全 文 ：收稿日期:2009-10-20; 修订日期:2010-05-14
基金项目:教育部春晖计划项目(No． Z2008 － 1 － 75014) ;
宁夏回族自治区自然科学基金(No． NZ0892)
作者简介:王基云(1985-) ，男(汉族) ，山东烟台人，现为宁夏医科大学在
读硕士研究生，学士学位，主要从事天然产物化学及中药药理学研究工
作．
* 通讯作者简介:王 妍(1958-) ，女(汉族) ，陕西西安人，现任宁夏医科
大学基础医学院教授，硕士研究生导师，学士学位，主要从事天然产物化
学研究工作．
正交实验法优选沙枣花总黄酮提取工艺及
沙枣花醇提物体外抗氧化活性的研究
王基云1，陆钊罡1，王 丹2，肖 旭1，张振华1，姚 遥1，3，王 锐1，王 妍1*
(1．宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004;
2．宁夏回族自治区第三人民医院，宁夏 银川 750000;
3．宁夏医科大学医学科学技术研究中心，宁夏 银川 750004)
摘要:目的 研究提取沙枣花(elaeagnus angustifolia blossoms，EAB )中总黄酮的最佳工艺条件，并观察了沙枣花醇提物
(the alcohol extracts of elaeagnus angustifolia blossoms，AE － EAB )清除氧自由基的作用。方法 以芦丁为对照品，NaNO2 －
Al(NO3)3 － NaOH显色体系作为显色剂，采用正交实验方法对沙枣花总黄酮提取方法进行了系统研究。结果 最佳提取
工艺为 20 倍量 70%乙醇回流 3 次，1 h /次。AE － EAB对氧自由基的清除作用随着浓度的升高而增强。结论 EAB总黄
酮的最佳提取工艺为 A2B2C1D3。AE － EAB对氧自由基有清除作用．
关键词:沙枣花; 总黄酮; 紫外分光光度法; 正交实验; 氧自由基
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 030
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2010)10-2487-03
Optimization Extraction Technology of Total Flavonoids in Elaeagnus an gustifolia
Blossms by Orthogonal Test and Antioxidant Activity of the Alcohol Extrcact in Vitro
WANG Ji-yun1，LU Zhao-gang1，WANG Dan2，XIAO Xu1，ZHANG Zhen-hua1，YAO Yao1，3，WANG Rui1，WANG
Yan1*
(1． Chemistry Staff Room of Foundation Institute of Ningxia Medical University，YinChuan 750004，China;
2． Medical Science and Technology Research Center of Ningxia Medical University ，Yinchuan 750004，China)
Abstract:Objective To study the optimal extraction technology of total flavonoids in Elaeagnus angustifolia blossoms(EAB) ，
and the free radicals scavenging effect of the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms(AE － EAB )． Methods Using
Rutin as the evaluating criteria and NaNO2 － Al(NO3)3 － NaOH as chromogenic agent，the extraction condition was studied by
orthogonal test． Results The optimal technological conditions were attained by the orthogonal experiment as follows:extraction
with70% ethanol，ethanol volume 20 ml for 1 g EAB every time，and extracting for 3 times (40 min for each time)． The scaven-
ging effect on oxygen free radical was proportional to the concentration of AE － EAB． Conclusion The optimum extraction technol-
ogy is A2B2C1D3 ． AE － EAB has scavenging effect on oxygen free radical ．
Key words:Elaeagnus an gustifolia L ．; Total flavonoid; UV; Orthogonal design
沙枣花为胡颓子科植物沙枣 Elaeagnusan － gustifolia L ． 的
花，主产于西北地区，在宁夏地区资源非常丰富。据《中药大辞
典》记载，沙枣花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量挥发油 ，
具有止咳平喘的功能 ，可用于治疗慢性气管炎［1］。目前对沙枣
花研究较多的是其挥发油成分［2］，但也有人初步研究了青海省
沙枣花黄酮类物质的提取方法［3］，已有人利用沙枣花提取液中
的功能成分黄酮类化合物对羟基自由基进行了清除试验研究，发
现沙枣花中的黄酮类化合物对羟基自由基有着较好的清除效
率［4］，本实验观察了 AE － EAB对氧自由基的清除作用，发现 AE
－ EAB对氧自由基有清除作用，并随着浓度的升高而增强。本
文以提取物中总黄酮含量为指标，采用正交实验设计和紫外分光
光度法对沙枣花中总黄酮的提取条件及含量测定进行了系统的
研究，为进一步开发利用沙枣花及沙枣资源提供科学依据。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 旋转蒸发仪(上海亚荣) ;SHB － III 型循环式多用真
空泵(郑州长城科工贸有限公司) ;KQ － 3200 DE 数控超声波清
洗器(昆山市超声仪器有限公司) ;Mili － Q 超纯水仪(法国) ;电
子天平(梅特勒 －托利多仪器有限公司) ;7225N 分光光度计(北
京瑞利分析仪器公司)。
1． 2 药材与试剂 沙枣花采自宁夏医学院旁沙造林，经宁夏区药
品检验所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树
Elaeagnus angustifolia L．的新鲜花序。水为超纯水，其它试剂均
为分析纯。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号:
100080)。
2 方法
2． 1 分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量［5］
2． 1． 1 对照品溶液的制备 精密称取在 120℃干燥至恒重的芦
丁对照品 50 mg，置于 25 ml 量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL ． 21 NO． 10 时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期
使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取 10 ml，置 100 ml
量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每 1 ml中含无水芦丁 0． 2 mg)。
2． 1． 2 标准曲线的制备 精密吸取标准溶液 1，2，3，4，5，6 ml 置
25 ml 量瓶中，各加亚硝酸钠溶液 1． 00 ml，混匀，放置显色 6
min，加 10%硝酸铝溶液 1 ml，摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液
10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，照
紫外 －可见分光光度法在 500 nm 波长处测定吸光度，以吸光度
为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程 Y =
10． 316X － 0． 002 6，相关系数 r = 0． 999 2，线性关系良好。见
表 1，图 1。
表 1 标准曲线测定数据
芦丁浓度 C /mg·ml －1 吸收度 A
0． 008 3 0． 084
0． 016 5 0． 172
0． 024 5 0． 242
0． 033 1 0． 341
0． 041 3 0． 421
0． 049 6 0． 512
图 1 芦丁浓度 －吸光度标准曲线
2． 1． 3 供试品溶液制备 取本品粗粉 1 g，精密称定，置索氏提取
器中，加石油醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。
再加甲醇 90 ml，加热回流至提取液无色，转移至 100 ml量瓶中，
用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。
精密量取 10 ml，置 100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。紧密量取
3 ml，置 25 ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝
酸钠”起依法测定吸光度。
2． 1． 4 稳定性实验 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 3 ml
置 25 ml容量瓶，分别按照“2． 1． 2”项中“加亚硝酸钠溶液 1． 00
ml”起，至“加氢氧化钠试液 10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置”操
作，用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白，分别在 2，5，15，
30，45，60 min 测定吸收度，结果表明，对照品吸收度 RSD =
0． 764 (n = 6) ，样品吸收度 RSD = 4． 556，说明稳定性较好。结果
见表 2。
表 2 稳定性实验结果
时间 t /min 对照品吸收度 A 供试品吸收度 A
2 0． 242 0． 011
5 0． 242 0． 011
15 0． 240 0． 012
30 0． 241 0． 011
45 0． 238 0． 011
60 0． 238 0． 012
RSD(%) 0． 764 4． 556
2． 1． 5 精密度实验 精密吸取同一份对照品和供试品溶液各 5
份，每份 3 ml置 25 ml 容量瓶，按照“2． 1． 2 项中“加亚硝酸钠溶
液 1． 00 ml”起，至“加氢氧化钠试液 10 ml，再加水至刻度，摇匀，
放置”操作，用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白，测定吸收
度，结果表明，对照品吸收度 RSD = 0． 185% (n = 5) ，样品吸收度
RSD = 4． 141% (n = 5) ，说明精密度较好。数据见表 3。
2． 1． 6 重复性实验 精密称定同一批沙枣花粉末 5 份各 1． 0 g，
按照“供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液，测定吸收度，结
果表明，RSD = 4． 214，说明重复性较好。结果见表 4。
表 3 精密度实验结果
样品编号 对照品 A 供试品 A
1 0． 242 0． 011
2 0． 242 0． 011
3 0． 241 0． 011
4 0． 242 0． 010
5 0． 242 0． 011
RSD% 0． 185 4． 141
表 4 重复性实验结果
样品编号 吸收度 A 总黄酮含量(%) RSD(%)
1 0． 010 1． 017 8
2 0． 011 1． 098 6
3 0． 010 1． 017 8 4． 214
4 0． 011 1． 098 6
5 0． 010 1． 017 8
珋x 0． 011 6 1． 0501
2． 1． 7 加样回收率实验 取已知总黄酮含量的沙枣花粉末(含总
黄酮 13． 41% )3 份，每份 1 g，精密称定，然后照“供试品溶液的
制备”项下进行制备，制备后各取 3 ml，同时分别加入已知浓度
的芦丁标准液 1． 0，2． 0，3． 0 ml，依照上述样品测定的方法测定，
求出回收率结果，结果表明，3 次测定的平均回收率为 105． 0%，
(RSD = 0． 525%，n = 3)。说明该测定方法测得的结果准确。结
果见表 5。
表 5 回收率实验结果
次数
沙枣花中
的量 m /mg
芦丁加入
量 m /mg
理论值
m /mg
测量值
m /mg
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
1 0． 2 134． 3 140． 2 104． 4
2 134． 1 0． 4 134． 5 141． 2 105． 0 105． 0 0． 525
3 0． 6 134． 6 142． 0 105． 5
2． 2 总黄酮提取工艺研究
2． 2． 1 乙醇超声提取法 称取沙枣花粉末约 1 g，加 100 ml 95%
乙醇，超声波提 1 h，抽滤。滤渣再加 100 ml 95%乙醇，超声波提
取 2． 5 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩 100 ml，
精密量取 10 ml，至 100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取
3 ml，至 25 ml量瓶中，备用。照标准曲线制备项下的方法，自“加
亚硝酸钠”起依法测定吸光度。
2． 2． 2 乙醇回流提取法 称取沙枣花花 1 g，加 95%乙醇 100 ml，
煮沸 1 h，过滤。药渣再加 95%乙醇 100 ml，煮沸 1 h，过滤。合并
2 次滤液，减压浓缩至 100 ml，精密量取 10 ml，至 100 ml量瓶中，
加水至刻度，摇匀。精密量取 3 ml，置 25 ml 量瓶中，备用。照
“2． 1． 2”标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定
吸光度。评价二者效果法总黄酮的含量。结果见表 6。
表 6 提取方法考察结果 %
提取方法 沙枣花花总黄酮含量
超声提取 1． 245 6
回流提取 0． 723 5
2． 2． 3 正交设计实验
供试品制备:称取干燥恒重的沙枣花粉末 10 g，共 9 份按照
L9(3
4)正交设计实验表确定的条件(见表 7)以加乙醇量、乙醇浓
度、提取时间、提取次数 4 因素进行超声提取，提取液过滤浓缩
后，定容在 100 ml 量瓶中，取 10 ml 定容置 100 ml 容量瓶中，摇
匀，作为供试品溶液。
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时珍国医国药 2010 年第 21 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL． 21 NO． 10
供试品溶液中总黄酮的含量测定:精密吸取正交设计中每份
供试品提取液 3 ml置 25 ml容量瓶中，参照“2． 1． 2”标准曲线制
备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起测定吸光度。结果见表 8。
运用统计软件 DPS v7． 05 对数据进行分析，结果可知，因素
B差异有显著性(P ＜ 0． 05) ，因素 A、因素 C、因素 D差异无显著
性;各因素对总黄酮提取的影响大小分别为 B ＞ A ＞ D ＞ C，即乙
醇浓度 ＞料液比 ＞提取次数 ＞提取时间;提取沙枣花中总黄酮
的最佳提取条件为 A2B2C1D3，即 70%的乙醇，料液比 1∶ 20，提
取 3 次，1 h /次。
验证实验表明，此方法都有较好的重复性，方法可行 L9(3
4)
正交设计实验，沙枣花总黄酮提取的最佳工艺为 A2B2C1D3，即
20 倍量 70%乙醇，回流 1 h，回流 3 次。
表 7 L9(34)因素水平
水平
A
加乙醇量 /倍
B
乙醇浓度(%)
C
提取时间 t /h
D
提取次数
1 10 50 1 1
2 20 70 1． 5 2
3 30 90 2 3
表 8 L9(34)正交设计实验结果
实验号 A B C D 总黄酮含量(%)
1 1 1 1 1 0． 731 7
2 1 2 2 2 0． 941 9
3 1 3 3 3 0． 941 9
4 2 1 2 3 1． 015
5 2 2 3 1 1． 354
6 2 3 1 2 1． 081
7 3 1 3 2 0． 74
8 3 2 1 3 1． 354
9 3 3 2 1 0． 95
总Ⅰ 0． 871 9 0． 828 83 1． 055 7 1． 011 93
黄Ⅱ 1． 149 93 1． 216 6 0． 968 83 0． 921 07
酮Ⅲ 1． 014 63 0． 991 07 1． 011 93 1． 103 47
R 0． 278 03 0． 387 73 0． 086 87 0． 182 40
表 9 总黄酮含量方差分析结果
方差来源 SS ν MS F p
A 0． 1161 2 0． 0580 8． 9986 ＞ 0． 05
B 0． 2275 2 0． 1137 10． 3198 ＜ 0． 05
C 0． 0112 2 0． 0056 20． 2256
D 0． 0501 2 0． 0250 4． 4472 ＞ 0． 05
误差 0． 0112 2 0． 0056
总和 0． 4049
验证实验:按优选的最佳工艺条件制备 3 份样品。结果见
表 10。
表 10 验证实验
样品 百分含量(%) 平均值 RSD(%)
1 1． 312 4
2 1． 358 6 1． 302 2 4． 77
3 1． 235 6
2． 3 沙枣花乙醇提取对自由基的清除作用［6］
量取 pH值为 8． 2 的 Tris － HCl 缓冲液 5 ml，分别加入原始
浓度为 0． 5，1，2，4，6 mg /ml的沙枣花乙醇提取物溶液 0． 3 ml，用
双蒸水补充至 9． 7 ml，置于 10 ml 容量瓶中，混匀，立即加入 3
mmol /L的邻苯三酚 0． 3 ml，迅速摇匀后倒入比色皿中，用 10
mmol /L的 HCl为空白液，在 325nm 波长处，每隔 30 s 测吸光度
值 1 次，以吸光度值 A对反应时间 t作线性关系图，斜率即为 V1，
代入式(1) ，计算出抗氧化剂对超氧阴离子的清除率(Y)。
Y(%) =(1 － V1 /V0)× 100
V0 为加入空白溶剂 70%乙醇溶液 0． 3 ml时的斜率。
图 2 沙枣花乙醇提取物清除氧自由基标准曲线
从图 2 中可以看出，沙枣花醇提物对氧自由基有清除作用，
并随着浓度的升高而增强，但是清除率较低，可能由于其中的抗
氧化物质在总提取物中占取的比例较低。但具体是哪类物质起
抗氧化作用，对其中抗氧化物质的筛选有待于进一步的分离得到
较纯的组分后再做研究。
3 结论
通过 L9(3
4)正交设计实验，确定了沙枣花总黄酮提取的最
佳工艺条件为 A2B2C1D3，即 20 倍量 70%乙醇，回流 1h，回流 3
次，并且发现沙枣花乙醇提取物对超氧阴离子具有一定的清除作
用。为沙枣花资源的综合利用开发提取理论基础。
参考文献:
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版社:2006:1630．
［2］ 王 妍，李 玲，连松刚，等．顶空 －固相微萃取气质联用分析宁夏
沙枣花中香气成分［J］．中草药，2007，38(11) :1627．
［3］ 石玉平，王永宁，郭 珍．沙枣花中黄酮类化合物的提取［J］． 南京
林业大学学报(自然科学版) ，2005，29(2) :106．
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清除研究［J］．青海医学院学报，2003，24(4) :281．
［5］ 国家药典委员会．中国药典［S］．北京:化学工业出版社，2005．
［6］ 郭雪峰，岳永德，汤 锋，等．用清除超氧阴离子自由基法评价竹叶
提取物抗氧化能力［J］．光谱学与光谱分析，2008，28(8) :1823．
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