全 文 ：(1)超高压技术的提取率最高 ,可达 24.28%。
比传统水回流法增加 1.6%,比现代提取技术超声
法增加 6.7%。
(2)超高压技术的提取时间非常短 ,仅仅为 2
min。操作简单 ,提取液杂质少 ,易于分离纯化 。
(3)超高压技术提取节能 。
表 5　 不同提取方法的比较
提取方法 提取工艺 提取率 /%
水回流提取法 浸泡 1h,回流 1.5h 23.89
超声波提取 浸泡 1h,超声 1h 22.66
超高压技术 最优操作工艺 24.28
3　结论
(1)本文首次采用超高压技术提取黄芪多糖 ,
利用均匀设计的试验方法得到最优操作工艺参数:
提取压力 350 MPa,液固比 60 mL/g,浸泡时间 5 h,
保压时间为 2 min,提取率能达到 24.2%以上。
(2)超高压技术提取黄芪多糖与水回流法和超
声波提取法相比较 ,具有提取率高 ,提取时间短 ,工
艺操作简单 ,能耗低 ,提取液杂质少 ,容易分离纯化
等特点 。另外 ,超高压技术是在常温下进行提取的 ,
使黄芪多糖不会因热效应而损失或降低其生物活
性。
(3)本研究为其他天然产物有效成分的提取提
供了一种新技术 、新工艺 ,同时为黄芪多糖的综合利
用提供了可靠依据 , 在生产应用上具有现实意义。
参考文献:
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响应面法纯化刺山柑叶黄酮的研究
李国庆 , 　李　佳 , 　顾晶晶 , 　张　宏 , 　苏力坦·阿巴白克力＊
(新疆大学 生命科学与技术学院 , 新疆 乌鲁木齐 830046)
收稿日期:2008-09-12
作者简介:李国庆(1979-),男 ,硕士生 ,专业方向:生化制药 , E-mail:liguoqing835-2004@163.com
＊通讯作者:苏力坦·阿巴白克力(1958-),男 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要研究植物生理生化。 E-mail:sultan816@ 163.com　Tel:(0991)
8582901
关键词:刺山柑;总黄酮;纯化;响应面分析
摘要:目的:研究 AB-8大孔树脂纯化刺山柑叶总黄酮的工艺条件及参数 , 对总黄酮吸附解吸工艺条件进行优化。 方法:
采用响应面法建立树脂法纯化刺山柑叶总黄酮二次多项回归模型方程 , 并进行回归分析。结果:吸附最佳工艺条件为:
吸附速率 1.5 mL/min, pH值 3.3,上样液浓度 1 mg/mL;解吸最佳工艺条件为:乙醇浓度 70.00%, pH值 6.7,解吸剂量
6BV。结论:经超声波辅助提取并通过大孔吸附树脂纯化后 , 刺山柑叶产品中总黄酮含量可达 65%。该方法简单可行 ,
精制效果好 , 适合于工业化生产。
中图分类号:R284.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2009)09-1363-05
　　刺山柑为白菜花科山柑属 ,又名老鼠瓜 ,野西
瓜 ,维吾尔等民族称其缒果藤 。既可野生生长又能
培植 ,并兼有医药和芳香性特性[ 1] 。它是一种多刺
的 ,俯卧的 ,多年生的小灌木 ,广泛分布于东半球 。
我国新疆 、甘肃 、内蒙古 、西藏等省区均有分布 ,沙区
仅产 1属 1种 ,新疆各沙区有分布 ,以吐鲁番盆地沙
漠最多[ 2] 。他的医学性能在远古时代就被发现 [ 3] ,
其果实﹑根﹑叶子用来治疗痛风 ,在传统的伊朗医
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学中用来作为利尿剂 、收敛剂和滋补品 [ 1, 4] 。
大孔吸附树脂是近十年来发展起来的一类有机
高分子聚合物吸附剂 ,它具有物理化学稳定性高 、吸
附选择性独特 、不受无机物存在的影响 ,广泛用于生
化和天然物质的分离纯化 [ 5] 。作者选用 4种不同类
型吸附树脂对刺山柑叶中黄酮粗提物进行吸附解
吸 ,经筛选得到 AB-8型树脂较适宜于刺山柑叶黄
酮粗提物的纯化 ,并应用响应面法对其纯化条件做
了进一步研究。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　刺山柑叶子
采于新疆吐鲁番市南郊 ,海拔 35 m,经鉴定为
白菜花科山柑属刺山柑叶子(CapparisspinosaL.)。
芦丁对照品(中国药品生物制品检定所 ,批号 081-
9003)。
1.1.2　主要试剂和仪器
大孔吸附树脂:AB-8 , D072,天津市光复精细
化工研究所;732型阳离子交换树脂 , 717型阴离子
树脂 ,上海杨浦化工有限公司 。化学试剂均为分析
纯 。玻璃层析柱似 1 cm×30 cm,上海青浦沪西仪
器厂。 SIGMA3K30离心机 ,德国 SIGMA公司。
1.2　实验方法
1.2.1　标准曲线的绘制
精密称取在 120 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照
品 0.025 g,置于 100 mL的量瓶中 ,加 60%乙醇至
刻度 ,摇匀。吸取已制备的对照品溶液 0、2.0、3.0、
4.0、5.0、6.0、7.0mL,分别置于 25mL具塞量瓶中 ,
各加 5%亚硝酸钠 1.0 mL, 混匀 , 放置 6 min,加
10%的硝酸铝 1.0 mL,放置 6 min,加 4%的氢氧化
钠 10mL,再加乙醇至刻度 ,摇匀 ,放置 15 min,用分
光光度法在 X=510 nm处测定吸光度 ,用最小二乘
法作线性回归得芦丁浓度(X)与吸光度(Y)的关系
曲线的回归方程式:Y=0.012 4X-0.005 5, R2 =
0.999 8,说明在 0.02 ～ 0.07 mg/mL范围内线性关
系良好 。
1.2.2　黄酮粗提液的制备
称取刺山柑叶干粉 500 g,以 70%乙醇进行超
声提取 。抽滤得提取液 ,进行浓缩之后加水于 4 °C
温度下静止 24 h, 取上清液进行离心 (5 000 r/
min),得上清液黄酮含量为 2.12mg/mL。备用 。
1.2.3　静态吸附与解吸
称取 5.0 g预处理树脂于 100 mL三角瓶中 ,加
一定浓度的黄酮粗提液 100 mL,振荡 24 h,过滤得
滤液 ,测其黄酮浓度。取出吸附饱和的树脂加入
70%乙醇洗脱 ,同样温度条件下振荡 24h,过滤得滤
液 ,测其黄酮浓度。计算单位树脂吸附量和洗脱量 ,
比较各树脂的吸附性能。综合比吸附量和洗脱率 ,
选用 AB-8型树脂作为较适宜的填料进行后续试验
的研究。
1.2.4　动态吸附与解吸
常规湿法装柱 ,将一定体积 、一定浓度的粗提液
注入树脂柱中 ,待样品溶液全部通过树脂柱后用去
离子水洗至流出液基本无色时 ,加入一定体积的洗
脱剂 ,收集洗脱液 ,检测其浓度 ,然后将洗脱液经旋
转蒸发浓缩 ,真空干燥 ,称量质量 ,计算后可得黄酮
纯度与得率。
1.2.5　实验设计与数据处理
试验采用在单因素实验的基础上应用响应面设
计 ,数据处理采用 Minitab15.1.0.0软件 。
2　结果与讨论
2.1　黄酮纯化工艺优化　
2.1.1　Box-Benhnken试验设计与结果分析
根据文献记载 ,原液 pH值 、上样溶液浓度 、流
速等因素都影响树脂吸附 ,而解吸时受洗脱液浓度
及容量和酸碱度影响。根据 Box-Benhnken中心组
合实验设计原理 ,综合本实验室单因素试验 ,分别采
用三因素三水平的响应面分析方法来优化黄酮的吸
附和解吸 ,见表 1、表 2。
表 1　 吸附试验因素水平表
因素 水平-1 0 +1
流速 /(mL/min) 1 2 3
pH值 1 3 5
上样液浓度 /(mg/mL) 0.56 1.12 1.68
表 2　 洗脱试验因素水平表
因素 水平-1 0 +1
乙醇浓度 /% 45 70 95
pH值 4 7 10
解吸剂量 /BV 3 5 7
　　利用 Minitab15.1.0.0软件对表 3、表 4中试验
数据进行多元回归拟合 。模型的校正决定系数分别
为 Adjr2 =0.980 4, Adjr2 =0.994 4,说明两模型能
分别解释 98.04%和 99.44%响应值的变化 ,仅有很
少量不能用此模型来解释 ,说明回归方程的拟合程
度较好 ,试验误差小 ,可以用此模型对树脂法纯化刺
山柑叶黄酮工艺进行分析和预测 。回归模型各项的
方差分析结果还表明 ,一次项 、二次项都有较高显著
影响 ,所以响应值的变化相当复杂 ,各个具体试验因
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子对响应值的影响不是简单的线性关系。
表 3　 吸附试验安排及结果
试验号 X1 X2 X3 吸附率 Y/%
1 0 -1 1 78.790
2 1 -1 0 79.445
3 -1 0 -1 84.995
4 -1 1 0 84.941
5 0 1 -1 83.034
6 0 1 1 82.351
7 0 0 0 86.450
8 0 0 0 86.523
9 1 1 0 78.456
10 -1 -1 0 83.125
11 0 -1 -1 82.091
12 1 0 -1 80.579
13 0 0 0 86.712
14 0 0 0 86.911
15 0 0 0 86.825
16 -1 0 1 83.421
17 1 0 1 78.716
表 4　 洗脱试验安排及结果
试验号 X1′ X2′ X3′ 吸附率 Y′/%
1 1 1 0 75.783
2 0 1 -1 85.444
3 0 0 0 94.040
4 -1 0 -1 90.306
5 1 0 1 88.635
6 0 0 0 94.120
7 -1 1 0 87.794
8 -1 0 1 91.675
9 0 1 1 84.373
10 0 -1 -1 85.901
11 0 0 0 94.580
12 -1 -1 0 79.478
13 1 0 -1 90.528
14 0 0 0 94.230
15 0 -1 1 89.145
16 1 -1 0 89.189
17 0 0 0 94.210
表 5　 黄酮吸附参数数学回归模型分析及各项作用显著性检验
方差来源 ν 平方和 均方和 F值 显著性 项 ν t P 显著性
一次项 3 53.351 9 17.784 0 101.39 ＊＊
二次项 3 86.249 3 28.749 8 163.91 ＊＊
交互项 3 2.630 4 0.876 8 5.00 ＊
模型 9 142.231 6 15.803 5 90.10 ＊＊
残差 7 1.227 8 0.175 4 -- --
失拟项 3 1.07 5 0.358 3 0.938 0.028
纯误差 4 0.152 9 0.038 2 -- --
总和 16 143.459
r2 =0.991 4 Adjr2 =0.980 4
常量 1 462.812 0.000 ＊＊
X1 1 -16.196 0.000 1 ＊＊
X2 1 3.656 0.008 ＊＊
X3 1 -5.336 0.002 ＊＊
X21 1 -12.386 0.000 1 ＊＊
X22 1 -13.054 0.000 1 ＊＊
X23 1 10.795 0.000 ＊＊
X1X2 1 -3.349 0.012 ＊
X1X3 1 -0.226 0.828
X2X3 1 1.932 0.095
表 6　 黄酮洗脱参数数学回归模型分析及各项作用显著性检验
方差来源 ν 平方和 均方和 F值 显著性 项 ν t P 显著性
一次项 3 16.924 5.641 35.38 ＊
二次项 3 315.039 105.013 658.62 ＊＊
交互项 3 125.276 41.759 261.90 ＊＊
模型 9 457.240 50.804 318.64 ＊＊
残差 7 1.116 0.159 -- --
失拟项 3 0.945 0.315 0.737 0.042
纯误差 4 0.171 0.043 -- --
总和 16 458.356
r2 =0.997 6 Adjr2 =0.994 4
常量 1 527.714 0.000 ＊＊
X1′ 1 -4.532 0.003 ＊＊
X2′ 1 -9.137 0.000 1 ＊＊
X3′ 1 1.460 0.188
X1′2 1 -18.255 0.000 ＊＊
X2′2 1 -39.171 0.000 ＊＊
X3′2 1 -2.043 0.080
X1′X2′ 1 -27.200 0.000 ＊＊
X1′X3′ 1 -4.085 0.005
X2′X3′ 1 -5.403 0.001 ＊
　　注:＊号表示显著 F0.01(9, 5)=10.16, F0.05(9, 5)=4.77
　　由回归方程系数显著性检验可知(表 5),模型
中除交互项 X1X3、X2X3项对 Y不显著外 ,其余项的
影响均有显著或极显著影响 (P>0.05)。其中 ,吸
附速率 、pH值 、上样液浓度对吸附操作影响的显著
性顺序为:吸附速率 >上样液浓度 >pH值 。由表 6
可知 ,模型中除一次项解吸剂量 X3′、二次项 X3′2、交
互项 X1′X3′对 Y′不显著外 ,其余项的影响均有显著
或极显著影响(P>0.05)。其中 ,乙醇浓度 、pH值 、
解吸剂量对解吸操作影响的显著性顺序为:pH值
>乙醇浓度 >解吸剂量 。各因素经回归拟合后 ,优
化回归模型为:
Y=86.684 2 -2.398 3X1 +0.541 4X2 -
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0.790 1X3 - 2.528 1X21 - 0.701 2X1X2 -
0.047 2X1X3 - 2.664 3X22 + 0.404 5X2X3 -
2.203 3X23
Y′=94.236 0 -0.639 7X1′-1.289 9X2′+
0.206 1X3′-3.552 4X1′2 -5.430 5X1′X2′-
0.815 5X1′X3′-7.622 6X2′2 -1.078 7X2′X3′-
0.397 6X3′2
式中 , Y为黄酮吸附率%;X1为吸附流速 mL/
min;X2为 pH值;X3为上样液浓度 , mg/mL;Y′为黄
酮洗脱率%;X1′为乙醇浓度%;X2′为洗脱时 pH值;
X3′为洗脱时乙醇用量 , BV。
响应曲面法是一种优化生物过程的统计学实验
设计方法 ,采用该法不仅可以建立连续变量曲面模
型 ,对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价 ,
确定最佳水平范围 ,而且所需的试验组数相对较少 ,
可节省人力物力 ,因此该法已被成功地应用于各种
各样的生物优化过程中 ,但用于优化树脂法精制工
艺条件的研究国内外尚未见报道[ 6] 。
2.1.2　因素间的交互作用
根据回归方程利用 Minitab15.1.0.0软件作不
同因子的响应面分析图和等高线图 ,各个因子及其
交互作用对黄酮吸附率和洗脱率的影响结果可通过
图 1 ～ 6直接反映出来 。
图 1　吸附速率与 pH值对吸附率影响的响应面
图 2　吸附速率与 pH值对吸附率影响的等高线
　　从图 1和图 2响应面图和等高线图可以看出在
样液浓度为 1.12mg/mL时 ,吸附速率与 pH值的变
化对黄酮吸附率的交互作用显著 。当 pH值不变 ,
吸附速率在 1 ～ 3 mL/min范围内变化时 ,随着吸附
速率的增大 ,树脂对黄酮吸附率即响应值 Y随之减
小 ,但在吸附速率在 1 ～ 2 mL/min时 Y处于稳定状
态;当吸附速率不变时 , pH值增大或减小 ,响应值 Y
都随之降低。
　　从图 3和图 4响应面图和等高线图可以看出在
pH值为 3时 ,样液浓度与吸附速率的变化对黄酮吸
附率的交互作用不显著 。
图 3　吸附速率与样液浓度对吸附率影响的响应面
图 4　吸附速率与样液浓度对吸附率影响的等高线
图 5　乙醇浓度与 pH值对洗脱率影响的响应面
　　比较两组图(图 5、图 6)可知 , pH值对洗脱率
的影响显著 ,表现曲线陡峭;而乙醇浓度表现平坦
些 ,这也与单因素试验一致。而解吸剂量对洗脱率
影响不显著 ,图略。
为了进一步确证最佳点的值 ,对回归方程取一
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图 6　乙醇浓度与 pH值对洗脱率影响的等高线
阶偏导等于零并整理得:求解方程组得 X1 =
-0.494 3, X2 =0.154 5, X3 =-0.159 8, X1′=
-0.073 0, X2′=-0.091 0, X3′=0.457 5,即大孔树
脂对刺山柑叶黄酮的最佳吸附条件为流速 1.51
mL/min、pH值 3.31、上样液浓度 1.03 mg/mL时 。
最佳洗脱条件为乙醇浓度 68.90%、pH值 6.73、解
吸剂量 5.91BV。在此条件下 ,吸附率的理论值可达
87.381 9%,洗脱率的理论值为 94.612 5%。
为检验 RSM分析法的可靠性 ,采用上述最优提
取条件进行黄酮的分离纯化试验 ,同时考虑到实际
操作的便利 ,将吸附的最佳条件修正为流速 1.5
mL/min、pH值 3.3、上样液浓度 1.0 mg/mL,洗脱的
最佳条件修正为乙醇浓度 70%、pH值 6.7、解吸剂
量 6BV时 ,实际测得的吸附率为 86.32%,洗脱率为
93.73%,与理论预测值相比相对误差在 1%左右。
3　结论
将响应面分析(RSM)应用于大孔树脂分离纯
化刺山柑叶黄酮工艺的研究 ,采用合理的试验设计
对纯化工艺进行全面研究 ,依据回归分析确定各工
艺条件的影响因子 ,从而求得最佳纯化工艺条件 ,即
吸附的最佳条件为流速 1.5 mL/min、pH值 3.3、上
样液浓度 1.0 mg/mL,对吸附操作影响的显著性顺
序为:吸附速率 >上样液浓度 >pH值。洗脱的最佳
条件为乙醇浓度 70%、pH值 6.7、解吸剂量 6BV,对
解吸操作影响的显著性顺序为:pH值 >乙醇浓度
>解吸剂量。将洗脱物浓缩 、干燥 、称量 ,其黄酮纯
度超过了 65%。该方法简单可行 ,适合于工业化生
产。
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