全 文 ：收稿日期:2002-03-18
作者简介:刘晓阳(1968-), 男(汉族), 辽宁本溪人 , 本钢总医院药学部主管药师 , 硕士 , 主要从事心血管药理学研
究 , Tel:(0414)2215177。
文章编号:1006-2858(2002)05-0348-04
白花前胡甲素对急性缺血再灌注大鼠心肌 Fas蛋白
表达及血清 IL-6水平的影响
刘晓阳1 , 常天辉2
(1.本钢总医院药学部 , 辽宁 本溪　117000;　2.中国医科大学基础医学院 ,辽宁 沈阳　110002)
摘要:目的 探讨白花前胡甲素(Pd-Ia)抗缺血再灌注损伤的机制 ,为寻找高效 、低毒及安全的防治缺
血再灌注损伤的药物提供理论基础。方法采用放射免疫分析测定血清白细胞介素 6(IL-6)水平, 并
用免疫组化联合计算机图像分析系统检测心肌中 Fas 蛋白表达。结果 Pd-Ia 干预组 IL-6 水平及 Fas
蛋白表达指数分别由对照组的(152.88±15.25)pg/ mL及(6.71±1.47)%最大降至(116.13±10.45)pg/
mL及(3.39±0.92)%(P<0.01),其作用强度与硝苯地平相近。结论 Pd-Ia明显抑制缺血再灌注大鼠
血清 IL-6 水平及心肌Fas蛋白表达, 提示Pd-Ia可能通过钙拮抗作用或钾通道开放作用抑制 NF-κB 途
径实现再灌注性损伤的防治。
关键词:白花前胡甲素;再灌注损伤;白细胞介素 6;Fas 蛋白
中图分类号:R 969　　　文献标识码:A
　　缺血性心脏病将损害受累心肌细胞的活性而
影响其功能。最根本的治疗措施是尽快恢复缺血
心肌的血液供应 。然而 ,重建血液供应又将在一
定程度上引起心肌再灌注性损伤(ischemic reper-
fusion injury , IRI)。目前普遍认为 IRI的主要介质
为中性粒细胞[ 1] ,而白细胞介素 6(interleukin-6 ,
IL-6)在中性粒细胞介导的 IRI中起着十分重要的
调节和修饰作用[ 2 ,3] 。 IRI 中受损心肌细胞除发
生坏死外 ,尚有部分心肌细胞呈现凋亡(apopto-
sis)[ 4] 。细胞凋亡的发生受多种蛋白基因表达的
调控 ,其中凋亡刺激蛋白 Fas被认为与细胞凋亡
关系密切[ 5 ,6] 。已研究表明 ,白花前胡甲素(Pd-
Ia)具有抑制 Ca2+内流 、促进 K+通道开放等活性
及抗急性心肌 IRI作用 ,故推测 Pd-Ia对缺血再灌
注心肌 Fas蛋白的表达及血清 IL-6水平产生有益
影响。然而 ,迄今尚无类似的研究报道。本研究
中采用免疫组化技术联合计算机图像分析和放射
免疫方法 ,分别对大鼠急性缺血再灌注心肌 Fas
蛋白表达及血清中 IL-6水平进行检测 ,探讨 Pd-Ia
抗 IRI的作用机制 。
1　材料与方法
1.1　药品与试剂
白花前胡甲素(Pd-Ia):由本室从中药白花前
胡干燥根中提取分离;硝苯地平(nifedipine):北京
双桥制药厂 ,批号 20000613;125I-IL-6放免试剂盒:
北京 301放免研究中心标记;兔抗大鼠 Fas蛋白
抗体:Santa Cruz生物工程公司生产;即用型 SABC
免疫组化试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司
生产 。
1.2　仪器
γ计数仪(KONTRON GAMMA matric Ⅱ);高速
冰冻离心机(ST—21/SORVALL , USA);多导生理
记录仪(RM —6000 ,日本光电);冰冻切片机(Leica
CM—1800);万能显微镜(OLYMPUS BX60);图像
分析系统(MetaMorph/cool smapfx/AX70 UIC/ROP-
ER/OLYMPUS , JAPAN)等。
1.3　实验动物
雄性Wistar大鼠 31只 ,体重(278±18)g ,中国
医科大学实验动物部提供 。
1.4　动物模型
急性心肌缺血再灌注(myocardial ischemic
reperfusion , MIR)模型参照文献方法并略加改
进[ 7] :用 5.05 mol/L 乌拉坦和 0.16 mol/L α-氯醛
糖混合溶液麻醉(0.14 mL/100 g , ip),在人工呼吸
下行左开胸术 ,于左冠状动脉前降支(left anterior
descending coronary artery , LAD)上 1/3处穿线 , 供
诱发左室心肌急性缺血用 。
第 19 卷 第 5 期
2 0 0 2 年 9 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.19 　No.5
Sep.2002 p.348
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2002.05.011
1.5　实验分组
将大鼠按体重均衡性原则随机分成 7组 ,即:
(1)伪手术组(sham):仅穿线而未结扎 ,分别
经十二指肠和颈外静脉给予蒸馏水(10 mL/kg)及
生理盐水(NS ,1 mL/kg), n =5;
(2)手术对照组(oper):于结扎前 30 min经十
二指肠给予蒸馏水(10 mL/kg),结扎 LAD , 30 min
后松开结扎线并静注 NS(1.0 mL/kg),并连续灌
注120 min , n=5;
(3)Pd-Ia低剂量组(Pd1):结扎 LAD 30 min后
再灌注 ,同时静注 Pd-Ia 0.5 mg/kg , 并连续灌注
120 min , n=4;
(4)Pd-Ia中剂量组(Pd2):Pd-Ia 1.0 mg/kg ,其
余同(3), n=4;
(5)Pd-Ia高剂量组(Pd3):Pd-Ia 2.0 mg/kg ,其
余同(3), n=4;
(6)Pd-Ia 溶 剂 对 照 组 (sol):PEG 400
(1.0 mL/kg),其余同(3), n =4;
(7)硝苯地平组(nif):硝苯地平(5 mg/kg),其
余同(3), n=5。
1.6　标本采集及冰冻切片的制备
再灌注后 120 min ,立即经右心室穿刺取血(2
mL),静置分离血清并置-20℃下保存 ,以备 IL-6
的检测 。然后迅速处死大鼠并摘取心脏 ,剪取左
室缺血心肌 ,用冰冷 NS冲洗残血 ,经液氮速冻后
置-70℃下保存。冰冻心肌组织在冰冻切片机上
每隔 1 mm 连续切取数张 7 μm 厚的切片 ,供 Fas
蛋白检测用。
1.7　检测指标
1.7.1　血清 IL-6的测定
按 IL-6试剂盒说明的程序操作 ,利用γ计数
仪测定各标准品及样本的 cpm数 ,并按自动γ计
数仪预先编制的程序直接测出样品浓度 。
1.7.2　心肌组织 Fas蛋白的检测
每个标本取不同部位的切片各 3张 ,按 SABC
(StreptAvidin- Biotin-enzyme Complex)法行免疫组
化 ,供图像分析用(胞膜或胞浆着棕黄或棕色者为
阳性表达)。
1.7.3　计算机图像分析
将SABC 法免疫组化染色切片于光镜下放大
100倍 ,通过图像分析仪和 MetaMorph image analy-
sis system系统软件对每张切片随机选择 10个视
野 ,测定阳性染色的平均光密度与阳性染色面积
百分比(指所选视野中阳性染色面积与总组织面
积的百分比),以计算蛋白阳性表达指数(positive
expressive index ,PEI),其中:PEI=平均光密度×阳
性染色面积百分比×100 。
1.8　统计学处理
所有数据以均值±标准差表示 ,利用 statisti-
cal analysis system(SAS)进行统计学分析 ,多组间
比较用单因素方差分析 ,两组间比较采用 Student
Newman-Keuls t检验 ,相关性采用简单线性相关
分析;当 P<0.05时认为有统计学意义 。
2　结果
2.1　Pd-Ia对 MIR大鼠心肌 Fas蛋白表达及血
清 IL-6水平的影响
见表 1 、图 1 、2。
Table 1　Effects of Pd-Ia on expression of apoptosis-related proteins and serum IL-6 in ischemic reperfused anesthetic open-
chest rats( x ±s)
Group Dose(g/kg) n PEI of Fas(%) IL-6(pg/mL)
Sham 　 - 4 1.88±0.49＊＊b 122.29±5.61＊a
Oper 　 - 5 6.96±2.39++ 151.53±17.70+
Sol 　 - 4 6.71±1.47++ 152.90±15.25+
Nif 0.005 5 3.58±0.55＊＊b 123.55±18.62＊a
Pd1 0.000 5 5 3.81±0.69＊＊a 128.45±18.37
Pd2 0.001 4 3.50±0.67＊＊b 119.66±15.72＊a
Pd3 0.002 4 3.39±0.92＊＊b 116.13±10.45＊a
　　+P<0.05 , ++P<0.01(vs sham);＊P<0.05 , ＊＊P<0.01(vs oper);aP<0.05 , bP<0.01(vs sol)
2.2　MIR大鼠心肌Fas蛋白与 IL-6水平的相关性
MIR大鼠心肌中 Fas蛋白表达与血清 IL-6水
平的相关性分析表明 ,血清 IL-6水平与心肌 Fas
蛋白的表达呈线性正相关 ,其 R2 为0.295 3(P<
0.05 ,见图 3)。
349第 5 期 刘晓阳等:白花前胡甲素对急性缺血再灌注大鼠心肌 Fas 蛋白表达及血清 IL-6 水平的影响　　　
Fig.1　Micrograph demonstration Fas protein immunohisto-
chemical staining in left ventricular myocardium
from a rat′s heart subjected to ischemia/ reperfusion
in operation-control group(original magnification×
200)
Fig.2　Micrograph demonstrating Fas protein immunohisto-
chemical staining in left ventricular myocardium
from a rat′s heart subjected to ischemia/ reperfusion
in BQ group(original magnification×200)
Fig.3　Correlativity between the expression of Fas protein
in myocardium and level of IL-6 in serum from is-
chemic reperfusion rats
3　讨论
作者研究证实了急性MIR引起大鼠血清 IL-6
的高表达。利用 IL-6单克隆抗体治疗可缓解 IRI
的发生[ 8] , 提示 IL-6 参与了 IRI 病理过程 。而
MIR能诱发氧自由基的大量生成和释放 ,氧自由
基能激活核转录因子(nuclear factor kappaB ,NF-
κB),NF-κB 以氧自由基为传递信使诱导 IL-6 生
成[ 9] ,故MIR可能经由 NF-κB 途径使 IL-6水平提
高。作者首次证明 Pd-Ia 可明显抑制MIR大鼠血
清中 IL-6的水平 ,且作用强度与硝苯地平相近。
已证明 Ca2+内流阻滞能缓解 MIR所引起的胞浆
Ca2+超载[ 10] ,维持细胞内外钙平衡及线粒体的稳
定性 ,进而防止活性氧自由基大量生成;而且钙拮
抗剂对机体氧化还原体系具有有益影响 ,具有抗
氧化活性[ 11] 。故推测 Pd-Ia阻滞 Ca2+内流 、抑制
NF-κB激活途径抑制MIR过程中 IL-6的水平[ 12] 。
但并不排除K+通道开放作用的参与 ,因为 Pd-Ia
具有促钾通道开放作用 ,而 ATP 敏感钾通道开放
剂也能缓解 MIR所致的细胞内钙超载[ 13] 。作者
证明MIR可使大鼠心肌细胞凋亡刺激蛋白Fas的
表达明显增加 ,说明 Fas蛋白可能在 MIR所致的
心肌细胞凋亡中起重要作用 ,本研究首次证明
Pd-Ia明显抑制 MIR 大鼠 Fas 蛋白的表达 , 提示
Pd-Ia可能经抑制 Fas-Fas配体途径而对心肌细胞
凋亡产生有益影响[ 14] ;其在调控 Fas蛋白表达方
面与硝苯地平相近 。相关分析表明 MIR大鼠心
肌Fas蛋白的表达与血清中 IL-6水平正相关 ,提
示Pd-Ia对 MIR心肌中 Fas表达抑制可能与其对
IL-6抑制而使中性粒细胞等炎性细胞浸润减少 、
MIR刺激程度减轻等因素有关 。故推测 Pd-Ia 对
Fas蛋白的调控可能与钙内流拮抗或 K+通道开
放等作用有关 ,实现对抗 IRI作用 。
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Effect of Pd-Ia on expression of myocardial Fas pro-
tein and serum IL-6 level of ischemic reperfusion rats
LIU Xiao-yang1 , CHANG Tian-hui2
(1.Department of Pharmacy , General Hospital , Benxi Iorn &Steel Co., Benxi　117000 , China;　2.College of
Basic Medicine China Medical University , Shenyang 　110002 , China)
Abstract:Objective To provide the theoretical basis for the research on and development of higher-efficancy , low-
er-toxicity and safe drugs which could prevent and treat ischemic reperfusion , the mechanism of Pd-Ia against is-
chemia/ reperfusion injury was investigated.Methods Serum IL-6 level was measured by the radio-immunization as-
say , and the expression of myocardial Fas protein was determined by immunohistochemo-assay.Results The level of
IL-6 and expression of Fas protein in Pd-Ia groups were from (152.88±15.25)pg/mL and (6.71±1.47)% in
control of(116.13±10.45)pg/mL and (3.39±0.92)%(P <0.01), and the activity was similar to that of ne-
fidipine.Conclusions Pd-Ia inhibited obviously the serum IL-6 level and expression of Fas protein in ischemic
reperfusion rats , suggesting that Pd-Ia could prevent and treat ischemic reperfusion injury by blocking the calcium
channel and/or opening the potassium channel and inhibiting the NF-κB pathway.
Key words:Pd-Ia;myocardial reperfusion injury;interleukin-6;Fas protein
351第 5 期 刘晓阳等:白花前胡甲素对急性缺血再灌注大鼠心肌 Fas 蛋白表达及血清 IL-6 水平的影响