全 文 ：蛇葡萄素对免疫细胞的趋化作用
曾　飒 ,罗高琴 ,刘德育*
(中山大学药学院 ,广东广州 510080)
　　摘要　目的:观察蛇葡萄素在一定浓度下对中性粒细胞和单核细胞的趋化作用。方法:分别与趋化因子 IL-8、
MCP-1作对照 , 在琼脂糖中进行化学增活和化学趋化实验。结果:蛇葡萄素在 25.6 μg /m l、51.2 μg /m l浓度下 ,具
有显著诱导中性粒细胞和单核细胞产生趋化的作用。浓度为 25. 6μg /m l的蛇葡萄素与 150 ng /m l IL-8或 50 ng /m l
的 MCP-1的增活效应无显著差异(P>0.05)。浓度为 12.8 μg /m l的蛇葡萄素的趋化效应强于 150 ng /m l的 IL-8
或 100 ng /m l的 MCP-1(P<0.05)。蛇葡萄素与 IL-8及 MCP-1对中性粒细胞和单核细胞的趋化作用均存在协同作
用(P<0. 05)。结论:蛇葡萄素对中性粒细胞和单核细胞均有化学增活和化学趋化效应 ,且在对免疫细胞的化学增
活方面 , 蛇葡萄素与 IL-8及 MCP-1均存在协同作用。
关键词　蛇葡萄素;趋化作用;免疫细胞;IL-8;MCP-1
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)03-0260-03
基金项目:广东省自然科学基金(20010762);广东省科技计划项目(2003C104033)
　　*通讯作者:刘德育 , E-m ai l:liudy@ gzsum s. edu. cn
　　蛇葡萄素是由我国华南一带分布广泛的几种蛇
葡萄属民间药用植物提取的一种黄酮化合物 〔1〕。
我们的研究发现蛇葡萄素不但具有显著抑制癌细胞
增殖和抗肿瘤生长作用 〔2〕 ,也具有显著的抗肿瘤侵
袭和转移作用 ,其作用机制与其对癌细胞具有抗侵
袭 、粘附和趋化运动能力有关〔3〕。本实验采用琼脂
糖法 ,初步观察了蛇葡萄素及其与趋化因子同时存
在时对中性粒细胞和单核细胞的趋化作用 ,为进一
步探讨其抗肿瘤机制提供依据 。
1 　材料与方法
1.1 　药品和细胞系　蛇葡萄素由本室提供 ,纯度
95%以上 ,用含 10%小牛血清的 RPM I-1640培养基
溶解 ,过滤除菌。中性粒细胞和单核细胞分离自健
康人外周血 。 IL-8、MCP-1购于美国 S igma公司 。
1.2 　琼脂糖小滴中的化学趋化实验　按参考文
献 〔4〕方法分离中性粒细胞和单核细胞 。加热熔化
无菌蒸馏水配制的 0.8%(W-V)琼脂糖 ,置 45℃水
浴中保温。在 45℃中预热含 20%灭活小牛血清 、60
mmo l /L pH 7.4 Hepes、50 U /m l庆大霉素的 2倍浓
缩的 RPM I-1640细胞培养液 。将培养液等量加入
到 0.8%琼脂糖中 ,混匀成 0.4%琼脂糖 /RPM I-1640
溶液。在 37℃中预热中性粒细胞和单核细胞悬液 ,
并与 0.4%琼脂糖 /RPM I-1640溶液等量混匀 ,制成
含细胞为 1×106 ～ 2×106 /m l的混悬液。向置于冰
上的 96孔平底细胞培养板的孔中央滴入混悬液 ,每
孔 4 μl,使成小滴状。继续置于冰上 2 ～ 3m in,使小
滴固化 。加入含不同浓度蛇葡萄素 (12.8 μg /m l、
25.6μg /m l、51.2 μg /m l,各浓度组溶剂浓度与溶剂
组浓度相同 ,为 0.2%)和 /或趋化因子 (IL-8为 50
ng /m l、100 ng /m l、150 ng /m l,或MCP-1为 10 ng /m l、
50 ng /m l、100 ng /m l)的培养基 ,每孔 100 μl,每组 4
复孔 , 37℃5%CO2的饱和湿度培养箱中 ,中性粒细
胞培养 2 h,单核细胞培养 3 h。用倒置相差显微镜
观察各孔 ,计算迁移到小孔边缘的细胞数目 ,减去细
胞的自身运动 (阴性对照孔或溶剂对照孔细胞数 ),
即为趋化因子诱导的随机移动。
1.3　琼脂糖平板中的化学趋化实验　参考文献〔4〕
方法 ,取 1.08 g琼脂糖加入 60 m l蒸馏水中 ,煮沸
15m in使完全溶化 ,于 50℃中保留 。将 60 m l培养
液(含 12 m l小牛血清 ,适量谷氨酰胺和 NaHCO3 , 12
m l 10倍浓缩的 DMEM培养液 ,加水至 60 m l)加热
到 50℃,与上述琼脂糖溶液混合。在直径 6 cm的
培养皿中加入 6m l混合液 ,室温放置 30 m in使自然
凝固 。在平皿上打呈放射状排列 、每排 3个 、内径为
3mm的 6排孔 ,在培养箱中保温 。
在每排的中间孔中加入 10 μl细胞悬液 (3 ×
10
6
/m l中性粒细胞或 1.5×106 /m l单核细胞 ),内侧
孔中加入 10 μl含 0.5 g /m l BSA的 PBS作对照 ,外
侧孔中加入 10 μl系列浓度的药物。每个稀释度在
不同平皿中重复 4次 ,在培养箱中中性粒细胞培养
1 h,单核细胞培养 2 h,到细胞接近样品孔边缘为
止。测量细胞迁移距离 ,按下式计算迁移率:
迁移率 =最接近样品孔的细胞迁移距离 -最接近空白孔的细胞迁移距离最接近空白孔的细胞迁移距离
1.4　统计分析　实验结果有用 O rig in 6.0软件绘
图 , SAS 6.12软件包进行数据分析。实验结果采用
双因素方差分析 ,组间两两比较采用 Dunnett-t法。
2　结果
2.1　蛇葡萄素对免疫细胞的化学增活作用　表 1、
260 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牪牨
表 2及图 1为琼脂糖小滴中的化学增活实验的结
果 。蛇葡萄素各浓度组对两种免疫细胞均有化学增
活效应 ,且各组药物浓度与增活效应呈一定的量效
关系。 25.6 μg /m l的蛇葡萄素与 150 ng /m l的 IL-8
或 50 ng /m l的 MCP-1的增活效应均无显著差异(P
>0.05)。双因素方差分析结果显示蛇葡萄素与 IL-
8有协同作用 (P <0.05),蛇葡萄素与 MCP-1也有
协同作用(P <0.05)。
　表 1　 蛇葡萄素与 IL-8的化学增活作用( x±s, n=4)
Am pelopsin(μg /m l)
IL-8 /(ng /m l)
0 50 100 150
0 　　 / 0. 5±1.0 7. 0±0. 8 10.0±2. 7
12. 8 5. 8±1. 3　 11. 0±2.2 16. 0±1. 4 19.0±1. 8
25. 6 11. 8±1. 3* 15. 0±0.8 19. 0±1. 8 26.0±1. 8
51. 2 15. 3±1. 9* 20. 0±1.4 22. 0±1. 8 31.0±1. 8
　　与 IL-8 100 ng /m l组比较 , *P<0. 05
　表 2　蛇葡萄素与MCP-1的化学增活作用( x±s, n=4)
Am pelopsin(μg /m l)
MCP-1 /(ng /m l)
0 10 50 100
0 　　 / 3. 0±0. 8 7.0±0. 8 15. 0±1. 8
12. 8 4. 0±0. 8 11. 0±1. 6 16. 0±0. 8 21. 0±2. 2
25. 6 7. 0±0. 8 18. 0±0. 8 20. 0±0. 8 26. 0±1. 8
51. 2 12. 0±0.8# 23. 0±2. 2 27. 0±2. 2 34. 0±0. 8
　　与 MCP-1 50 ng /m l组比较 , #P<0. 05
2.2 　蛇葡萄素对免疫细胞的化学趋化作用　表 3
及图 2为琼脂糖平板中的化学趋化实验的结果 。可
以看出 ,蛇葡萄素各浓度组对两种细胞均有化学趋
化作用 (P <0.05), 但量效关系不显著 。浓度为
12.8μg /m l的蛇葡萄素的趋化效应强于 150 ng /m l
的 IL-8或 100 ng /m l的 MCP-1(P <0.05)。
3 　讨论
趋化因子是发现于哺乳动物 、鸟类和鱼类动物
体内的一种小分子的 、具有趋化吸引性的蛋白质 ,借
助浓度梯度的不同 ,引起多种免疫细胞定向移动 。
趋化因子参与广泛的病理 、生理效应 〔5〕 ,单核 、巨噬
细胞对恶性肿瘤具有细胞毒性 ,而对正常细胞则较
弱 ,甚至没有毒性 。单核 、巨噬细胞系统的调节主要
由机体趋化因子家族进行 。已证明在该家族常见的
6个成员中 , MCP-1是最有效 、作用最强的单核细胞
图 1　蛇葡萄素的化学增活作用(n=4)
A.与 IL-8的协同作用　B.与 MCP-1的协同作用
图 2　蛇葡萄素的化学趋化效应(n=4)
H 分别代表蛇葡萄素 51.2 μg /m l、 IL-8 150 ng /m l、MCP-1 100
ng /m l;M 分别代表蛇葡萄素 25.6 μg /m l、 IL-8 100 ng /m l、
MCP-1 50 ng /m l;L分别代表蛇葡萄素 12.8 μg /m l、 IL-8 50
ng /m l、MCP-1 10 ng /m l
　　表 3 　蛇葡萄素的化学趋化效应———与 IL-8及MCP-1的比较( x±s, n=4)
IL-8 MCP-1 Am p
concentration
/μg m l-1 0.050 0. 100 0. 150 0. 010 0.050 0. 100 12. 8 25.6 51. 2
m igration rate 0. 00±0. 06 1. 22±0. 12* 2. 03±0.18* 0. 84±0.17 1.67±0. 14* 1. 87±0. 11* 2. 20±0. 19*#2. 32±0. 16*# 2. 51±0. 24*#
　　* com pare w ith b lank, P<0. 05;#compare w ith 150 ng m l-1 of IL-8, or 100 ng m l-1 ofMCP-1, P<0.05
261 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月
趋化蛋白。MCP-1主要由单核细胞 、淋巴细胞 、成纤
维细胞 、内皮细胞产生 ,但几乎所有细胞和组织经适
当刺激后都能产生 MCP-1〔5〕。 IL-8是第一个被报道
的引起黑色素瘤细胞系化学趋化和接触趋化的趋化
因子 ,随后发现 IL-8也是某些黑色素瘤细胞的自分
泌生长因子 。 IL-8除了直接刺激黑色素瘤细胞的生
长外 ,还促进血管增生 ,从而间接促进了肿瘤的生
长 〔6〕。 IL-8能通过受体选择性诱导中性粒细胞 、T
淋巴细胞和嗜碱性粒细胞趋化 ,具有一定的免疫增
强作用 。
我们的实验已经证实蛇葡萄素对内皮细胞有良
好的增殖抑制作用(另文发表 ),因此考虑将其作为
血管增生抑制剂在有效浓度范围与趋化因子 IL-8、
MCP-1联用 。本文观察了不同浓度的蛇葡萄素和趋
化因子的化学增活和化学趋化作用 ,结果证明蛇葡
萄素不但对中性粒细胞和单核细胞均有化学增活和
化学趋化效应 ,且在对免疫细胞的化学增活方面 ,蛇
葡萄素与 IL-8及 MCP-1均存在协同作用 (P <
0.05),提示蛇葡萄素用于肿瘤防治 ,不但可以直接
抑制肿瘤血管的增生 ,同时还可协同体内趋化因子
对免疫细胞的趋化 ,间接抑制肿瘤细胞及血管的生
成 ,蛇葡萄素对免疫细胞的趋化作用可能是其抗肿
瘤侵袭和转移作用的重要机制之一。
参 考 文 献
[ 1] 张琼光 , 丁英平 , 张科力 , 等 . 蛇葡萄属植物药理学研
究概况 .时珍国医国药 , 2005, 16(2):151-152.
[ 2] 刘德育 , 罗曼 , 谢冰芬 , 等 .蛇葡萄素的抗肿瘤作用研
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[ 3] 刘德育 , 郑宏强 , 罗高琴 . 蛇葡萄素体内外对小鼠 B16
黑色素瘤侵袭和转移的抑制作用 . 中国中药杂志 ,
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G row th Fac to r Rev., 2001, 12(4):375-391.
(2005 - 07 -15收稿)
The Chemotaxis Effect of Ampelopsin on the Immunocytes
ZENG Sa, LUO Gao-qin, L IU De-yu
(Schoo l of Pharm aceu tical S ciences, Sun Ya t-sen University, Guangzhou 510080, China)
Abstrac t　Objective:To study the chemo tax is e ffec t o f ampe lopsin w ith differen t concentra tion on monocy tes and neutroph ilic
g ranu locy te s. M ethods:Chem okinesis and chem o tax is tests we re proceed in aga rose ge l com pa ringw ith chemokine IL-8 o rMCP-1. Re-
su lts:A t 25.6 μg /m l o r 51.2 μg /m l, am pe lopsin could strong ly enhance the m igration o f neu troph ilic granulocy tes and monocy tes.
The chem o tax is effec t induced by 25.6 μg /m l o f ampe lopsin had no sign ificant diffe rences w ith tha t induced by 150 ng /m l o f IL-8 o r50
ng /m l o fMCP-1 (P>0.05). At a concen tra tion of 12. 8μg /m l, the chemokime e ffect of am pelopsin w asm ore potent than tha t o f 150
ng /m l o f IL-8 o r100 ng /m l ofMCP-1 (P<0.05). Am pe lopsin exerted a syne rgistic ac tion w ith IL-8 orMCP-1 on its chem otax is e ffec t
to neutrophilic granulocy tes and monocy tes. Conc lusion:Ampe lopsin can strong ly enhance the chem okinesis and chem o tax is e ffec ts of
neu troph ilic g ranu locy te s and moncy tes and exe rt a synergistic ac tion w ith IL-8 o rMCP-1 on its chem o tax is effect to neutrophilic granu-
locy tes and monocy tes.
K ey words　Am pe lopsin;Chem otaxis;Immunocy te; IL-8;MCP-1
楮实子红色素体外抗氧化作用研究
庞素秋 1, 2 ,王国权 2 ,秦路平1* ,黄宝康 1 ,张巧艳 1
(1.中国人民解放军第二军医大学药学院生药教研室 ,上海 200433;2.中国人民解放军第 180医院药械
科 ,福建泉州 362000)
　　摘要　目的:探讨楮实子红色素(F ructus Broussone tiaH aem atochrome, FBH)体外抗氧化作用。方法:采用 H2O2
和 Fe2+系统产生羟基自由基 , NADH-PMS-NBT系统产生超氧阴离子自由基 ,并观察了 FBH对羟基自由基及超氧阴
离子自由基清除效果以及对 H2O2诱导小鼠红细胞溶血的抑制和对肝组织匀浆自氧化终产物 MDA及 VC-Fe2+系
统引起的线粒体的形态改变的抑制作用。结果:FBH能显著清除超氧阴离子及羟基自由基 , 抑制 H2O2诱导小鼠红
细胞溶血和肝匀浆自氧化 ,对肝线粒体也有保护作用。结论:FBH有较强的体外抗氧化作用。
关键词　楮实子红色素;超氧阴离子自由基;羟自由基;丙二醛;体外抗氧化
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)03-0263-04
262 中药材第 29卷第 3期 2006年 3月