全 文 ：收稿日期:2012-10-26; 修订日期:2013-04-01
基金项目:国家自然科学基金( No． 31170335) ;
湖北省武汉市重点科技攻关计划项目( No． 201160823265)
作者简介:江 灿( 1987-) ，女( 汉族) ，湖北枝江人，现为湖北中医药大学
研究生，硕士学位，主要从事中药资源和品质以及活性成分研究工作．
* 通讯作者简介:张秀桥( 1965-) ，女( 汉族) ，河北新乐人，现任湖北中医
药大学教授，博士学位，主要从事中药资源和品质以及活性成分研究工
作．
大叶蛇葡萄总黄酮提取物
的 HPLC指纹图谱研究
江 灿1，陈 朋1，朱志凯1，陈 敏1，张秀桥1，2* ，刘焱文2
(1．湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430061;
2．湖北省中药资源与中药化学重点实验室，湖北 武汉 430065)
摘要:目的 建立大叶蛇葡萄总黄酮提取物的 HPLC指纹图谱。方法 用 70%乙醇回流提取制备大叶蛇葡萄总黄酮提取
物，采用 ＲP － HPLC分析。色谱柱为 Angilent TC － C18 ( 4． 6 mm × 250 mm，5μm) ，流动相为乙腈 － 0． 2%磷酸水梯度洗脱，
检测波长 265 nm ，柱温为 30℃，进样量为 20 μl。结果 测定了 11 批大叶蛇葡萄总黄酮提取物的指纹图谱，标定了 10 个
共有指纹峰，方法学考察结果符合指纹图谱技术要求。结论 建立的大叶蛇葡萄总黄酮提取物的 HPLC指纹图谱，为大叶
蛇葡萄总黄酮提取物的质量控制提供了依据。
关键词:大叶蛇葡萄; 总黄酮; 高效液相色谱; 指纹图谱
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 07． 008
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 07-1561-03
Study on HPLC Fingerprint of Total － Flavonoid from Ampelopsis megalophylla
JIANG Can1，CHEN Peng1，ZHU Zhi-kai1，CHEN Min1，ZHANG Xiu-qiao1，2* ，LIU Yan-wen2
( 1． Hubei University of Traditional Chinese Medicine ，Wuhan 430061，China; 2． Hubei Key Laboratory of Ｒe-
source Science and Chemistry in Chinese Medicine，Wuhan 430065，China)
Abstract: Objective To establish a HPLC fingerprint of total － flavonoid from Ampelopsis megalophylla． Methods The samples
were preparated with 70% ethanol by reflux extraction and analyzed by ＲP － HPLC with an Agilen TC － C18 column( 4． 6 mm ×
250 mm，5μm) ，gradiently eluted with the mixture of acetonitrile and 0． 2% phosphoric acid aqueous at 30℃，and monitored with
UV detector at 265nm，and sample volume injected was 20μl． Ｒesults The HPLC fingerprints of total － flavonoid from Ampelopsis
megalophylla showed 10 common peaks in 11 batches of samples and the result was in accordance with the technical requirement
of fingerprint spectrum． Conclusion This HPLC fingerprints provided a basis for the controlling the quality of the total － flavonoid
of Ampelopsis megalophylla．
Key words: Ampelopsis megalophylla; Total － flavonoid; HPLC; Fingerprint
大叶蛇葡萄 Ampelopsis megalophylla Dielset． Gilg 是湖北西部
地区民间常用中草药，曾以“霉茶”之名收载于《湖北中草药志》，
药用其叶及嫩茎，具有清热利湿、活血化瘀的功能，用于高血压
病、痢疾、泄泻、小便淋痛、头昏目胀等治疗［1］。课题组前期从中
分离并鉴定了十余种化合物，其中主要为黄酮类成分［2］，药理研
究表明大叶蛇葡萄的提取物具有降血压和抗病毒的作用［3，4］。
本文通过对 11 批大叶蛇葡萄总黄酮提取物 HPLC 指纹图谱分
析，建立大叶蛇葡萄总黄酮提取物的指纹图谱，为其活性物质的
质量控制提供了参考依据。
1 仪器与试剂
1． 1 仪器 戴安 P680 高效液相色谱仪 (四元泵、紫外检测器
170U及配套色谱工作站) ;GZX － 9146MBE 数显鼓风干燥箱;
SK7200HP超声清洗器;AL204 型万分之一分析天平;旋蒸仪(上
海亚荣科技公司)。
1． 2 试剂 乙腈(AＲ，美国) ;甲醇(AＲ，美国) ;双蒸水;磷酸溶
液;其余试剂均为分析纯。
1． 3 材料 对照品蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷均为自制，经 HPLC
归一法检测，纯度大于 98% ;对照品槲皮苷(中国药品生物制品
检定所，批号:100081 － 200406) ;11 批药材均经湖北中医药大
学生药教研室张秀桥教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡
萄 Amegalophylla Dielset． Gilg的茎叶。样品来源见表 1。
表 1 大叶蛇葡萄样品来源及采收时间
样品编号 样品采集地 采集时间
1 号样(S1) 湖北省来凤县大河镇牡丹坪村 2011 － 06 － 12
2 号样(S2) 湖北省来凤县大河镇冷水溪村 2011 － 06 － 12
3 号样(S3) 湖北省来凤县大河镇满店村 2011 － 06 － 12
4 号样(S4) 湖北省来凤县大河镇杉木塘村 2011 － 06 － 12
5 号样(S5) 重庆市酉阳县兴龙镇兴平村 2011 － 06 － 10
6 号样(S6) 重庆市酉阳县毛坝乡天苍坝村 2011 － 06 － 10
7 号样(S7) 湖南省吉首自治州保靖县王家湾村 2011 － 06 － 11
8 号样(S8) 湖南省张家界市桑植县五道水村 2011 － 06 － 11
9 号样(S9)湖北省恩施州来凤县革勒乡土家寨村 1 号 2011 － 08 － 24
10 号样(S10)湖北省恩施州来凤县革勒乡小河村 2 组 2011 － 08 － 24
11 号样(S11)湖北省恩施州来凤县革勒乡土家寨村 2 号 2011 － 08 － 24
2 方法与结果
2． 1 色谱条件 色谱柱:Angilent TC － C18(4． 6 mm × 250 mm，5
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μm)。流动相:乙腈 － 0． 2 % 磷酸水，按表 2 的条件进行梯度洗
脱;柱温:30℃;检测波长:265 nm;进样量:20 μl;流速:1． 0 ml /min。
表 2 梯度洗脱条件
时间 /min 乙腈 0． 2%磷酸溶液
0 10 90
15 15 85
55 30 70
65 10 90
2． 2 供试品溶液的制备 精密称取大叶蛇葡萄叶和嫩茎 5 g，粉
碎，加 8 倍量 70%乙醇，回流提取两次，提取时间分别为 1 h、0． 5
h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇至滤液无醇味，干燥，研磨，即得
大叶蛇葡萄总黄酮提取物。精密称取提取物 10 mg，加适量甲
醇，超声处理 15 min，再加甲醇定容至 10 ml;再精密吸取 3 ml，转
移至 10 ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，经 0． 45 μm滤膜过
滤，即得供试品溶液。
2． 3 对照品溶液的制备 分别称取蛇葡萄素、杨梅苷、槲皮苷、杨
梅素对照品各适量，加适量甲醇，超声处理 15 min，加甲醇定容至
10 ml，浓度分别为 0． 1，0． 2，0． 1，0． 1 mg /ml，再经 0． 45 μm 滤膜
过滤，即得对照品溶液。
2． 4 方法学考察
2． 4． 1 精密度试验 取 2 号样品，制成供试品溶液，按“2． 1”项下
色谱条件连续进样 6 次，考察各共有峰的保留时间及峰面积，结
果表明 10 个共有峰相对保留时间的 ＲSD值均小于 1． 0%，10 个
共有峰峰面积百分含量的 ＲSD值小于 3． 0%，结果显示仪器精密
度良好。
2． 4． 2 稳定性试验 取 2 号样品，制成供试品溶液，按“2． 1”项下
色谱条件分别在 0，2，4，6，8，10，24 h进样，考察各共有峰的保留
时间及峰面积。结果表明 10 个共有峰相对保留时间的 ＲSD 值
均小于 1． 0%;10 个共有峰峰面积百分含量的 ＲSD 值小于 3．
0%，结果显示供试品溶液 24 h内稳定性良好。
2． 4． 3 重现性试验 取 8 号样品 6 份，分别按“2． 2”项下制备供
试品溶液，分别进行测定，考察各共有峰的保留时间及峰面积，结
果表明 10 个共有峰相对保留时间的 ＲSD值均小于 1． 0%;10 个
共有峰峰面积百分含量的 ＲSD值小于 4． 0%，结果显示重现性良
好。
2． 5 大叶蛇葡萄总黄酮提取物指纹图谱的建立
2． 5． 1 共有峰的标定及指纹图谱的建立 精密量取 11 批不同产
地大叶蛇葡萄总黄酮提取物的供试品溶液 20 μl，注入高效液相
色谱仪中按上述色谱条件测定，考察供试品溶液 120 min 内色谱
分离情况，记录 60 min的液相色谱图。根据 11 批供试品测定结
果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关
参数，进行分析比较，制定其指纹图谱。以蛇葡萄素为内标峰，共
标定 10 个共有峰，见图 1。
图 1 11 批大叶蛇葡萄总黄酮提取物样品的 HPLC指纹图谱
2． 5． 2 共有峰的归属 取蛇葡萄素、杨梅苷、槲皮苷、杨梅素对照
品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，对比
其保留时间和指纹图谱中相应时间位置的色谱峰，确定 2 号、6
号、9 号及 10 号峰分别为蛇葡萄素、杨梅苷、槲皮苷及杨梅素。
2． 6 大叶蛇葡萄总黄酮提取物 HPLC指纹图谱的分析与评价
2． 6． 1 大叶蛇葡萄总黄酮提取物 HPLC 指纹图谱的分析 在所
建立的色谱条件下，对 11 批样品进行测定，其共有峰相对保留时
间 ＲSD值均小于 2． 0%(见表 3) ，峰面积百分含量 ＲSD 值在
24． 17% ～ 63． 00%之间(见表 4)。结果表明:不同批次的大叶蛇
葡萄总黄酮提取物同一位置共有峰的保留时间较为稳定，峰面积
百分含量差异较大，说明不同批次的大叶蛇葡萄总黄酮提取物活
性成分无明显差异，但其含量差异较大。
2． 6． 2 大叶蛇葡萄总黄酮提取物 HPLC 指纹图谱的评价 将 11
批样所得的 AIA 格式的色谱图依次导入《中药色谱指纹图谱相
识度评价系统 2004A 版》(研究版)软件，输出了 11 批导入图谱
的相似度、谱峰匹配程度，并建立共有模式(见图 2)。结果显示，
11 批总黄酮提取物 HPLC 图谱的相似度在 0． 486 ～ 0． 997 之间。
其中，S1、S2、S5、S6、S7、S8 这 6 批样的相似度在 0． 817 ～ 0． 993 之
间，表明这 6 批样的吻合程度较高;S3、S4、S9、S10、S11 这 5 批样
的相似度在 0． 541 ～ 0． 784 之间，表明这 5 批样的吻合程度较低
(见表 5)。
图 2 11 批大叶蛇葡萄总黄酮提取物 HPLC指纹图谱共有模式
2． 6． 3 大叶蛇葡萄总黄酮提取物 HPLC 指纹图谱的聚类分析
本文利用 SPSS17． 0 统计软件对上述 11 批样进行 Hierarchical
Cluster聚类分析研究，得到聚类分析树状图见图 3 。
图 3 11 批样聚类分析树状
3 讨论
3． 1 指纹图谱结果分析 11 批样中 9 号、10 号、11 号样品均为
2011 年 8 月 24 日采集，其主要活性成分蛇葡萄素相对峰面积较
其他时间采集的样品大(见表 4) ，说明大叶蛇葡萄的采收时间以
8 月下旬为宜，且湖北省恩施州来凤县革勒乡的品质较好。
3． 2 聚类分析 由图 3 结合表 5 分析可知，重庆、湖南的样品及
湖北恩施地区的部分样品具有一定的相似度，湖北恩施地区的大
部分样品具有良好的相似度。可能原因是在地理位置分布上湖
北恩施处于湖南与重庆的交接处。
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 7
表 3 11 批样品共有峰相对保留时间结果统计
P /S S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 ＲSD(%)
1 0． 264 0． 265 0． 264 0． 263 0． 263 0． 263 0． 261 0． 263 0． 258 0． 264 0． 262 0． 7
2(s) 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 1． 000 0． 0
3 1． 166 1． 166 1． 166 1． 167 1． 167 1． 167 1． 166 1． 167 1． 167 1． 169 1． 168 0． 1
4 1． 318 1． 319 1． 320 1． 322 1． 320 1． 320 1． 321 1． 320 1． 322 1． 323 1． 324 0． 1
5 1． 858 1． 858 1． 859 1． 891 1． 884a 1． 891 1． 887 1． 905 1． 889 1． 885 1． 906 0． 9
6 2． 115 2． 108 2． 102 2． 185 2． 171 2． 181 2． 174 2． 196 2． 186 2． 179 2． 210 1． 7
7 2． 818 2． 820 2． 820 2． 830 2． 827 2． 828 2． 830 2． 824 2． 833 2． 830 2． 829 0． 2
8 2． 941 2． 951 2． 953 2． 947 2． 946 2． 944 2． 943 2． 938 2． 950 2． 952 2． 945 0． 2
9 3． 180 3． 170 3． 171 3． 149 3． 152 3． 148 3． 146 3． 162 3． 154 3． 152 3． 150 0． 4
10 3． 307 3． 321 3． 322 3． 299 3． 303 3． 300 3． 299 3． 290 3． 306 3． 305 3． 299 0． 3
表 4 11 批样品特征峰峰面积百分含量结果统计
P /S S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 ＲSD(%)
1 0． 0097 0． 0192 0． 0097 0． 0117 0． 0159 0． 0165 0． 0165 0． 0119 0． 0078 0． 0041 0． 0072 39． 71
2(s) 0． 1644 0． 1296 0． 2943 0． 3101 0． 2531 0． 1858 0． 1890 0． 1451 0． 4400* 0． 5888* 0． 3833* 51． 05
3 0． 0114 0． 0070 0． 0229 0． 0244 0． 0162 0． 0118 0． 0148 0． 0105 0． 0377 0． 0494 0． 0316 61． 26
4 0． 0265 0． 0240 0． 0130 0． 0095 0． 0126 0． 0166 0． 0171 0． 0216 0． 0076 0． 0057 0． 0087 47． 00
5 0． 1925 0． 1193 0． 0701 0． 0444 0． 0856 0． 1161 0． 1048 0． 1860 0． 0497 0． 0241 0． 0813 55． 52
6 0． 0491 0． 0744 0． 0818 0． 0758 0． 0955 0． 0671 0． 0572 0． 0494 0． 1714 0． 0999 0． 1012 41． 13
7 0． 0335 0． 0264 0． 0177 0． 0062 0． 0202 0． 0189 0． 0169 0． 0371 0． 0093 0． 0068 0． 0081 57． 86
8 0． 0507 0． 0452 0． 0198 0． 0120 0． 0274 0． 0341 0． 0300 0． 0419 0． 0070 0． 0045 0． 0102 63． 00
9 0． 0522 0． 0551 0． 0300 0． 0244 0． 0327 0． 0361 0． 0485 0． 0485 0． 0237 0． 0125 0． 0157 43． 11
10 0． 1859 0． 2199 0． 2842 0． 3793 0． 2627 0． 2574 0． 2514 0． 1983 0． 2100 0． 1672 0． 2844 24． 17
* 标记为蛇葡萄素峰面积百分含量最大的 3 个值
表 5 大叶蛇葡萄总黄酮提取物 11 批样相似度结果
P /S S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 对照指纹
S1 1． 000
S2 0． 910 1． 000
S3 0． 784 0． 876 1． 000
S4 0． 741 0． 885 0． 986 1． 000
S5 0． 817 0． 912 0． 995 0． 980 1． 000
S6 0． 897 0． 979 0． 950 0． 952 0． 969 1． 000
S7 0． 885 0． 969 0． 960 0． 963 0． 973 0． 997 1． 000
S8 0． 993 0． 935 0． 781 0． 754 0． 819 0． 913 0． 898 1． 000
S9 0． 616 0． 651 0． 907 0． 844 0． 892 0． 761 0． 774 0． 579 1． 000
S10 0． 541 0． 514 0． 839 0． 761 0． 803 0． 654 0． 677 0． 486 0． 966 1． 000
S11 0． 758 0． 809 0． 986 0． 950 0． 976 0． 903 0． 913 0． 741 0． 958 0． 911 1． 000
对照指纹 0． 822 0． 868 0． 993 0． 960 0． 990 0． 943 0． 951 0． 809 0． 927 0． 868 0． 993 1． 000
参考文献:
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722．
［2］ 张秀桥，沈 伟，陈树和，等．大叶蛇葡萄化学成分的研究［J］．中草
药，2008，39(8) :1135．
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降压作用的实验研究［J］．中国医院药学杂志，2008，28(24) :2095．
［4］ 陈梅玲，陈夏静，张秀桥，等． 大叶蛇葡萄乙醇提取物对 2215 细胞
HBsAg、HBeAg表达抑制作用的实验研究［J］． 中国中医药科技，
2012，19(4) :329．
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