全 文 ：中国环境科学 2013,33(4)：734~740 China Environmental Science

正反胶束体系中木素过氧化物催化氧化藜芦醇条件优化
方振敏 1,2,袁兴中 1,2*,曾光明 1,2,韩增辉 1,2,郭灵芝 1,2,彭 馨 1,2,刘 薇 1,2,黄华军 1,2 (1.湖南大学环境科
学与工程学院,湖南 长沙 410082；2.湖南大学环境生物与控制教育部重点实验室,湖南 长沙 410082)

摘要：对比研究了单鼠李糖脂(RL)构建的反胶束和胶束体系中木素过氧化物酶(Lip)催化氧化藜芦醇(VA)的各主要影响因素,同时探讨了疏
水性底物 VA在非均相反胶束介质中的分区系数.结果表明:在 30℃下,在 RL/异辛烷-正己醇(V:V,1:1)/水反胶束体系中,Lip能保持较高活性
的最佳介质条件是:pH=3.8,[RL]=10mmol/L,w0=15.0,[H2O2]=74μmol/L,这不同于 RL 胶束介质中的最佳催化条件: pH=3.4, [RL]=0.012mmol/L,
[H2O2]=2.45mmol/L.在最佳催化条件下,Lip的半衰期达 40h,催化活力是胶束水相中的 2.86倍.根据两相模型及相应的动力学方法计算得出
VA主要增溶于反胶束拟相中,其在反胶束拟相和有机相间的分区系数为 70.4.分区系数的确定对于进一步讨论 RL反胶束体系中 Lip催化
氧化 VA的动力学机制而言具有重要意义.
关键词：鼠李糖脂；胶束；反胶束；木素过氧化物酶；藜芦醇；分区系数
中图分类号：X131.2 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2013)04-0734-07

Optimization on the conditions of Lip-catalyzed oxidation veratryl alcohol in the micellar and reverse micellar
systems. FANG Zhen-min1,2, YUAN Xing-zhong1,2*, ZENG Guang-ming1,2, HAN Zeng-hui1,2, GUO Ling-zhi1,2, PENG
Xin1,2, LIU Wei1,2, HUANG Hua-jun1,2 (1.College of Environmental Science and Engineering, Hunan University,
Changsha 410082, China；2.Key Laboratory of Enviromental Biology and Pollution Control,Ministry of Education, Hunan
University, Changsha 410082, China). China Environmental Science, 2013,33(4)：734~740
Abstract：The main factors which affected the catalytic oxidation of veratryl alcohol (VA) by lignin peroxidase(Lip)
entrapped in rhamnolipid(RL) reverse micellar or micellar systems were investigated. Meanwhile, the partition coefficient
of insoluble substrate VA in the heterogeneous reverse micellar medium were studied. It was shown that Lip hosted in
RL/isooctane-n-hexanol(1:1,V:V)/water reverse micellar system could express higher enzymatic activity under the
following conditions: pH 3.8, [RL]=10mmol/L, w0=15.0, [H2O2]=74μmol/L. With respect to the RL micellar system, the
optimum values were as follows: pH 3.4, [RL]=0.012mmol/L, [H2O2]=2.45mmol/L. In optimum catalytic conditions, the
half-life of Lip was 40h, and the catalytic activity in reverse micelle was 2.86 times than that in micellar system. Based on
the biphasic model and the corresponding kinetic method, a conclusion could be made that VA was mainly solubilized in
the pseudophase of reverse micelle, and the partition coefficient of VA between the pseudophase and organic solvent phase
was 70.4. The determination of partition coefficient is important for further discussing the kinetic mechanism of
Lip-catalyed oxidation VA in the RL reverse micellar system.
Key words：rhamnolipid；micelle；reverse micelle；lignin peroxidase；veratryl alcohol；partition coefficient

环境中木质素类物质的大量存在使得木质
素降解酶的研究具有现实意义[1].木素过氧化物
酶(Lip)被认为是木质素降解过程中的关键酶
类 [2],它是由具有木素降解功能的白腐真菌分泌
的胞外酶[3],可以催化一系列酚型和非酚型的木
素模型化合物.在这些模型化合物中,非酚型富含
电子的芳香族化合物藜芦醇(VA)被认为是 Lip
降解的最佳底物.在水溶液中,疏水性的木素模型
化合物很难被亲水性的 Lip 有效降解[4],且酶分
子构象容易波动而导致酶活性降低,因此寻求一
种新的介质体系来研究 Lip 对疏水性化合物的
降解具有重要意义.
反胶束是表面活性剂分子在有机溶剂中形
收稿日期：2012-08-11
基金项目：国家自然科学基金资助项目(50978087)
* 责任作者, 教授, yxz@hnu.edu.com
4期 方振敏等：正反胶束体系中木过氧化物催化氧化藜芦醇条件优化 735

成的纳米级分子聚集体.在反胶束体系中,表面活性
剂亲水性头基在内形成的极性水核具有增溶生物
大分子(如蛋白质、酶等)的作用,外部的有机溶剂有
助于疏水性化合物在其中的溶解.因此反胶束成为
上述疏水性化合物酶法转化的良好介质.近年来,反
胶束体系作为酶催化反应的介质引起了越来越多
的关注,但研究的重点却偏向于化学表面活性剂构
建的反胶束体系[5-9].同化学表面活性剂相比,生物
表面活性剂作为一种环境友好型的天然表面活性
剂,具有低毒性、可生物降解性、生态相容性及一
定的胶团催化能力等优势 [10],而在反胶束酶学中具
有较好的应用前景.目前,国内外采用生物表面活性
剂构建反胶束体系进行酶催化反应的研究除了本
课题组研究报道[11]外,几乎未见其他报道.
本文以 Lip 为生物催化剂,对比研究了单鼠
李糖脂(RL)反胶束和胶束体系中 Lip 催化氧化
VA 的各主要影响因素,同时探讨了疏水性底物
VA 在非均相反胶束介质中的分区系数.该研究
拓展了胶束酶学中用于构建反胶束体系的表面
活性剂的种类,这对于构建适合于胶束酶学研究
的新型反胶束体系(生物表面活性剂反胶束酶解
体系)而言具有重大意义.
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
岛津 UV-2550 型紫外分光光度计 (日本
Shimadzu 公司 ),TDA-8002 电热恒温水浴锅 ,
WHY-2 恒温水浴振荡器,HZQ-C 空气浴振荡培
养箱,TGL-16G离心机,磁力搅拌器.
藜芦醇(VA)购于 Sigma Aldrich 公司.异辛
烷、正己醇及实验过程中所用的其他试剂均为分
析纯,使用过程中无需进一步纯化,水为超纯水.
1.2 鼠李糖脂的生产和纯化
本实验所用的单鼠李糖脂由本课题组制备,
其生产和纯化步骤详见文献[12].
1.3 木素过氧化酶(Lip)的生产、分离和纯化
木素过氧化酶(Lip)的生产、分离和纯化步骤
详见文献[13].
1.4 反应初速度的测定
1.4.1 含有 Lip 酶液的反胶束体系的制备 在
小锥形瓶中加入一定体积的异辛烷-正己醇(体
积比为 1:1)的混合液,按照所需表面活性剂的浓
度称取一定量的鼠李糖脂于上述小锥形瓶中,
用移液枪加入溶有一定量 Lip 的柠檬酸缓冲液
(0.1mol/L),pH 值梯度范围为 3.0~4.2,磁力搅拌
至形成透明澄清的反胶束体系.相应的胶束体
系只需将有机溶剂换成 0.1mol/L的柠檬酸缓冲
溶液.
1.4.2 反应初速度的测定 VA 是黄孢原毛平
革菌的一种次生代谢产物,可诱导 Lip 的合成,是
Lip的最适底物.在 310nm处无光吸收,而在H2O2
的协同作用下,Lip 可以将 VA 氧化成藜芦醛,产
物藜芦醛在 310nm 处有强烈的光吸收[ε=9.3×
103L/(mol·cm)][14].测试方法如下:直接称取一定
质量的藜芦醇溶于上述反胶束体系中,磁力搅
拌均匀后,于 30℃下预热 2min,取 3mL于石英比
色皿中,以 10mmol/L 的 H2O2溶液引发反应,立
即记录 310nm处吸光度 A随反应时间 t的变化
曲线.反应初速度 ν0[μmol/(L·min)]即为 A-t曲线
线性部分的斜率.本实验在相同单因子条件下
共设置了三组平行试验,试验结果为三次测定
的平均值.
2 结果与讨论
2.1 各主要因素对反应初速度的影响
2.1.1 反应体系的 pH 值对 ν0的影响 反应介
质中的 pH值是影响酶催化反应的一个重要因素.
通过配制一系列不同 pH 值梯度(3.0~4.2)的柠檬
酸缓冲溶液(0.1mol/L),研究 pH 值对 RL 构建的
反胶束及胶束体系中 Lip催化氧化VA反应初速
度的影响,其结果如图 1所示.一般而言,增溶的缓
冲溶液的 pH 值被认为是反胶束纳米水核的 pH
值[15].纳米水核的 pH 值决定着酶分子的催化构
象及其在反胶束体系中的增溶能力,同时 pH 值
的变化还可能改变酶分子与反胶束液膜之间的
相互作用[16].
如图 1 所示,反胶束体系中催化反应的最适
pH 值为 3.8,这比在胶束水溶液(3.4)中的略高,这
可能和Lip的结合和氧化位点有关.Lip的结合和
氧化位点暴露于酶蛋白的表面,当 Lip 增溶到反
736 中 国 环 境 科 学 33卷

胶束中后,其表面暴露的位点很容易受到 RL 内
表面极性头基的影响[17].由于反胶束反应体系中
的 pH 值低于 Lip 的 pI:4.2~4.9[18],从而使得 Lip
带正电荷,这样 RL 液膜内表面带负电荷的阴离
子头基和带正电的 Lip 之间产生有利的静电相
互作用使得 Lip 暴露的位点可以耐受相对较大
的 pH值.

v 0
[m
ol
/(L
m
in
)]

3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
pH值
胶束
反胶束

图 1 pH值对鼠李糖脂反胶束和胶束体系中 Lip氧化
VA反应初速度的影响
Fig.1 Effect of pH on the initial reaction rate of VA
oxidation by Lip hosted in the RL reverse micellar
and micellar systems
2.1.2 表面活性剂溶度[RL]对 ν0的影响 只有
当表面活性剂浓度达到临界胶束浓度(cmc)时才
能形成反胶束[19],单鼠李糖脂在水相及有机相中
的临界胶束浓度分别为0.012, 0.055mmol/L[20].依
据上述 cmc 值,对比了两种体系中[RL]对 Lip 催
化 VA 反应初速度的影响.由图 2 可以看出,固定
w0(c[水]/c[表面活性剂],无量纲)为 15.0时,在 RL
构建的反胶束体系中 Lip催化氧化VA的反应初
速度随着RL浓度的增加出现类似钟型的变化趋
势.[RL]在 1~10cmc之间 Lip的活力几乎为零.在
100~180cmc(约 5.5~10mmol/L)的范围内 ,随着
[RL]的增大,催化活力逐渐增大.最大酶活出现在
[RL]=10mmol/L 处,超过 10mmol/L 时随着[RL]
的增加酶活迅速降低.
在w0值恒定时,表面活性剂浓度的增加只会
引起反胶团个数的增加而不会影响反胶团体积
的大小,开始阶段由于反胶团个数的增加增大了
酶分子与底物的接触和碰撞机率,因此反胶束酶
系统中催化反应速率随着表面活性剂浓度的增
加出现增大的趋势;超过一定值后,随着 RL 浓度
的增加,酶分子在反胶团中的浓度降低,单位时间
内酶和底物的接触机率变小从而又引起酶活的
下降[21].而在鼠李糖脂构建的胶束体系中 Lip 催
化 VA 反应除了在低浓度 30μmol/L 下对 Lip 有
微弱的激活作用外,从图形的整体趋势来看,胶束
体系中Lip催化活力随着RL浓度的增加而降低.
对比可知,在胶束体系中较低的表面活性剂浓度
即表现出对 Lip 催化活性的强烈抑制作用,这可
能和水溶液中表面活性剂对酶蛋白的变性作用
有关.在胶束体系中,Lip 分散于水溶液中,酶分子
容易受到表面活性剂单体的变性作用,从而改变
其催化构象,导致催化活力的降低[22].

0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 6 8 10 12
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
胶束
反胶束
[RL](mmol/L)
v 0
[u
m
ol
/(L
m
in
)]


图 2 RL浓度对反胶束和胶束体系中 Lip催化氧化 VA
反应初速度的影响
Fig.2 Effect of the concentration of RL on the initial
reaction rate of Lip-catalyzed oxidation VA in the
reverse micellar and micellar systems
2.1.3 含水率 w0对 ν0的影响 含水率 w0直接
影响反胶束纳米水核大小,进而影响反胶束增溶
能力和酶在其中的催化效率[23].如图 3 所示,Lip
催化氧化 VA 的反应初速度随着 w0的变化呈现
近似钟型的变化趋势,w0在6.0以下Lip基本无催
化活性(图中略去),在 w0为 6.0~15.0 时,随着 w0
的增加催化反应初速度逐渐增大,w0=15.0 时催
化速率达到最大值,之后随着w0的增加催化速率
4期 方振敏等：正反胶束体系中木过氧化物催化氧化藜芦醇条件优化 737

几乎成线性减小.

6 9 12 15 18 21 24
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
w0
v 0
[m
ol
/(L
m
in
)]


图 3 w0对RL反胶束体系中 Lip氧化VA反应初速度的
影响
Fig.3 Effect of w0 on the initial reaction rate of VA
oxidation by Lip entrapped in the RL reverse micellar
system
处于最佳含水率时,反胶束纳米水核空间的
大小与酶分子大小相当,酶分子在反胶束中可以
保持最佳的构象,从而表现出较高酶活;当 w0 小
于此值时,反胶束水核体积较小,不能很好地增溶
酶分子,致使酶分子过多地暴露于有机溶剂中,从
而使酶的催化活性降低;而当 w0 大于此值时,反
胶束水核尺寸大于酶分子大小,酶分子在纳米水
核中的自由度增加,其构象受到扰动而变得松散.
只有在最佳含水量时酶蛋白结构的动力学刚性
和热力学稳定性之间达到最佳平衡点,酶才表现
出最大活力[24].
2.2 Lip在两种介质中的活性和稳定性
由于酶在增溶进反胶束的过程中其活性和
稳定性会随之改变[25],为此,实验测定并讨论了
Lip酶在 RL胶束和反胶束体系中的催化活性和
酶活稳定性 .胶束体系的实验条件 :pH3.4,
[RL]=0.012mmol/L,[H2O2]=2.45mmol/L;反胶束
体系的实验条件 :pH3.8,[RL]=10mmol/L,w0=
15.0,[H2O2] =74μmol/L.由图 4可知,在RL胶束介
质中 Lip 酶活在 8h 内损失超过 50%,10h 后 Lip
基本完全失活,而在RL反胶束体系中Lip的半衰
期达到 40h 左右,在 62h 时仍然保持原有酶活的
32%;此外,RL构建的反胶束体系中Lip的最大催
化活力比其在胶束水溶液中高了近 2.86倍,表现
出超活性.

10 20 30 40 50 60 70 80
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
时间(h)
胶束
反胶束
v 0
[m
ol
/(L
m
in
)]


图 4 Lip在两种介质中的活性和稳定性
Fig.4 Activity and stability of Lip in the two medium

0.02 0.04 0.06 0.08 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
胶束
反胶束
[H2O2](mmol/L)
v 0
[m
ol
/(L
m
in
)]


图 5 H2O2浓度对 RL反胶束及胶束体系中 Lip催化氧
化 VA反应初速度的影响
Fig.5 Effect of the H2O2 concentration on the initial
reaction rate of Lip-catalyzed oxidation VA in the RL
reverse micellar and micellar system
在最优催化条件下,酶在两种体系中的活性
和稳定性产生较大差别的原因较为复杂,可能是
因为RL反胶束中的纳米水核模拟了生物细胞内
的微环境,反胶束的存在使得增溶于纳米水核中
的 Lip 与有机相彼此分离,避免了酶与有机溶剂
的直接接触,有效地保护了酶的活性部位,对其催
化构象的变化有一定程度的束缚作用,从而提高
了酶的催化性能和稳定性;而在胶束体系中,Lip
分散于水溶液中,酶分子刚性减弱、波动性变大,
从而导致了活性降低[26-27].Kimura 等[28]证实在
AOT反胶束体系中, Lip酶由于受到反胶束纳米
水核的保护而导致 Lip 的活性明显增强,类似现
738 中 国 环 境 科 学 33卷

象出现在反胶束体系中锰过氧化物酶(Mnp)[29]、
漆酶(Lac)[30]、纤维素酶(Cellulose)[31]、碱性磷酸
酶(pNPPsase)[32]等的催化特性研究中.
2.3 H2O2抑制浓度和底物分区系数 P的确定
2.3.1 H2O2抑制浓度的确定 对于 Lip 催化氧
化 VA 的反应而言,H2O2既是反应的启动剂又是
反应的抑制剂[33],因此在讨论胶束和反胶束中的
反应动力学机制时确定 H2O2的抑制浓度十分必
要.图 5表示在两种介质中反应初速度随着 H2O2
浓度的变化曲线.可以看出,反胶束体系中 Lip 的
催化活性在很大程度上取决于 H2O2 的浓度.当
H2O2浓度为 74μmol/L时反应初速度达到最大值,
当H2O2浓度达99μmol/L时即表现对酶活的强烈
抑制作用,因此动力学实验中 H2O2 浓度范围应
选择在34~74μmol/L之间.然而在RL胶束水溶液
中当H2O2的浓度达到 3.25mmol/L时 Lip仍具有
催化活性.在反胶束介质中 H2O2 的抑制浓度远
低于水溶液中,主要是由反胶束介质的微观不均
一性引起的.也就是说,在反胶束体系中,H2O2 主
要增溶于纳米水核中,这高度浓缩了反应过程中
H2O2 的浓度,从而使 H2O2 在较低的浓度表现出
对酶活的强烈抑制作用[34].

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
2.8
0.0274
0.0345
0.0417
0.0490
0.0563
v 0
-1
[(
Lm
in
)/
m
ol
]
[VA]-1(L/mmol)


图 6 在一组不同 θ下,在 RL反胶束体系中 Lip催化氧
化 VA反应的初速度对 VA浓度的双倒数图
Fig 6 Double reciprocal plot of the initial rate of Lip-
catalyzed oxidation VA versus the concentration of
VA at several different values of θ in the RL
reverse micellar system
2.3.2 VA在反胶束体系中分区系数P的确定 根
据两相模型(biphasic model)[35],将鼠李糖脂/异
辛烷-正己醇/水反胶束体系看成由有机相和反
胶束拟相两部分组成.亲水性的 Lip酶增溶于反
胶束拟相中,疏水性的底物 VA在有机相和反胶
束拟相中均有较大的溶解度[34].因此在讨论 RL
反胶束体系中 Lip 酶的催化动力学时应首先考
虑VA在两相中的分配系数P.由两相模型(底物
分区考虑在内):
cat ,app 0,app 0,app0
m,app 0,app
[E]
[S]
k S
v
k
   (1)
其中: cat ,app cat,mick k
m,app m,mic
1 ( 1)Pk k
P
   (2)
分配系数 P定义如下: mic
os
[S]
[S]
P 
式中:[E]0,app,[S]0,app 为酶和底物的表观初始浓
度; kcat,app, kcat,mic 为表观催化常数和反胶束拟
相催化常数; km,app, km,mic为表观米氏常数和反
胶束拟相米氏常数;θ 为反胶束体系中水的体
积分数;P 为底物在反胶束拟相和有机相中的
浓度比 ; [S]mic,[S]os 为底物在反胶束拟相和有
机相中的浓度.
由式(1)得:
m,app
0 max 0,app max
1 1
[S]
k
v v v
  (3)
由式(2)得:
m,micm,app m,mic
1(1 )
k
k k
P P
     (4)
由式(4)可知,在一组固定的 θ下,产生几个固
定的 km,app,此时式(3)中 v0-1~[S]0,app-1双倒数图为
一系列有着相同截距 vmax-1,不同斜率 km,app/vmax
的直线.二级图 km,app~θ 仍为一直线,其斜率与截
距之比为 P-1,据此可以求出分配系数 P.
图 6 表示在几个固定的 θ 下,反应初速度 ν0
对不同浓度的 VA 的双倒数曲线.由图 6 可知
ν0-1~[VA]0-1 双倒数曲线皆可拟合成较好的直线,
且在不同 θ下,直线相交于 y轴上同一点.图 6中
斜率 km,app/vmax与截距 vmax-1之比 km,app对 θ二次
作图,得一直线(图7).直线斜率为539,截距为7.77,
则有斜率/截距=69.4,即 P-1=69.4,据此可算出
4期 方振敏等：正反胶束体系中木过氧化物催化氧化藜芦醇条件优化 739

P=70.4.

0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0.055 0.060
22
24
26
28
30
32
34
36
38

k m
,a
pp
(m
ol
/L
)

图 7 km,app对 θ二次作图
Fig.7 Replot of the values of km,app versus θ
3 结论
3.1 在 RL 构建的反胶束体系中 Lip 催化氧化
VA受反胶束纳米水核 pH值、含水率 w0和鼠李
糖脂浓度等主要因素的影响,最佳催化活力出现
在:pH=3.8,w0=15.0,[RL]=10mmol/L 处,处于最适
条件下,Lip的半衰期长达 40h,对比 Lip在反胶束
介质和胶束介质中的催化活性可知,Lip在 RL反
胶束体系中表现出了超活性.
3.2 反胶束的纳米水核高度浓缩了反应过程中
H2O2 的浓度 ,从而使 H2O2 在较低的浓度
(99μmol/L)时即表现出对酶活的强烈抑制作用,
因此在后续研究 RL反胶束体系中 Lip催化氧化
VA 的动力学机制时应该选取 H2O2的浓度范围
为 34~74μmol/L之间.
3.3 在鼠李糖脂构建的反胶束体系中,疏水性
底物 VA 主要增溶于反胶束拟相中,根据两相模
型可计算其在反胶束拟相和有机溶剂相间的分
区系数为 70.4.分区系数的确定对于进一步讨论
RL 反胶束体系中 Lip 催化氧化 VA 的动力学机
制而言具有重要意义.
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作者简介：方振敏(1986-),女,安徽金寨人,湖南大学环境科学与工
程学院硕士研究生,主要从事固体废物资源化方面的研究.


单颗粒气溶胶飞行时的碎片形态、成像、质谱分析
微米级细颗粒物的形态对毒理学和气候学都非常重要,但颗粒的这些属性很难在自然环境中测量到.电子显微
镜学需要在基质上收集颗粒态,可见光散射提供的分辨率不足,X 射线同步加速器研究被限定在集合的颗粒物上.这
里,展示 1 种原位测量方法,对在自然环境中分辨就绪在亚微米级到纳米级的单颗粒呈像,采用 1 个有明暗度强的直
线加速器相干光源的 X射线自由电子激光.引入单颗粒气溶胶到脉冲的 X射线光束中,有足够强的衍射光可以测量
到单个颗粒的形态以进行分析.同时,由光速发射出的离子碎片采用质谱进行分析,已确定出来单颗粒气溶胶颗粒的
组成成分.研究结果显示,单颗粒烟煤颗粒的内部扩线的对称性使其服从于非平衡聚合,同时碎片体积的变化范围非
常大.此外,该方法可以延伸到解析无序颗粒集合的静止和动态形态.这种总体形态分析法可推广用于蛋白学的溶剂
可达性、氨基酸的流体动力学交互作用中的震动能转化以及火焰法大量合成纳米结构物质等领域.

马英歌 译自《Nature》, 2012,June 28:513-517.