇葡萄素的平均提取率约为 14.0%,且纯度可
达 95%以上 。
图 1　验证实验产品的正相薄层色谱分析
(硅胶 H薄层板 , 展开剂:醋酸乙酯-氯仿-甲酸 /10∶6∶1, 显示
剂:1%FeC l3-乙醇溶液 )由左至右:040707, 040710, 040715,
蛇葡萄素 , 040716,杨梅黄素 , 040720, 040721
图 2　验证实验产物的 HPLC分析结果
流动相:甲醇-水 /24∶76(磷酸调 pH =3.0), 流速 1.0 m l /
m in, 检测波长 291 nm。主峰:tR =6. 392, Area=41168112
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图 3　验证实验产物的 HPLC分析结果
流动相:甲醇-水 /24∶76(磷酸调 pH =3. 0), 流速 0. 8 m l /
m in,检测波长 375 nm。主峰 tR =8.061 m in, A rea=394783
图 4　验证实验产物的 HPLC分析结果
流动相:甲醇-水 /24∶76(磷酸调 pH =3. 0), 流速 0. 8 m l /
m in,检测波长 254 nm。主峰 tR =7.975 m in, A rea=7705680
4 　讨论
蛇葡萄素为黄酮类化合物 ,在乙醇中的溶解性
较好 ,本实验结果显示 ,提高溶媒中乙醇的含量可使
蛇葡萄素的溶出速度及溶出量增加 。提取时间增
大 ,也可提高溶出量 ,但提取时间过长 ,含量反而下
降 ,可能由于成分被氧化或对温度敏感 ,故不宜提取
时间过长。
　　蛇葡萄素的 λm ax为 291 nm ,杨梅黄素的 λmax为
254 nm和 375 nm〔8〕。在 375 nm处蛇葡萄素几乎无
吸收 ,而在 291 nm处杨梅黄互吸收较小 , HPLC结
果显示 , 在检测波长 291 nm , 提取物的 tR =6.392
m in,加入对照品使峰增高而不位移 ,证实提取物确
为蛇葡萄素 ,产物中有少量杂质 ,在检测波长 375
nm , tR =8.061,与杨梅黄素的 tR完全一致。由 A 375 /
A291 =394783 /41168112=0.96%,可知蛇葡萄素样
品中的杨梅黄素含量很低。因此可采用分光光度法
于 291 nm测量蛇葡萄素的含量 ,标准曲线的回归方
程 A =0.1325+0.05004C , r=0.9904。
本文优化操作使蛇葡萄素的提取率由原来的约
10.3%〔3〕提高到约 14.0%,且纯度可达 95.00%以
上 ,方法更简便 ,可为蛇葡萄素生产工艺的参数选择
提供实验依据 。
参 考 文 献
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(2005 - 12 -14收稿)
Optmi iz ing the Extracting Technique ofAmpe lopsin from Ampelopsis
cantoniensis P lanch by A Unifrom DesignM ethod
HE Zhi-feng, ZENG Sa, HOU Juan-juan, L IU De-yu
(Schoo l o f Pha rm aceutica l Science s, Sun Ya t-Sen Un ive rsity, Guangzhou 510080, China)
Abstrac t　Objective:To optim ize the prepa ra tion of am pe lopsin from Ampe lopsis Can toniensis P lanch. M ethods:The ex traction
and pu rifica tion pro ce ss w as studied by the unifo rm design w ith the ex trac t of am pe lopsin con tent and purity as ma rke rs. The facte rs
wh ich influence the extrac tion and the purification o f ampe lopsin contentw ere stud ied by uniform design. Resu lts:The optimum ex trac-
tion and pu rifica tion pro ce ss:the concentra tion fo r a lcoho lw as 90%, and refluxing qua rtic, 1.5 h each tim e;ex traction by pe tro leum
e the r qu intic, them oun t o f ac tive carbon was 1 g /100 g o f the medic inem a te rial, and recry sta ling th rice. Conc lusion:This ex traction
proce ss has highe r y ield o f am pe lopsin and is ava ilab le for production.
K ey words　Un iform design;Ampelopsis;Ex traction process
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