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白花前胡甲素及丙素经 hCAR 通路诱导 UGT1A1 的表达
周许年, 毕惠嫦*, 金 晶, 邓蓉蓉, 应梦佳, 王永涛, 黄 民*
(中山大学药学院药物代谢与药动学实验室, 广东 广州 510006)
关键词: 白花前胡甲素; 白花前胡丙素; UGT1A1; CAR; 中药-药物相互作用
中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 05-0794-05
Induction of UGT1A1 expression by praeruptorin A and
praeruptorin C through hCAR pathway
ZHOU Xu-nian, BI Hui-chang*, JIN Jing, DENG Rong-rong, YING Meng-jia,
WANG Yong-tao, HUANG Min*
(Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University,
Guangzhou 510006, China)

Abstract: This study is purposed to investigate the effects of praeruptorin A (PA) and praeruptorin C (PC) on
UGT1A1 in HepG2 cells through hCAR pathway. PA and PC were incubated with HepG2 cells for 24 h and 48 h,
mRNA and protein expressions of UGT1A1 were determined by real-time PCR and Western blotting assays.
Additionally, effects of PA and PC on UGT1A1 mRNA and protein expressions were also measured after transient
transfection of a specific CAR siRNA for 72 h in HepG2 cells. UGT1A1 mRNA and protein expression
levels were significantly increased by PA and PC after incubation for 48 h. Moreover, the mRNA and protein
up-regulations of UGT1A1 were attenuated by transient transfection of a specific CAR siRNA, suggesting the
induction was mediated by CAR. The results suggest that PA and PC can significantly up-regulate UGT1A1
expression partially via the CAR-mediated pathway.
Key words: praeruptorin A; praeruptorin C; UGT1A1; CAR; herb-drug interaction

中药前胡为伞形科植物白花前胡 (Peucedanum
praeruptorum DUNN.) 的干燥根, 具有宣散风热、降
气化痰等功效[1]。其主要活性成分白花前胡甲素 (PA)
及白花前胡丙素 (PC) 属于香豆素类化合物, 是一
对外消旋体[2]。
尿 苷 二 磷 酸 葡 糖 醛 酸 转 移 酶 1A1 (UDP-
glucuronyltransferase 1A1, UGT1A1) 是重要的尿苷
二磷酸葡糖醛酸转移酶 (UDP-glucuronyltransferase,

收稿日期: 2013-02-07; 修回日期: 2013-03-20.
基金项目: 国家“重大新药创制”科技重大专项 (2012ZX09506001-004);
国家科技支撑计划 (2008BAI51B02).
*通讯作者 Tel: 86-20-39943011, Fax: 86-20-39943000,
E-mail: bihchang@mail.sysu.edu.cn;
huangmin@mail.sysu.edu.cn
UGT) 家族成员, 根据序列的同源性, 分为 UGT1 家
族, 如 UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、
UGT1A6 亚型等; 以及 UGT2 家族, 如 UGT2A1、
UGT2B4、UGT2B7、UGT2B10 亚型等[3]。它们是参
与药物Ⅱ相结合反应的重要的代谢酶之一, 能催化
葡糖醛酸与大量的内源性化学物质 (如胆红素、短链
脂肪酸、胆汁酸等) 和外源性化学物质 (如药物、环
境毒物、杀虫剂等) 进行葡糖醛酸结合反应, 把一系
列亲脂性底物转化为水溶性葡糖醛酸, 促进排出体
外, 是人体解毒的重要方式之一[4]。
组成型雄烷受体 (constitutive androstane receptor,
CAR) 与孕烷 X 受体 (pregnane X receptor, PXR) 一
样, 都是孤儿核受体家族中的主要成员。近年来的研
DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.05.012
周许年等: 白花前胡甲素及丙素经 hCAR 通路诱导 UGT1A1 的表达 · 795 ·

究表明, CAR 的下游效应靶基因包括异源性药物 (毒
物) 及内源性具有激素代谢功能的酶及转运蛋白, 如
包括 CYP450 酶系在内的 I 相代谢酶[5]、葡糖醛酸转
移酶 (UGT) 等 II 相代谢酶[6], 以及多药耐药相关蛋
白 (MRP2、MRP3、MRP4、MRP5) 等相关药物转运
蛋白[7], 可对药物或毒物在体内的处置如吸收、分布、
代谢及排泄等过程产生重要的影响。
近年来研究证实多种中药对 UGT1A1 代谢酶有
影响, 而且 CAR 发挥了重要的调节作用。例如黄芩
素和汉黄芩素能抑制肝肾内 UGTs 的活性[8]; 高丽参
的肠道代谢产物能非竞争抑制肠道 UGT1A1 活性[9];
马钱子碱和番木鳖碱能增加肝微粒体中 UGTs 的活
性[10]; 芒果水提取物和芒果苷能明显诱导人原代肝
细胞中 UGT1A1 的表达并且还能增加其活性[11]。不
仅如此, 有大量的文献报道了 CAR 参与了中药对
UGT1A1 代谢酶的调控过程。例如在敲除 CAR 的小
鼠中, 茵陈对参与胆红素代谢相关的基因 UGT1A1
的诱导作用很弱; 但是在野生型小鼠中, 茵陈却能增
强对 UGT1A1 的诱导, 加速肝脏清除胆红素过程[12]。
Miwa 等还发现, 在沉默核受体 CAR 的 HepG2 的细
胞中, 黄酮类化合物 5, 7-二羟黄酮和黄芩素对 UGT1A1
的基因和蛋白的诱导作用明显弱于正常对照组。由此
可见, 核受体 CAR 对Ⅱ相酶 UGT1A1 的转录调节具
有非常重要的意义。
本课题组前期的研究表明, 白花前胡甲素及丙素
能经 CAR 核受体通路影响 CYP3A4 表达[13], 但是它
们能否通过 CAR 通路影响Ⅱ相代谢酶 UGT1A1 的表
达尚不清楚。因此, 本研究旨在考察白花前胡甲素及
丙素对人肝癌细胞株 HepG2 细胞中 UGT1A1 基因和
蛋白表达的影响, 并探讨CAR是否参与其调控过程。

材料与方法
实验材料 HepG2 细胞系购自中国科学院上海
生命科学研究院细胞资源库。培养基 DMEM、胰酶
(美国 Hyclone 公司); 胎牛血清 (Gibco 公司); 转染
试剂 (罗氏公司); OPTI-MEM 培养基 (美国 Invitrogen
公司); Trizol、RT-PCR 试剂盒、Q-PCR 试剂盒 (大连
宝生物工程有限公司); PCR 扩增引物 (由英潍捷基
(广州) 贸易有限公司合成); UGT1A1 抗体 (美国
Abcam 公司); β-actin 及兔二抗 (美国 Cell Signaling
Technology公司); 超敏ECL 化学发光液 (美国Thermo
公司); 白花前胡甲素、丙素 (天津奎青商贸有限公
司)。
细胞培养 将 HepG2 细胞接种于含 10% 胎牛血
清、双抗 (100 u·mL−1 青霉素及 100 μg·mL−1 链霉素)
的 DMEM 培养基, 5% CO2、37 ℃常规培养。阳性对
照药物苯巴比妥及白花前胡甲素、丙素均溶解于
DMSO 溶液中。
细胞 CAR siRNA 瞬时转染 取对数生长期的
HepG2 细胞接种于 12 孔板或 6 孔板中, 待细胞长至
汇合度 40%～50% 可用于转染。采用罗氏瞬时转染
法将 CAR siRNA 以及对照 siRNA 同时转入细胞。质
粒和脂质体分别用 OPTI-MEM 培养基稀释, 室温孵
育 5 min 后, 将质粒稀释液与脂质体稀释液轻混, 室
温放置 20 min 形成 DNA-脂质体复合物。最后添加
药物溶液至将细胞中, 置于 5% CO2、37 ℃孵箱中培
养 72 h 后收获细胞, 分别提取 RNA 和蛋白进行检
测。
Real-time PCR 检测 UGT1A1 mRNA 表达 取
对数生长期细胞接种于 12 孔板, 分别收集转染 CAR
siRNA 及药物处理 24 h 和 48 h 的细胞, 提取总 RNA
后, 按照 TaKaRa 逆转录试剂盒步骤, 将总 RNA 逆转
录成 cDNA 后进行荧光实时定量 PCR 检测。引物序
列设计如下, GAPDH 的上游引物: 5-GGATTTGGTC
GTATTGGG-3, 下游引物: 5-GGAAGATGGTGATG
GGATT-3; UGT1A1 的上游引物: 5-GGCCCATCATG
CCCAATAT-3; 下游引物: 5-TTCAAATCCTGGGAT
AGTGGATT-3。按下列条件在 PCR 扩增仪上进行扩
增: 94 ℃ 1 min → 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,
共 40 个循环 → 95 ℃ 10 s → 65 ℃ 45 s → 40 ℃ 60 s。
利用数据分析软件对每个样品的荧光定量 PCR 反应
结果进行分析。
Western blotting 检测 UGT1A1 蛋白表达 取转
染 CAR siRNA 及药物处理 72 h 后的 HepG2 细胞,
收集蛋白, BCA 法蛋白定量后置于 −80 ℃保存。各
样品按照总蛋白 50～80 μg 加入 8% SDS-PAGE 胶中
电泳, 将凝胶上的蛋白用 230 mA 恒流电转 90 min
至 NC 膜, 摇床上室温封闭 90 min。加入按比例稀释
的一抗 (UGT1A1 一抗 1∶500 稀释, β-actin 一抗 1∶
1 000 稀释), 4 ℃过夜孵育。将 TBST 清洗 3 次后的
PVDF 膜置于 CST 兔二抗 (1∶1 000 稀释) 中室温孵
育 60 min。洗 3 次后对膜进行曝光呈像, 检测目的蛋
白的表达。
统计学分析 采用 SPSS软件对所得数据进行统
计学分析, 各组数据均采用 x ± s 表示。在 P < 0.05 水
平使用 ANOVA 分析进行组间比较。
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结果
1 白花前胡甲素、丙素上调 HepG2 细胞的 UGT1A1
mRNA 表达
实验结果显示: 白花前胡甲素 (PA)、丙素 (PC) 与
HepG2 细胞共孵育作用 24 h 后, 50、25 及 10 μmol·L−1
的 PA 与 PC 对 UGT1A1 mRNA 表达水平没有显著
影响; 但作用 48 h 后, PB (苯巴比妥, phenobarbital,
2 mmol·L−1) 和 PA (50、25 及 10 μmol·L−1) 能分别明
显上调 mRNA 表达水平约 2.75 倍、2.26 倍、2.14 倍、
1.62 倍 (P < 0.05, 图 1); PB (2 mmol·L−1) 和 PC (50、25
及 10 μmol·L−1) 能上调约 2.75 倍、2.24 倍、2.21 倍、
1.99 倍 (P < 0.05, 图 2)。提示 PA 与 PC 能上调 HepG2
细胞 UGT1A1 mRNA 表达。


Figure 1 Effect of praeruptorin A (PA) on the mRNA expression
of UGT1A1 in HepG2 cells. Cells were treated with PB
(phenobarbital, 2 mmol·L−1) and PA (50, 25 and 10 μmol·L−1)
for 24 h and 48 h. Total RNA was obtained and the mRNA
expression was analyzed by using real-time quantitative PCR.
n = 3, x ± s. *P < 0.05 vs control group


Figure 2 Effect of praeruptorin C (PC) on the mRNA expression
of UGT1A1 in HepG2 cells. Cells were treated with PB
(2 mmol·L−1) and PC (50, 25 and 10 μmol·L−1) for 24 h and 48 h.
Total RNA was obtained and the mRNA expression was analyzed
by using real-time quantitative PCR. n = 3, x ± s. *P < 0.05
vs control group
2 白花前胡甲素、丙素上调 HepG2 细胞的 UGT1A1
蛋白表达
Western blotting 实验结果进一步证明, 白花前胡
甲素 (PA)、丙素 (PC) 与 HepG2 细胞共孵育作用 48 h
后, PB (2 mmol·L−1) 和 PA (50、25 及 10 μmol·L−1) 处
理后的结果显示, UGT1A1 蛋白与 β-actin蛋白条带的
光密度比值较空白组水平分别上调 2.13 倍、1.91 倍、
2.11 倍、1.87 倍 (P < 0.05, 图 3)。经 PB (2 mmol·L−1)
和 PC (50、25 及 10 μmol·L−1) 处理后, 光密度比值较
空白组水平分别上调 2.44 倍、3.04 倍、2.75 倍、2.65
倍 (P < 0.05, 图 4)。提示不同浓度的 PA 和 PC


Figure 3 Effect of PA on the protein expression of UGT1A1 in
HepG2 cells. Cells were treated with PB (2 mmol·L−1) and PA
(50, 25 and 10 μmol·L−1) for 48 h. Total protein was obtained
and the protein level was determined by Western blotting. n = 3,
x ± s. *P < 0.05 vs control group


Figure 4 Effect of PC on the protein expression of UGT1A1 in
HepG2 cells. Cells were treated with PB (2 mmol·L−1) and PC
(50, 25 and 10 μmol·L−1) for 48 h. Total protein was obtained
and the protein level was determined by Western blotting. n = 3,
x ± s. *P < 0.05 vs control group
周许年等: 白花前胡甲素及丙素经 hCAR 通路诱导 UGT1A1 的表达 · 797 ·

可以诱导 UGT1A1 蛋白表达。
3 CAR 低表达对白花前胡甲素、丙素诱导 UGT1A1
mRNA 表达水平的影响
HepG2 细胞转染 CAR siRNA 72 h 后, 与转染
siRNA 对照组比较, 2 mmol·L−1 PB、25 μmol·L−1 PA、
25 μmol·L−1 PC 处理组 UGT1A1 mRNA 表达显著降
低 (P < 0.05, 图 5)。


Figure 5 Effect of CAR knockdown on UGT1A1 mRNA ex-
pression. HepG2 cells were transfected with negative control
(50 nmol·L−1) or CAR siRNAs (50 nmol·L−1) and then treated
with 2 mmol·L−1 PB, 25 μmol·L−1PA and 25 μmol·L−1 PC for 72 h.
Total RNA was obtained and the mRNA expression was analyzed
using real-time quantitative PCR. n = 3, x ± s. *P < 0.05 vs
control group; #P < 0.05
4 CAR 低表达对白花前胡甲素、丙素诱导 UGT1A1
蛋白表达水平的影响
HepG2 细胞转染 CAR siRNA 72 h 后, 与转染
siRNA 对照组比较, 2 mmol·L−1 PB、25 μmol·L−1 PA、
25 μmol·L−1 PC处理组UGT1A1蛋白表达水平显著降
低 (P < 0.05, 图 6)。

讨论
白花前胡甲素、丙素是从中药白花前胡中提取的
有效成分, 具有广泛的药理活性, 在临床上应用日趋
广泛。本实验室前期研究结果表明 CAR 参与了白花
前胡甲素、丙素对 CYP3A4 的调控[13], 在此基础上,
本研究考察了白花前胡甲素、丙素对 HepG2 细胞中
UGT1A1 基因和蛋白表达水平的影响 , 并探讨了
CAR 在此转录和翻译过程中的调控作用。根据 MTT
实验结果并参考作者前期的研究, 本实验采用浓度
分别为 50、25 及 10 μmol·L−1 的 PA 和 PC 分别与
HepG2 细胞共孵育, 24 h 后虽未能明显诱导 UGT1A1
基因表达, 但 48 h 后可明显上调其基因和蛋白水平。
在 HepG2 细胞中, CAR 本底表达值较高[14], 因此过
表达 CAR 未能明显增强 PA 与 PC 对 UGT1A1 mRNA
表达的诱导作用 (结果未列出)。对于高表达 CAR 的
HepG2 细胞, 本实验主要通过转染 CAR siRNA, 利
用具有同源性的双链 RNA 诱导序列特异的目标基因


Figure 6 Effect of CAR knockdown on UGT1A1 protein expression. A: HepG2 cells were transfected with negative control (50
nmol·L−1) and treated with 2 mmol·L−1 PB, 25 μmol·L−1 PA and 25 μmol·L−1 PC for 72 h; B: HepG2 cells were transfected with CAR
siRNAs (50 nmol·L−1) and treated with 2 mmol·L−1 PB, 25 μmol·L−1 PA and 25 μmol·L−1 PC for 72 h. Total protein was obtained and
the protein level was determined by Western blotting. n = 3, x ± s. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05
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CAR 沉默过程, 迅速阻断基因活性, 对 HepG2 细胞
中特定 CAR mRNA 进行降解, 构建低表达 CAR 的
HepG2 细胞, 用于短时间的基因沉默研究。结果显示,
经 PA 与 PC 处理低表达 CAR 的 HepG2 细胞 72 h 后,
PA 与 PC 对 UGT1A1 mRNA 和蛋白表达诱导作用降
低甚至消失。这些结果提示 PA 和 PC 可能通过 CAR
通路, 诱导 HepG2 细胞中 UGT1A1 基因和蛋白表达。
随着对 UGT1A1 功能、调控及表达的进一步认
识, 已经有大量文献报道核受体超家族转录因子, 如
孤儿核受体包括孕烷 X 受体 (PXR) 和组成型雄烷核
受体 (CAR)[15, 16]、脂肪酸受体 (PPARs)[17]、胆汁酸
受体 (FXR)、氧固醇受体 (LXR)、芳香烃受体 (AhR)[18]
以及核转录因子 (Nrf2)[19]等都参与了对 UGT1A1 的
调控作用。本课题的研究表明 CAR 参与了 PA 和 PC
对 UGT1A1 mRNA 和蛋白的表达调控过程, 但是 CAR
与其他核受体之间的交叉协同作用, 以及核受体与
其他转录调节因子之间的相互作用, 是否也参与了
PA 与 PC 对 UGT1A1 的转录调节过程, 值得继续深
入研究。
综上所述 , 白花前胡甲素、丙素可显著上调
UGT1A1 基因和蛋白的表达水平, 核受体 CAR 在此
调控过程中发挥了一定的作用。提示白花前胡甲素、
丙素通过影响 UGT1A1 而与其他药物产生相互作用
的潜在可能。
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