全 文 ：第 28卷第 6期 江 西 农 业 大 学 学 报 Vo.l 28, No. 6
2006年 12月 Acta Ag ricu lturae Unive rsitatis Jiangx iensis D ce. , 2006
文章编号:1000 - 2286(2006)06 - 0813 -06
华木莲叶多糖的提取及其抗氧化作用
庞会忠 1 ,俞志雄 2* ,施建敏 2 ,肖 珍 1 ,姜木兰1 ,揭正平 2
(1. 江西农业大学 生物工程系 ,江西 南昌 330045;2. 江西农业大学 园林与艺术学院 ,江西 南昌 330045)
摘要:对华木莲叶多糖的最佳提取条件及其对大白鼠体外抗氧化作用进行了初步研究 , 结果表明:浸提温度
70 ℃,浸提时间 1. 5 h, 浸提料水比 1∶20,乙醇质量浓度 φ=90%, 华木莲叶多糖含量为 0. 69%;不同质量浓度
的华木莲叶多糖能显著清除自由基作用 , 当华木莲叶多糖质量浓度 100 μg /mL时 , 清除超氧阴离子自由基
(O 2 )为 66. 38%,清除羟基自由基( OH)为 68. 58%,抑制 SD大鼠红细胞溶血率为 95. 84%。
关键词:华木莲多糖;提取条件;自由基;抗氧化
中图分类号:Q539 +. 7　　文献标识码:A
The Anti- ox idation Effect of Polysaccharide Extracted
from Sinomanglietia glaula Leaf
PANG Hui - zhong
1 , YU Zh i - xiong2* , SH I Jian -m in2 ,
X IAO Zhen
1 , JIANG M u - lan1 , JIE Zheng - ping2
　　(1. Depa rtment of B ioeng inee ring, JAU , Nanchang 330045, China;2. Co llege of A rt and Landscape,
JAU , Nanchang 330045, China)
　　Abstract:The best techniques for ex traction of Sinomang lietia g laula po ly saccharide and the polysaccha-
ride’ s anti - ox ida tion effect in v itro w ere stud ied. The results show ed:the best techno log ica l cond itions w ere
that the tempe ra tu re fo r ex traction w as 70 ℃, the time fo r ex traction w as 1. 5 hours, the ra tio of samp le to w a-
ter w as 1∶20 and the concen tration o f e thano lw as 90%. W ith the best ex traction techniques, the polysaccha-
ride con tent of Sinomang lietia g laula was 0. 69%. The S inomanglietia glaula polysaccharide in different con-
centra tions could obv iously e lim inate free rad ica.l When the po lysaccharide concentra tion of S inomang lietia
glaula was 100 μg /mL, the e lim ination rate to (O 2 ) and ( OH)we re 66. 38% and 68. 58% respective ly,
and the inh ib ition ra te to RBC hemo ly sis induced by H2O 2 was 95. 84%.
Key words:S inomang lietia g lau la po lysaccharide;ex traction techniques;free radical;an ti - oxida tion
多糖是所有生物肌体的重要结构成分 ,是多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子活性物质 ,也是一
种重要的信息或信息分子的受体 ,参与分子识别 ,细胞粘着及细胞的防御作用 。随着科学技术的发展 ,
多糖用于医药领域 ,能提高机体免疫功能 [ 1] 。自 20世纪 50年代来 ,已经从植物中分离出多种具有抗癌
活性的多糖[ 2] 。 20世纪 80年代发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用 ,能控制细胞分裂
和分化 ,调节细胞的生长和衰老 [ 3] 。如从蓝藻类的螺旋藻中提取到的脂类形成的脂多糖或糖脂 [ 4]和从
收稿日期:2006 - 08 - 29
基金项目:国家自然科学基金项目(30060073)
作者简介:庞会忠(1959 -), 男 ,高级实验师 , 主要从事生物工程物质分离工作;*通讯作者 ,俞志雄教授 , E -m a il:
zxyu2006@126. com。
DOI牶牨牥牣牨牫牳牫牰牤j牣j jau牣牪牥牥牰牨牱牴
　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
枸杞子中提取的枸杞多糖等都有提高免疫机能抗衰老及抑制肿瘤的作用。目前 ,人们已成功地从百种
植物中提取了多糖 ,并广泛用于医药和保健食品中的研究和开发中 ,植物多糖研究得比较深入的是稻
草 、麦秸多糖 ,竹多糖 ,刺五加多糖等 [ 5] 。
华木莲 (S inomanglietia glaula Z. X. Yu e tQ. Y. Zheng)为木兰科中我国特有单种属植物 [ 6] ,仅狭
域分布于江西宜春境内明月山山地 ,在国务院公布的 “国家重点保护野生植物名录 ”中被列为国家 Ⅰ级
重点保护植物的落叶木莲 (Mang lietia decidua)即为华木莲的异名[ 7 ～ 9] 。我们在首次对华木莲叶黄酮类
化合物抗氧化作用研究[ 10]期间 ,亦对多糖的提取条件及其抗氧化作用作了初步研究 ,旨在为华木莲所
含活性物质的作用提供基础资料。
1　材料与方法
1. 1　原料和试剂
华木莲叶(取自江西农业大学华木莲保育园 ), SD大鼠血液 (由江西省职业病研究所提供) ,邻苯
三酚 、七水硫酸铁 、水杨酸 、盐酸 、过氧化氢 、无水乙醇 、浓硫酸 、Tris,葡萄糖 ,以上试剂均为分析纯
(AR)。
1. 2　主要仪器设备
HH - 6数显恒温水浴锅 、Type1702电子分析天平 、722光栅分光光度计 (上海精密仪器厂 )、752紫
外光分光光度计 、101 - 2型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂 )、TDL - 4型电动离心机 (上海
安亭科学仪器厂 )、植物粉碎机 、冰箱等。
1. 3　实验方法
1. 3. 1　华木莲多糖的提取方法　华木莲叶烘干粉碎 ,过 40目筛制成粉末 。称取 5 g粉末 ,料水比 1∶20
加水定容后放入水浴锅加热 (70 ℃)浸提 2 h,取出过滤 ,所得过滤液经 4 000 r /m in, 10 m in离心 ,取上
清液 ,加入 φ=90%乙醇 。在冰箱内于 4 ℃静置 24 h后 ,取出经 4 000 r /m in, 10m in离心后取沉淀物 ,
将沉淀加水溶解 ,再除去蛋白 ,浓缩即得华木莲粗多糖 [ 4, 11, 12] 。
1. 3. 2　华木莲多糖提取条件的研究　研究提取时间 、温度 、料水比 、乙醇质量浓度 4个单因素对多糖提
取率的影响 ,得出最佳提取条件 [ 13] 。
(1)提取时间选择实验 。在确定料水比为 1∶20,提取温度 90 ℃, 80%乙醇质量浓度不变的条件下 ,
比较不同提取时间对多糖提取含量的影响 ,以选择最佳提取时间。
(2)提取温度选择实验 。在料水比为 1∶20, 80%乙醇质量浓度 ,提取时间由上一实验确定 ,分别在
60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃条件下提取 1次 ,根据多糖提取含量确定最佳提取温度。
(3)料水比选择实验。在 80%乙醇质量浓度及在上述实验确定的提取时间和温度下 ,选择料水比
为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40条件下提取 1次 ,根据多糖提取含量确定最佳料水比。
(4)乙醇质量浓度选择实验。在确定的提取时间 、温度及料水比下 ,分别用 φ=60%, 70%, 80%,
90%的乙醇质量浓度提取 1次 ,根据多糖提取含量确定最佳乙醇质量浓度。
(5)正交实验 。根据单因素试验确定的条件范围 ,通过 L9(34)正交实验得出华木莲叶多糖的最佳
提取条件。
1. 3. 3　华木莲多糖含量测定　准确吸取 0. 1 mg /mL葡萄糖标准溶液 2, 2. 5, 3, 3. 5, 4, 4. 5, 5 mL于试
管中加水定容到 10 mL,摇匀 ,然后各精密吸取 2 mL,置于刻度试管中再各加 φ=5%苯酚溶液 1. 0 mL,
摇匀 ,缓慢滴加浓 H2 SO4 5. 00 mL,摇匀后冷却至室温再放入沸水浴中加热 15 m in,取出迅速用流水冲洗
冷却至室温 ,同时取 2. 0 mL蒸馏水 ,加入 5%苯酚 1. 0 mL和浓硫酸 5. 0 mL放入沸水浴中加热 15 m in
进行显色 ,作为空白对照。于 490 nm处测吸光度 ,绘制标准曲线 ,得出回归方程:
y =5. 228 6×10-3 x +0. 036 57　　R =0. 998 5[ 14, 15] (1)
将样品多糖中加蒸馏水稀释为 30 mL质量浓度为 φ=5%的华木莲多糖样品溶液。精密吸取稀释
后的各样品液 2 mL,按照做标准曲线的方法进行测定 。计算公式:
多糖提取含量(%)=(C ×V /2) m/ ×1 000 (2)
式中:C -曲线回归方程计算的含量 , V -样品总体积 ,m -样品质量。
814
第 6期 庞会忠等:华木莲叶多糖的提取及其抗氧化作用
1. 3. 4　对超氧阴离子自由基 (O 2 )清除作用测定 -邻苯三酚 (pryogallo l, PR)自氧法 [ 1, 16] 　利用某些体
系在氧化或自氧化过程中生成超氧阴离子自由基 (O 2 ), O 2 与某些化合物作用 ,产生具有特定吸收的
有色物质 ,用分光光度计进行测定。受试物若能消除 O 2 则吸光度发生变化 ,可间接判断受试物对 O 2
的清除作用 。邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化 ,自氧化过程中产生 O 2 , O 2 加速邻苯三酚自氧化速
率 ,同时生成有色的中间产物 ,中间产物的积累在滞后 30 ～ 45 s,与时间成良好的线性关系 ,一般维持
4 m in左右 ,随后减慢 。有色产物在 325 nm有强烈的光吸收。由于自氧化速率依赖于 O 2 的质量浓度 ,
清除 O 2 则抑制自氧化反应 ,阻止中间产物的积累 ,从而评价受试物清除 O 2 的能力。
2. 4 mLTris-HC l缓冲液(pH8. 2),加 0. 1 mL不同质量浓度的华木莲叶多糖 ,混匀后加入 7mmo l /L
邻苯三酚 0. 3mL,混匀后在第四分钟加入 10 mol /L HC l 1滴终止反应 ,测 A 325 nm值 ,计算清除率。
清除率 (%)=(A0 -Ai) /A0 (3)
(3)式中 , A0为对照组吸光值 , A i为华木莲叶多糖组的吸光值。
1. 3. 5　清除羟基自由基( OH)的测定 -水杨酸法[ 17 ～ 21] 　Fenton反应产生 OH ,反应式:
H2O2 +Fe2+→ OH +H2O +Fe2 + (4)
羟自由基氧化水杨酸得到 2, 3 -羟基苯甲酸 ,用其在 510 nm处的吸光值表示 OH的多少 ,吸光值
与 OH的量成正比 。反应体系中加入具有清除 OH作用的物质即可降低该吸光值。
利用 H2O 2与 Fe2+混合产生 OH ,在体系内中加入水杨酸捕捉 OH并产生有色物质 ,该物质在
510 nm下有最大的吸收。
反应体系中含有 6. 6 mmo l /L H2O2 1 mL, 9 mmo l /L水杨酸 -乙醇 1 mL, 9 mmo l /L FeSO4 1 mL,不
同质量浓度的多糖溶液 1 mL,最后加 H2O2启动反应 , 37℃反应 0. 5 h,以蒸馏水为参比 ,在 510 nm下
测量各质量浓度的吸光度 。考虑到多糖本身的吸光值 ,以 9 mmo l /L FeSO4 , 9 mmo l /L水杨酸 -乙醇
1 mL,不同质量浓度的多糖溶液 1mL和 1mL蒸馏水作为多糖的本底吸收值 。
清除率 (%)=[A0 - (Ax -Ax0)] /A0 ×100% (5)
(5)式中 , A0为空白对照液的吸光值 , Ax为加入多糖溶液的吸光值 , Ax0为不加显色剂 H 2O 2溶液本
底的吸光值 。
1. 3. 6　对 H2O 2诱导红细胞氧化溶血的影响 [ 18, 21] 　利用 H2O 2与 Fe2+结合产生羟自由基 ( OH)引发
氧化作用 ,使红细胞膜损伤 ,物质外流 , H2O2自身也可引发氧化反应 ,加入华木莲叶多糖可抑制氧化损
伤 ,保护红细胞膜 。
SD大鼠颈动脉插管取血 ,肝素抗凝 , 3 000 r /m in离心得红细胞 ,冰冷生理盐水洗 3次 ,制成 0. 5%
的红细胞悬浮液 。取红细胞悬液 1 mL,加不同质量浓度的华木莲叶多糖 200μL,最后加 100 mmo l /L
H2O2混匀启动反应 , 37 ℃作用 1 h,用生理盐水稀释 6倍 , 3 000×g,离心 5 m in,取上清液于 415 nm处
测定吸光值 ,计算抑制率和溶血度。
抑制率 (%)=(Ah -Ai) /(Ah -A0) (6)
式溶血度(%)=Ai /Ah (7)
其中 A0为对照组吸光值 , A i为华木莲叶多糖组的吸光值 , Ah为空白组的吸光值 。
2　结果与分析
2. 1　单因素选择实验结果及分析
2. 1. 1　提取时间选择实验结果及分析　由图 1可知 ,提取时间在 1 ～ 2 h之间多糖提取量逐渐增大 ,继
续延长加热时间 ,多糖提取量反而减小 ,因此 ,提取时间选择 2 h比较合理。
2. 1. 2　提取温度选择实验结果及分析　图 2说明 ,提取温度在 60 ～ 70 ℃之间多糖提取量逐渐增大 ,至
80 ℃时急剧减小 ,因此 ,采用 70 ℃提取温度比较合理 。
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
图 1　不同提取时间对华木莲叶多糖得率的影响
F ig. 1　E ffect o f extraction tim e on the ex traction
rate of po lysaccha rides o f Sinomang lietia g lau la
图 2　不同提取温度对华木莲叶多糖得率的影响
F ig. 2　Effe ct of ex traction tem pera tu re on the ex trac tion
ra te o f po ly saccha rides o fS inomanglietia glaula
表 1　L
9
(34)的正交试验设计及极差分析结果
Tab. 1　The L9(34) tr ial schem es and test re su lts
试验号 温度 /℃
A
乙醇质量浓度 /%
B
时间 /h
C
料水比
D
提取率
/%
1 60(1) 70(1) 1. 5(1) 1∶10(1) 0. 375 7
2 60(1) 80(2) 2. 0(2) 1∶20(2) 0. 501 9
3 60(1) 90(3) 2. 5(3) 1∶30(3) 0. 624 6
4 70(2) 70(1) 2. 0(2) 1∶30(3) 0. 409 4
5 70(2) 80(2) 2. 5(3) 1∶10(1) 0. 455 3
6 70(2) 90(3) 1. 5(1) 1∶20(2) 0. 699 9
7 80(3) 70(1) 2. 5(3) 1∶20(2) 0. 431 7
8 80(3) 80(2) 1. 5(1) 1∶30(3) 0. 496 9
9 80(3) 90(3) 2. 0(2) 1∶10(1) 0. 565 1
K 1 3. 938 8 3. 178 8 4. 126 8 3. 658 8
K 2 4. 176 3. 880 3. 940 4. 360
K 3 3. 984 5. 040 4. 032 4. 080
K 1 1. 312 9 1. 059 6 1. 375 6 1. 219 6
K
2 1. 392 1. 293 3 1. 313 3 1. 453 3
K 3 1. 328 1. 680 1. 344 1. 360
R 0. 791 0. 620 4 0. 623 0. 233 7
2. 1. 3　料水比选择实验结果及分析　图 3显示出 ,料水比在 1∶10时 ,多糖提取含量较低 ,至 1∶20时 ,
多糖提取含量达峰值 ,增大加水量 ,多糖含量逐渐减小 ,因此 ,选用 1∶20的料水比比较合理。
2. 1. 4　乙醇质量浓度选择实验结果及分析　图 4表明 ,乙醇质量浓度 φ=60% ～ 90%之间多糖提取含
量逐渐增大 ,因此 ,选择 φ=90%的乙醇质量浓度比较合理 。
图 3　不同料水比对华木莲叶多糖得率的影响
F ig. 3　E ffec t of the ra tio of w ater to sam ple on the ex trac tion
rate of po lysaccha rides o f Sinomang lietia g lau la
图 4　不同乙醇质量浓度对华木莲叶多糖得率的影响
F ig. 4　E ffec t o f differen t concentra tions o f e thano l on the
ex traction rate o f po ly saccharides of S inom ang lietia g laula
2. 2　正交实验结果及分析
根据以上实验结果 (表
1), 最 佳 提 取 条 件 为
A 2B3C1D2 ,即使用 70℃温度 、
φ=90%乙醇质量浓度 、1. 5 h、
料水比 1∶20条件下提取 。
2. 3　华木莲叶多糖含量结果
在最佳提取条件下 ,测定
了华木莲叶 、当年生小枝和果
壳的多糖含量 (表 2)。从表
2可看出 ,华木莲叶的多糖提
取含量是三者中最高的 , 为
0. 692%,但与果壳的多糖含
量 (0. 608%)相差不大 ,两者
均明显高于当年生小枝的多
糖含量 ,其仅为 0. 154%。
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第 6期 庞会忠等:华木莲叶多糖的提取及其抗氧化作用
表 2　华木莲多糖含量
Tab. 2　The polysacchar ide con ten t of Sinomang lietia glau la
样品溶液 OD值(C1 -C2)**
多糖质量浓度
/μg
多糖提取含量
W /%
华木莲叶溶液 0. 519 92. 267 0. 692
华木莲枝溶液 0. 144 20. 547 0. 154
华木莲果壳溶液 0. 461 81. 175 0. 608
　　注:**C1 -样品吸光值 , C2 -空白吸光值。
表 3　华木莲叶多糖对超氧阴离子自由基的清除作用
Tab. 3　The e lim ination of Sinomang lietia glau la polysaccharide to(O 2 )
实验组
华木莲叶多糖质量浓度 /μg mL - 1
超氧阴离子自由基生成量
/A325 10 m in- 1
清除率
/%
0 0. 821
10 0. 756 8. 8
20 0. 695 14. 12
30 0. 643 21. 68
40 0. 588 28. 64
50 0. 521 36. 54
60 0. 471 42. 51
70 0. 416 49. 33
80 0. 376 54. 20
90 0. 308 62. 48
100 0. 276 66. 38
表 4　华木莲叶多糖对羟基自由基( OH)的清除效果
Tab. 4　The e lim inat ion ofS inomang lie tia g lau la polysacchar ide to( OH)
实验组 华木莲叶多糖质量浓度
/μg m L- 1 A510nm
清除率
/%
对照组 0 0. 678 0
H2O2 +华木莲叶多糖组 0 0. 632 6. 78
H2O2 +华木莲叶多糖组 15 0. 548 19. 17
H2O2 +华木莲叶多糖组 30 0. 498 26. 55
H2O2 +华木莲叶多糖组 45 0. 445 34. 37
H2O2 +华木莲叶多糖组 60 0. 397 41. 14
H2O2 +华木莲叶多糖组 75 0. 306 54. 87
H2O2 +华木莲叶多糖组 90 0. 295 56. 49
H
2
O
2
+华木莲叶多糖组 100 0. 213 68. 58
表 5　华木莲叶多糖对 H2O 2诱导血红细胞溶血的抑制作用
Tab. 5　The inh ib ition ofS inomanglietia g lau la po lysacchar ide to
RBC hem olysis induced byH 2O2
实验组 华木莲叶多糖质量浓度
/μg mL - 1 A415nm
溶血度
/%
抑制率
/%
对照组 0 0. 535 51. 39
H2O2诱导组 0 1. 041 100
H2O 2 +华木莲叶多糖 20 0. 795 76. 48 34. 78
H2O 2 +华木莲叶多糖 40 0. 665 63. 88 55. 92
H2O 2 +华木莲叶多糖 60 0. 527 50. 62 70. 75
H2O 2 +华木莲叶多糖 75 0. 492 47. 26 82. 81
H2O 2 +华木莲叶多糖 90 0. 471 45. 24 85. 97
H2O 2 +华木莲叶多糖 100 0. 443 42. 36 95. 84
2. 4　华木莲叶多糖对超氧阴离子
自由基 (O 2 )的作用
表 3显示出 ,华木莲叶多糖能
明显降低邻苯三酚发生自氧化的速
率 ,呈剂量关系 ,当华木莲叶多糖质
量浓度为 10 μg /mL时 , 清除率为
8. 80%,当华木莲叶多糖质量浓度
达 100 μg /mL 时 , 清 除 率达 到
66. 38%,其清除率随
着华木莲叶多糖质量
浓度的升高而增大。
2. 5　华木莲叶多糖
对羟基自由基 (
OH)的清除效果
由表 4可以看
出 ,华木莲叶多糖对
羟基自由基有清除作
用 ,尤其在多糖质量
浓度越高时 ,清除率
也越大 , 当多糖质量
浓度达到 45. 00 μg /
mL时 , 清除率可达
34. 37%,当质量浓度
达到 100 μg /mL时 ,
清除率可达 68. 58%,
可见华木莲叶多糖的
清除作用和多糖质量
浓度呈线性关系 。
2. 6　华木莲叶多糖
对 H2O2诱导血红细
胞溶血的抑制作用
由表 5表明华木
莲叶多糖抑制溶血的
发生且呈剂量关系 ,
当华木莲叶多糖质量
浓度为 20 μg /mL溶
血度为 76. 48%, 抑
制率为 34. 78%, 当
华木莲叶多糖质量浓
度为 100 μg /mL, 溶
血度为 42. 36%, 抑
制率为 95. 84%。随
着华木莲叶多糖质量
浓度的升高 ,溶血度
不断降低 ,抑制率则
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　江 西 农 业 大 学 学 报 第 28卷
逐渐升高 ,可见 ,华木莲叶多糖可抑制氧化损伤 ,保护红细胞膜。
3　结论与讨论
(1)华木莲叶多糖的最佳提取条件 。采用水浸提醇沉法 ,通过单因素梯度实验和正交试验确定华
木莲叶多糖的最佳提取条件:浸提温度 70 ℃,浸提时间 1. 5 h ,浸提料水比 1∶20,乙醇质量浓度 φ=
90%,华木莲叶多糖峰值含量为 0. 69%。
(2)华木莲叶多糖对超氧阴离子自由基(O 2 )的作用。其清除作用与多糖质量浓度呈线性关系 ,当
质量浓度达到 100 μg /mL时 ,清除率可达 66. 38%。
(3)华木莲叶多糖对羟基自由基 ( OH)的清除效果。其清除率随华木莲叶多糖质量浓度的升高
而增大 ,当质量浓度达 100 μg /mL时 ,清除率达 68. 58%。
(4)华木莲叶多糖对 H 2O 2诱导血红细胞溶血的抑制作用 。当质量浓度由 20 μg /mL增至 100 μg /
mL时 ,溶血度从 76. 48%降至 42. 36%,而抑制率则由 34. 78%增高为 95. 84%,足以证明该多糖可抑制
氧化损伤保护红细胞膜。
华木莲叶多糖具有明显的抗氧化活性 ,提示其存在潜在的利用价值 ,或许能成为抗衰老保健食品辅
料或功能因子。但其为一混合物 ,进一步的分离纯化和构效关系尚待深入研究。
我们在对华木莲叶多糖含量测定的同时 ,还对华木莲的当年生小枝和聚合果壳中所含多糖与叶同
步地(止于本文 1. 3. 3)分别进行了测定 ,限于篇幅 ,仅将部分结果列入表 2中 ,从多糖含量看 ,果壳较叶
稍低 ,但可以结合采种进行而不影响树体生长 ,或许更便于人们利用而受到青睐 。
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