全 文 ：《食品工业》2015 年第36卷第 3 期 1
刺山柑果实，采于新疆博乐市，干燥，用粉碎机
粉碎，过20目筛；芦丁（ＵＶ≥98%），上海金穗生物
科技有限公司；纤维素酶（Assay≥400 U/mg）。
1.2 方法
1.2.1 刺山柑黄酮提取液的制备
化学法[7]：称取刺山柑粉5.00 g，在250 mL烧瓶中
加95％乙醇水溶液50 mL，80 ℃恒温水浴回流浸提0.5
h，收集浸提液，滤渣再加入95％乙醇水溶液50 mL重
复浸提一次，合并2次的浸提液，过滤，蒸馏浓缩至
20 mL。
纤维素酶法：称取刺山柑粉5.00 g，放入250 mL
烧瓶中，加入0.05 g纤维素酶，加入50 mL，pH 4.8的
HAc-NaAc缓冲液，50 ℃水浴1.5 h，90 ℃水浴30 min
使酶灭活。加95％乙醇水溶液50 mL回流浸提，回收
浸提液，滤渣再加入95％乙醇水溶液50 mL重复浸
提一次，合并两次的浸提液，过滤，蒸馏浓缩至20
mL。
1.2.2 黄酮含量的测定
1) 芦丁标准曲线的绘制[8]
精确称取0.010 g芦丁标准品，用30%乙醇溶解，
定容至100 mL，制成0.1 mg/mL的芦丁标准液。分别
纤维素酶提取刺山柑黄酮及抗氧化活性的研究
王岩岩，李明，周伊玲，陆文源，吴光旭*
长江大学生命科学院（荆州 434100）
摘 要 对纤维素酶提取刺山柑黄酮的工艺条件进行研究, 结果表明, 最佳工艺条件为: 纤维素酶用量0.2%, 酶解
温度55 ℃, 酶解时间80 min。优化条件下, 纤维素酶提取刺山柑黄酮的得率升高到2.47%, 为醇提法提取黄酮得率的
2倍。通过测定羟基自由基的清除率研究两种方法刺山柑提取物的抗氧化活性, 表明, 酶法刺山柑黄酮提取物也有
较强的抗氧化能力。其中, 酶法提取的刺山柑黄酮质量浓度在1 mg/mL时, 羟基自由基清除率达到最高, 可以达到
59.62%。
关键词 纤维素酶; 黄酮; 刺山柑; 抗氧化
Study on Extraction of Flavonoids from Capparis spinosa L. and Antioxidation Using
Cellulose
Wang Yan-yan, Li Ming, Zhou Yi-ling, Lu Wen-yuan, Wu Guang-xu*
Life and Science College of Yangtze University (Jingzhou 434100)
Abstract The extraction conditions of fl avanoids from Capparis spinosa L. by cellulose were investigated. Based on single
factor experiment, the orthogonal experiments with enzyme concentration, temperature for enzymatic hydrolysis, hydrolysis
time was designed, the optimal conditions for the enzyme extract as follows: enzyme concentration was 0.2%, hydrolysis
temperature was 55 ℃ and hydrolysis time 80 min. Under the optimum conditions, the extraction rate of fl avanoids from
Capparis spinosa L. could reach 2.47% by cellulase, which is 2 times than that by using chemical method. The antioxidation
of the extractions were studied by determining clearance capacity of the antihydroxyl free radical. The result showed that the
concentration of the fl avanoids of Capparis spinosa L. extractions by cellulose was 1 mg/mL, the clearance capacity of
the antihydroxyl free radical is highest. It can achieve 59.62%.
Keywords cellulase; fl avanoids; Capparis spinosa L.; antioxidation
刺山柑（Capparis spinosa L.），又名槌果藤，
老鼠瓜，野西瓜，维吾尔族人称它为菠里克果，为白
菜花科山柑属植物[1]。刺山柑是一种生长在炎热干旱
气候条件下的半灌木，分布于热带与亚热带区。在我
国，主要分布在新疆，甘肃，西藏，内蒙的戈壁沙地
之中，常作为当地民族药物和维护生态平衡的植物[2]，
刺山柑的根、花、叶和果均能入药[3]。而在我国，刺
山柑果实和根具有祛风，散寒，除湿的作用，可以治
疗各种寒湿所致的瘫痪，肢体麻木，关节疼痛等疑难
杂症[4]。刺山柑果实的主要化学成分有黄酮类，具有
保护心血管系统以及抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化
自由基、抗炎、镇痛、保肝等多种生物活性 [5]。近年
来，纤维素酶逐渐应用于中草药有效成分提取，如马
田田等[6]将纤维素酶用于黄柏小檗碱提取的预处理，
小檗碱的收率可从0.87%提高到1.17%。研究将纤维素
酶应用于刺山柑黄酮的提取，采用正交试验对其提取
条件进行优化，并深入研究提取物的抗氧化性，为酶
法提取中药材提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
*通讯作者
工艺技术
《食品工业》2015 年第36卷第 3 期 2
取0.1 mg/mL芦丁标准液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0
mL置于6个50 mL容量瓶中，依次编号0~5；用30%乙
醇溶液补充至10 mL后，加入0.8 m的5%NaNO2摇匀，
静置6 min；再加入0.8 mL的10% Al(NO3)3摇匀，静置
6 min；加入 10 mL 1 mol/L NaOH 溶液，摇匀显色，
放置15 min后，以零号管为空白管，在波长510 nm处
测定各吸光度。根据所得数据，以芦丁浓度为横坐
标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并得出线性回
归方程：y=0.099 8x-0.004 9，R2=0.997 3。其中：x表
示芦丁质量浓度（10-4 mg/mL），y表示对应吸光度
（OD）。
2) 刺山柑黄酮含量的测定
将刺山柑黄酮提取液，用30%乙醇溶解，定容至
100 mL；取5 mL放入3支50 mL容量瓶中，用30%乙醇
补至10 mL，加入0.8 mL的5% NaNO2溶液摇匀，放置
6 min，加0.8 min后，在波长510 nm测定，将测定的
吸光度A代入芦丁标准曲线中，计算得总黄酮量提取
率。计算公式如式（1）~（3）。
样液中黄酮含量（mg/mL）=（A+0.004 9）×定
容体积 （1）
总黄酮含量（mg/mL）= 样液中黄酮含量×提取
液总体积/测定体积 （2）
黄酮提取率=（样液中黄酮含量/M）×100%
（3）
式中：M-称取的刺山柑粉末质量（g）；A-测定
的吸光度。
1.2.3 正交设计
根据单因素试验，选取对提取工艺有影响的主
要因素（酶浓度（E），酶解温度（T），酶解时间
（t）），按照4因素3水平进行L9(33)试验，各因素水
平见表1。
表1 因素水平表
水平 因素A酶浓度（E）/% B酶解温度（T）/ ℃ C酶解时间（t）/min
1 0.1 50 40
2 0.2 55 60
3 0.3 60 80
1.2.4 清除羟基自由基活性[9]
取10 mL具塞试管，按顺序加入5 mmol/L邻二氮菲
1.5 mL、0.5 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）3 mL、7.5 mmol/
L FeSO4 1 mL、粗黄酮样液3 mL、0.1% H2O2 1 mL，用
二次蒸馏水稀释到10 mL，然后于37 ℃恒温水浴锅保
温60 min，测A510。未损伤管即：不加H2O2及抗氧化药
物，标记为A510（未损伤）。损伤管即：只加H2O2不
加抗氧化药物，标记为A510（损伤）。按式（4）计算
表观羟自由基清除率。
清除率=（A510（加药）-A510（损伤））/（A510
（未损伤）-A510（损伤)）×100% （4）
2 结果与分析
2.1 纤维素酶法提取刺山柑黄酮工艺条件研究
2.1.1 单因素试验
在纤维素酶法提取刺山柑黄酮的过程中，研究了
酶浓度（E），酶解时间（t）、酶解温度（T）对黄
酮提取的影响。
1) 酶用量对酶解的影响
配制缓冲液，调整pH为4.8，分别添加纤维素
酶0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，酶解温度为50
℃，酶解时间为1.5 h，研究酶浓度对刺山柑黄酮提取
率的影响，结果如表2所示。加酶量在0.1%~0.2%时，
随着加酶量的增加，黄酮的提取率提高。当加酶量大
于0.2%时，黄酮提取率反而有下降的趋势。因此最佳
加酶量为0.2%。
表2 酶用量对酶解的影响
加酶量/ %
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
提取率/ % 1.87 2.23 1.93 1.83 1.89
2) 温度对酶解的影响
选用酶浓度0.2%，缓冲液pH 4.8，采用不同的温
度（40 ℃，45 ℃，50 ℃，55 ℃和60 ℃），酶解
1 h，对纤维素酶酶解过程中，温度对黄酮的得率进
行研究。纤维素酶的最适温度在40 ℃~60 ℃之间，当
酶解温度较低时，酶活力低；酶解温度过高又会导致
酶失活，丧失催化能力。由表3可知，在55 ℃时，黄
酮提取率达到最大。因此最佳温度为55 ℃。
表3 温度对酶解的影响
温度/ ℃
40 45 50 55 60
提取率/ % 1.76 1.98 2.21 2.47 2.16
3) 酶解时间对提取得率的影响
酶解时间的长短也将影响从刺山柑中提取黄酮
的得率。因此，在酶浓度0.2%，HAc-NaAc缓冲液pH
4.8，酶解温度55 ℃，研究不同的酶解时间（0.5，1，
1.5，2和2.5 h） 对提取刺山柑黄酮得率的影响。由表
4可以看出，酶解时间在0.5~1 h之间时，刺山柑黄酮
提取率逐渐增大。酶解时间在1~1.5 h之间时，刺山柑
黄酮提取率逐渐减小。酶解时间在1.5~2 h之间时, 刺
山柑黄酮提取率逐渐增大。酶解时间在2~2.5 h之间时,
刺山柑黄酮提取率逐渐减小。由于纤维素酶的价格比
较昂贵，从工业生产及经济因素考虑，因此酶解的最
佳时间为1 h。
表4 酶解时间对提取率的影响
酶解时间/ h
0.5 1 1.5 2 2.5
提取率/ % 1.67 2.39 1.71 2.13 1.79
2.1.2 正交试验
工艺技术
《食品工业》2015 年第36卷第 3 期 3
通过单因素试验发现，酶用量、酶解时间及酶解
温度对刺山柑黄酮提取率影响较大。且初步优化工艺
条件为：加酶量为0.2%、酶解温度为55 ℃、酶解时
间为2 h。在此基础上设计上述3因素3水平的的正交试
验，所得结果见表5。
表5 正交试验结果
试验号 A B C D（空列） 总黄酮得率/ %
1 1 1 1 1 1.73
2 1 2 2 2 2.16
3 1 3 3 3 1.94
4 2 1 2 3 2.13
5 2 2 3 1 2.47
6 2 3 1 2 1.98
7 3 1 3 2 1.89
8 3 2 1 3 1.97
9 3 3 2 1 1.79
K1 5.83 5.75 5.68 5.99
K2 6.58 6.6 6.08 6.03
K3 5.65 5.71 6.3 6.04
R 0.93 0.89 0.62 0.04
分析总黄酮提取率正交试验表结果，可以得出，
刺山柑黄酮提取的最佳工艺条件为A2B2C3，即纤维素
酶用量为0.20%，酶解温度55 ℃，酶解时间80 min。
由表2中A的极差最大，B因素的其次，最小的是C因
素的，说明影响黄酮提取率的主要因素是A（酶浓
度）和B（酶解温度），其次才是C（酶解时间）。
2.2 酶法与化学法提取刺山柑黄酮
2.2.1 不同方法提取刺山柑总黄酮得率
如表6所示，在酶解工艺初步优化条件（纤维素
酶用量0.20%，酶解温度55 ℃，酶解时间2 h）下，纤
维素酶酶解后提取得到的刺山柑黄酮得率为2.39%，
与醇提法相比，增加了近一倍。而在正交试验优化得
到的最优工艺条件（纤维素酶用量0.2%，酶解温度55
℃，酶解时间80 min）下，刺山柑黄酮的得率进一步
提高到2.47%。
表6 醇提法和酶法的比较
提取方法
醇提法 酶法(初步优化工艺) 酶法(最优工艺)
黄酮得率/ % 1.24 2.39 2.47
2.2.2 酶法和化学法提取的黄酮清除羟基自由基能力
将采用化学法和酶法提取的两种黄酮进行清除羟
基自由基试验。从图1中可以看出，两种方式所提取
的黄酮，清除羟自由基活性极为相似，几乎没有差
别，初步可以说明采用化学法或酶法所提取的黄酮的
结构和成分基本一致。同时从图1中也可以看出，刺
山柑黄酮的清除羟自由基能力随黄酮含量的增加而逐
渐增强，而且酶法提取的黄酮清除羟基自由基的能力
慢慢高于化学法提取的刺山柑黄酮，说明用酶法所提
取的刺山柑黄酮有较强的抗氧化能力。
图1 酶法和化学法刺山柑黄酮提取物清除羟基自由
基活性的比较
3 结论
植物的细胞壁由纤维素组成，而有效成分往往被
包裹在细胞壁内。纤维素酶可以破坏细胞壁，从而使
有效成分容易溶出[6]。研究中先通过纤维素酶处理刺
山柑，再提取其中的黄酮类有效成分，结果表明，纤
维素酶处理后的黄酮得率明显增加。并通过正交试验
得到纤维素酶提取的优化工艺条件为：T=55 ℃，t=80
min，E=0.40%。在优化条件下，酶法提取刺山柑黄酮
的得率可达到2.47%，与乙醇提取法相比，黄酮得率
有明显提高。深入研究比较两种方法提取的刺山柑黄
酮清除羟基自由基能力，结果表明，酶法提取的刺山
柑黄酮具有较强的抗氧化能力，推测两种方法提取的
黄酮类物质结构和成分基本一致。
但由于中药材存在质地和成分的差异，因此将纤
维素酶用于其广泛的提取需要进一步深入研究。
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工艺技术