全 文 ：·基础研究·
　　
　　浙江省中医药管理局基金项目　课题编号 2004C063
毛兰素对胃癌细胞 SGC-7901端粒酶活性的影响
洪　卫1　郭　勇2　马胜林1　冯建国3　杜灵彬3　凌雨田3　牟瀚舟3　张沂平1
(1.浙江省肿瘤医院 ,浙江 杭州 310022;2.浙江省中医院 ,浙江 杭州 310006;
3.浙江省肿瘤研究所 , 浙江 杭州 310022)
　　【摘　要】　目的　探讨毛兰素对胃癌细胞端粒酶活性的影响。方法　MTT法检测毛兰素对人胃癌细胞 SGC-7901 的增
殖抑制作用 , Annexin Ⅴ/ PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率 , TRAP实时荧光定量 PCR检测端粒酶活性。结果　毛兰素
能抑制胃癌细胞 SGC-7901增值 , 48小时 IC50值为 0.056μg/ml;毛兰素抑制胃腺癌 SGC-790 细胞端粒酶活性早于诱导凋亡 ,
且都表现为时间和浓度依赖性。结论　毛兰素能诱导胃癌细胞 SGC-7901 凋亡 ,可能与其对端粒酶活性的抑制有关。
【关键词】　毛兰素　胃癌细胞 SGC-7901　细胞凋亡　端粒酶
　　毛兰素是从中药鼓槌石斛中分离得到的联苄
类化合物 ,近年研究发现该成分有抗肿瘤血管生成
的作用[ 1] 。动物实验显示 ,该药能抑制小鼠肝癌和
艾氏腹水癌的生长[ 2] 。作者已有研究提示 ,毛兰素
能诱导胃癌细胞 SGC-7901 凋亡 ,其机制可能与细
胞周期阻滞于 S 期有关[ 3] ,进一步研究发现 ,可能
还与对端粒酶活性的抑制有关 ,报道如下。
1　材料与方法
1.1 　药品与试剂　四甲基偶氮唑蓝和二甲基亚砜
(DMSO)(美国 Sigma公司);RPMI 1640培养基(Gibi-
co公司);Annexin-Ⅴ/PI 试剂盒(美国 BD公司);
端粒酶活性 TRAP 实时荧光定量检测试剂盒(美国
GENMED SCIENTIFICS 公司产品)。毛兰素由浙江
天皇公司杨兵勋博士惠赠 ,纯度为 98%,并已通过
鉴定 。
1.2 　实验材料和主要仪器　细胞培养瓶及 96孔
培养板(美国 BD公司);超净工作台(上海力申科学
仪器有限公司);5%CO2培养箱(德国 Heraeus 产
品);全自动酶标仪(上海智华医学精密仪器有限公
司);流式细胞仪(美国 BD公司)采用 MoDiFit-2.0
软件;ABI 7700荧光定量PCR仪 。
1.3 　细胞株及培养　SGC-7901细胞来自浙江省
肿瘤研究所细胞库 ,用无支原体含 20%灭活小牛血
清的 RPMI-1640 培养液在 5%CO2、37℃饱和湿度
的细胞培养箱中培养 ,细胞贴壁生长 ,用 0.25%的
胰蛋白酶和 0.02% EDTA(1:1)消化传代并制备细
胞悬液 ,取对数生长期的细胞用于研究 。
1.4 　MTT法检测毛兰素对胃癌细胞 SGC-7901的
48小时 IC50　取对数生长期细胞接种于 96孔培养
板内 ,每孔 3×103 个细胞 ,8复孔 ,加入不同浓度的
毛兰素 , 总体积 200μl ,培养 48 小时后 , 每孔加入
1mg/mlMTT 工作液 50μl , 37℃放置 4 小时 , 离心
2000r/分钟×8分钟 ,弃上清 ,每孔加入 150μlDMSO ,
震荡 10 分钟溶解结晶 ,全自动酶标仪检测 450nm
波长 、参比波长 630nm处的各孔吸光度(OD值),计
算出 48小时半数抑制浓度 IC50 。
1.5 　Annexin-Ⅴ/PI双染法流式细胞仪检测细胞
凋亡率　用冷 PBS液洗 2 次 ,然后用 1×缓冲液悬
浮细胞 ,使细胞浓度为 1×106 个/ml;移取 100μl细
胞到 5ml 的培养管;加入 5μlAnnexin V -FITC 和
5μlPI;轻轻漩涡摇匀细胞 ,室温 25℃避光孵育 15分
钟;每管加入400μl的1×缓冲液 ,1小时内完成分析。
1.6 　TRAP 实时荧光定量 PCR检测端粒酶活性　
移取 15μlGENMED反应液到 0.5mlPCR管 ,加入 1μl
待测的细胞 、2.5μlGENMED染色液和 6.5μlGENMED
补充液 ,放进4℃微型台式离心机瞬时离心 5秒 ,离
心后即刻放进荧光定量 PCR仪 。荧光定量 PCR仪
反应程序为:95℃, 5 分钟 , 1 个循环;95℃, 30 秒 ,
60℃退火 ,35个循环;72℃, 30秒。采集数据 ,进行
溶解曲线分析。以未经毛兰素作用的 SGC -7901
细胞为阳性对照(即标准品),用系列倍比稀释(1:
10)进行实时PCR ,以标准品浓度的对数为横坐标 ,
其 Ct 值为纵坐标 , 则形成标准曲线 。Ct(cycle
threshold)值为循环阈值所经历的循环数 。
1.7 　统计学处理　本实验中定量数据均采用( x±s)
表示 ,抑制率与浓度的关系分析采用 Pearson相关分
析 。组间分析采用 q检验。分析软件采用SPSS 13.0。
·181·浙江实用医学 2009年 6月第 14卷第 3期 Zhejiang Practical Medicine June , 2009 , Vol.14 ,No.3
2　结　果
2.1 　MTT法检测毛兰素对胃癌细胞 SGC-7091的
抑制率　毛兰素对胃癌细胞 SGC-7091 的生长具
有明显的抑制作用 , 且有浓度依赖性 , 在 0 ～
0.125μg/ml 的范围内 , 与浓度正相关 , 相关系数
0.905 , p=0.005 ,见表 1。LOGIT 法计算得 48小时
IC50为 0.056μg/ml。
表 1　不同浓度毛兰素作用胃癌细胞 SGC-7091
48 小时后的抑制作用( x±s)
毛兰素浓度(μg/ml) OD值 抑制率(%)
0 1.14±0.08 0
0.0039 1.03±0.05 9.8
0.0078 1.01±0.07 11.3
0.0156 0.95±0.05 17.0
0.0312 0.72±0.08 36.8
0.0625 0.43±0.05 62.6
0.125 0.41±0.07 64.5
2.2 　Annexin-Ⅴ/PI 双染法检测细胞凋亡率　分
别以低浓度(0.03μg/ml)和高浓度(0.06μg/ml)毛兰
素作用于胃癌 SGC-7901细胞 ,观察不同时间点细
胞凋亡率的变化 ,每组每个时间点各 3瓶细胞。结
果显示低浓度组在8 ～ 72小时内呈时间-效应依赖
性(P<0.05)。而在高浓度组 ,作用 24小时凋亡率
已经进入平台期 。见图 1。
图 1 　时间—效应依赖性曲线
2.3 　毛兰素对胃癌细胞 SGC-7091端粒酶活性的
作用　分别以毛兰素低浓度(0.03μg/ml)和高浓度
(0.06μg/ml)作用于胃癌 SGC-7901细胞 ,观察对胃
癌细胞 SGC-7901 端粒酶活性的影响 。以各时间
点未经药物处理的对照组细胞端粒酶活性平均拷
贝数为100%。每组每个时间点各 3瓶细胞 。端粒
酶活性抑制率=[ 1-(药物处理组端粒酶活性拷贝
数)/(对照组端粒酶活性拷贝数)] ×100%。结果
显示 ,毛兰素各浓度组均可见抑制端粒酶活性。高
低浓度毛兰素组间在不同时间作比较 ,均 P <0.01。
见表 2。
表 2　TRAP实时定量 PCR检测毛兰素作用
不同时间后各组端粒酶活性抑制率(%)
组　　别 时　间　点
8小时 24小时 48小时
对　　照　　组 0 0 0
低浓度毛兰素组 18.7±2.1 39±6.6 58±7.5
高浓度毛兰素组 36.3±4.7＊＊ 62.3±6.5＊＊ 80.3±8.2＊＊
　　与低浓度毛兰素组比较＊＊P<0.01
3　讨　论
恶性肿瘤细胞具有无限制性增殖即永生化的
特点 ,这是区别于正常细胞最显著的生物学特征。
而端粒酶的激活与细胞的永生化有明显的相关性 。
目前有关中药中的有效成分对端粒酶活性的
影响成为研究热点之一。槲寄生中凝集素[ 4] 、姜黄
素[ 5] 、苦参碱[ 6]均被发现能诱导肿瘤细胞凋亡且与
抑制端粒酶活性有关 。
本研究表明 ,毛兰素能明显抑制胃癌细胞 SGC
-7901 增殖 , 表现为浓度依赖性 , 48 小时 IC50为
0.056μg/ml ,研究发现 ,毛兰素可以快速抑制胃癌细
胞 SGC-7901的端粒酶活性 , 8小时就可见端粒酶
活性抑制 ,48小时就可以抑制端粒酶活性的 80%,
初步观察表明对端粒酶活性的抑制与药物浓度相
关 。由于实验研究在 24小时这个时间点才见到毛
兰素诱导的胃癌细胞 SGC-7901 细胞凋亡明显增
加 ,因此 ,推断这种毛兰素对胃癌细胞 SGC -7901
端粒酶活性的抑制 ,可能参与了毛兰素诱导胃癌细
胞 SGC-7901凋亡的作用机制 ,但尚需进一步研究
来证实 。
由于细胞凋亡是一个多系统 、多阶段参与的复
杂网络过程 ,毛兰素诱导胃癌细胞 SGC-7901凋亡
的确切机制有待进一步研究。
参考文献
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·182· 浙江实用医学 2009年 6月第 14卷第 3期 Zhejiang Practical Medicine June , 2009, Vol.14 ,No.3