全 文 ：华西药学杂志W CJ· PS　2010, 25(6)：685 ～ 687 　　
作者简介:王雁南(1984―),女 ,正攻读药理学专业的硕士学位。 Email:wangzhuzhu1984@gmail.com
＊通信作者(Correspondentauthor), Email:dujr07@gmail.com
藁本内酯对脑缺血再灌注大鼠的作用及其抗炎机制的研究
王雁南 ,杜俊蓉＊
(四川大学华西药学院 , 四川 成都 610000)
摘要:目的　观察藁本内酯对再灌注局灶性脑缺血损伤大鼠模型的神经保护作用及其炎症因子的调控。方法　采用局部脑
血流监测 , 建立线栓法大鼠脑缺血再灌注(tMCAO)模型。 SD大鼠随机分为假手术组 、溶媒对照组和药物治疗组。除假手术
组外 , 于再灌注后 0、 3h分别 ip给予 3%吐温 80溶媒 、20 mg·kg-1藁本内酯。缺血 2 h后再灌注 , 24 h后进行神经功能评分 ,
经 TTC染色法测定脑组织梗死体积 , 并在实验过程中监测脑局部血流的下降和再灌注情况。给药后 24 h, 对大鼠脑组织进行
免疫组织化学实验分析统计 ,从蛋白水平上观察藁本内酯对炎症因子 NF-κB的控制作用。 结果　藁本内酯能显著改善
tMCAO大鼠神经功能(P<0.01),给药组与溶媒组比较 , 脑梗死体积明显缩小(P<0.01), 炎症因子 NF-κB的蛋白表达量明
显减少(P<0.01)。结论　藁本内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤有显著保护作用并明显减少炎症反应中相关因子的蛋白
表达。
关键词:脑缺血再灌注;藁本内酯;炎症因子;脑血流;神经保护
中图分类号:R96　 文献标志码:A　 　文章编号:1006-0103(2010)06-0685-03
StudyontheefectofZ-ligustilideonratswithtMCAOandthemechanismofitsanti-
inflamatory
WANGYan-nan, DUJun-rong＊
(WestChinaSchoolofPharmacy, SichuanUniversity, Chengdu, Sichuan, 610041P.R.China)
Abstract:OBJECTIVE　ToinvestigatetheefectofZ-ligustilideonratswithtransientcerebralischemiaanditsregulationof
correlativeinflammatoryfactorinischemiccascade.METHODS　Reformedfilamentmodelofmiddlecerebralarteryocclusionwas
made.Spraguedawleyratsweredividedintogroupsofsham, vehicle-control, administereddosewith8 ratspergroup.Apartfrom
Shamgroup, ratsinothergroupsweregivenvehicle(3% Tween80)orZ-ligustilideof20 mg·kg-1 attimepointof0 h、 3 hafter
reperfusion.After2 hoffocalischemia, filamentwaswithdrawntoletreperfusionand24 hlater, neurologicalfunctionofratsand
analysisofcerebralinfarctionwithTTCwereproceeding.Furthermore, cerebralbloodflowwasdetectedduringischemiaand
reperfusion.Afterestablishmentofanimalmodelsandreperfusion24h, immunohistochemistrywereusedtoanalyzeinflammatoryfactor
NF-κBinproteinlevel.RESULTS　Z-ligustilidereducedcerebralinfarctionofratswithtransientcerebralarteryocclusion(P<
0.01)andameliorateneurologicalfunctionofrats(P<0.01).Moreover, itinhibitedtheexpressionofNF-κBfromproteinlevel
(P<0.01).CONCLUSION　Z-ligustilidehasaneuroprotectiveefectintransientmiddlecerebralarteryocclusionandsuppresses
theexpressionofrelevantinflammatoryfactorNF-κB.
Keywords:tMCAO;Z-Ligustilide;Inflammatoryfactor;Cerebralbloodflow;Neuroprotection
CLCnumber:R96　　　 Documentcode:A　 　ArticleID:1006-0103(2010)06-0685-03
　　脑卒中是一种突发的脑血液循环障碍性疾病 ,
其发病率 、致残率和死亡率都较高。脑卒中分为脑
出血 、蛛网膜下腔出血 、脑动静脉畸形伴随的颅内出
血和脑梗死 4种 ,出血性脑卒中在中国约占全部卒
中的 25%左右 ,脑梗死约占 75%左右 [ 1] 。缺血性脑
卒中(脑梗死)在级联反应的初始阶段 ,能量耗竭 ,
离子失衡 ,细胞膜出现去极化 ,钙离子超载 ,谷氨酸
递质过度释放造成兴奋性毒性 。钙依赖性酶的激活
以及自由基形成等造成氧化损伤 。之后 ,小胶质细
胞被激活产生炎症因子 ,外周白细胞透过血脑屏障
进入中枢系统引起炎症 ,进一步加重细胞损害 ,最
终 ,细胞以程序性死亡 ———凋亡或坏死结束通路。
缺血性脑卒中的临床治疗是恢复供血供氧 ,抑制缺
血部位的炎症反应及维持神经元结构与功能的完整
性。为此 ,研究了藁本内酯对缺血级联反应中炎症
环节的控制。
1　实验部分
1.1　仪器 、试药与动物
激光双光束多普勒血流仪(南京大学)。藁本
DOI :10.13375/j.cnki.wcjps.2010.06.048
内酯(香港理工大学 ,纯度:98.5%);NF-κB兔多
克隆一抗 、SABC试剂盒 、DAB试剂盒(武汉博士德
生物工程有限公司);其余试剂为分析纯 。♂SD大
鼠(华西实验动物中心),体重 280 ～ 320 g。
1.2　方法与结果
1.2.1　动物的分组与给药　♂SD大鼠 ,饲养室保
持 25 ℃, 12/12 h昼夜节律 ,自由进食。造模成功
后 , 24只大鼠随机均分成假手术组 、溶媒模型组 、给
药组。给药组于再灌后 0、3h时 ip20mg·kg-1藁本
内酯 ,模型组给予同体积的 3%吐温 -80溶媒 。所
有大鼠在实验过程中自由取食 、饮水 ,在光照 ,饲料 ,
环境温度等生活条件上均无差异。
1.2.2　大鼠脑缺血再灌注(tMCAO)模型的建立　
按文献方法[ 2]制备大脑中动脉局灶性缺血模型 。
SD大鼠禁食 12h后 , ip3.5mL·kg-1 10%水合氯醛
麻醉 ,仰卧固定在手术台上 ,用 75%乙醇给颈部皮
肤消毒 ,经颈部正中切口 ,小心分离右侧颈总动脉
(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉 (ICA),在距
ICA、ECA分叉 5 mm处暂时结扎 CCA,在 ECA根部
结扎 ECA。在距离 ICA、ECA分叉 5 mm的 CCA上
剪一 “V”形切口 ,缓慢插入制备好的尼龙线 (身径
0.30mm,头径 0.40 mm),使尼龙线进入 ICA,并向
前推进约 20mm,结扎 ICA上预留的丝线 ,防止出血
和尼龙线滑出。松开 CCA结扎 ,造成缺血后 2 h,重
新麻醉大鼠 ,并缓慢拉出尼龙线再灌注。假手术组
尼龙线插入 ICA的深度为 10 mm。
1.2.3　神经功能的评分　缺血 2 h和再灌注 24 h
后 ,参照 MenziesSA[ 3]的标准进行神经功能评分。 0
分无任何功能缺陷;1分对侧前肢蜷曲不能伸展;2
分牵拉大鼠前肢 ,对侧肌力明显降低;3分动物可以
向两侧转弯 ,但牵拉尾巴只能转向对侧;4分行走时
自动向对侧追尾转圈 。藁本内酯给药组大鼠的神经
功能在再灌注 24 h后为 1.62±0.74分;而模型组
大鼠为 3.62±0.52分 ,相比较有显著性差异 (P<
0.01)。
1.2.4　脑梗死体积的测定　缺血再灌注 24 h的神
经功能评分后 ,以过量 10%水合氯醛麻醉大鼠 ,开
胸暴露心脏 ,将穿刺针经左心室插入升主动脉 ,切开
右心耳 ,用 200 mL生理盐水快速灌注 ,然后断头取
脑 ,低温冷冻后行冠状切片 ,片厚 2 mm,在 37 ℃水
浴中 ,用 0.2% TTC染色 15 min,染色后置 4%甲醛
溶液中固定 24h。采用 Image-ProPlus5.02图像
分析软件分析梗死体积。白色区域为梗死区 ,红色
区域为非梗死区域(图 1)。大脑中动脉缺血 2 h,
再灌注 24 h造成模型组大鼠脑梗死百分比为
14.68±2.09,给药组脑梗死百分比为 7.60 ±3.51
(P<0.01),与模型组相比 ,给药组大鼠的大脑中动
脉血栓造成脑梗死百分比减少了 48.23%。
图 1　TTC染色的脑冠状片(梗死区域为白色 ,正常组织红染)
Fig1　RepresentativephotographsofTTC-stainedcoronalbrain
sections(Thelesionofthecerebralinfarctionwasvisualized
aswhiteincontrasttonormalred-stainedareas)
1.2.5　NF-κB免疫组化的检测　按 “ 1.2.2”项制
备大鼠 tMCAO模型并分组给药 。再灌后 24 h,用水
合氯醛麻醉大鼠 ,开胸暴露心脏 ,将穿刺针经左心室
插入升主动脉 ,切开右心耳 ,依序用 37℃生理盐水 ,
4%多聚甲醛灌注 ,然后断头取出大脑组织置 10%
中性福尔马林中 ,常温固定 12 h[ 4] ,行梯度乙醇脱
水 ,常规石蜡包埋 ,切片厚度为 5 μm[ 5] 。切片进行
免疫组织化学染色 ,检测相关炎性因子 NF-κB。
切片于 60 ℃烘烤一晚 , 逐一放入二甲苯 、100%、
95%、80%、70%乙醇进行脱蜡和脱水 , 60 ℃烘烤 30
min,用去离子水两次漂洗 ,置于 3% H2O2避光封闭
20 min。去离子水漂洗 3次后 ,将切片置 pH6枸橼
酸缓冲液中 ,采用微波加热方式修复抗原。修复完
全后 ,以 pH7.2PBS两次漂洗 ,吸尽切片上多余的液
体 ,加 5% BSA进行封闭(封闭需在 37 ℃饱和 PBS
中 2 h)。取出切片 ,甩去多余的液体 ,加入一抗(一
抗由 pH7.2PBS以 1：50进行稀释)。加入量为每
切片 40μmol·L-1。于 4 ℃冰箱中过夜(约 12 h),
用 pH7.2 PBS漂洗后加生物素化羊抗兔 IgG, 37 ℃
饱和 PBS中放置 1 h,再用 pH7.2PBS漂洗 ,甩去多
余液体后 ,加入 SABC,于 37 ℃饱和 PBS液中孵育
30 min;甩去多余液体 ,进行 DAB染色(DAB染色液
为 1 mL去离子水分别加入 A、B、C液各 1滴)。加
入量为每切片 20 μL,染色时间十几秒至几十秒不
等 ,至显微镜下观察出现棕色背景时 ,清水终止反
应。滴加苏木素(每切片 50μL)轻度复染 3min,用
盐酸乙醇分色 ,洗去多余苏木素 ,置 0.2%氨水中返
蓝;梯度乙醇脱水 , 二甲苯透明 , 以中性树胶封
片[ 6] ;封片完成的免疫组织化学切片在成像仪下采
图。保证光源一致的前提下 ,每组每个样本随机取
额顶叶皮层 5个区域 。假手术组炎症因子 NF-κB
686 　 华 西 药 学 杂 志　　　 第 25卷
的蛋白表达量在额顶叶皮层的 IOD=1.224×103 ±
536.02;模型组蛋白表达量的 IOD=3.019 ×104 ±
5.942×103;20 mg·kg-1给药组蛋白表达量IOD=
8.719×103 ±5.466 ×103;给药组(20 mg·kg-1)与
模型组比较 ,有显著性差异(图 2)。
图 2　NF-κB在额顶叶皮层的蛋白表达量(× 400)
Fig2　NF-κBexpressioninthecerebralcortexinducedbytM-
CAOinrats(×400)
(arowsshowpositiveNF-κBimmunoreactivecels)
1.2.6　统计学处理　所有数据以 x±s表示 ,各组
间差异用方差分析(ANOVA检验),两组间比较用 t
检验。
2　讨论
当归有着悠久的治疗心脑血管疾病的历史 ,主
要有效成分由水溶性和脂溶性两部分组成 。藁本内
酯在当归挥发油中的含量最高 。在永久局灶性脑缺
血和再灌注全脑缺血模型的研究中 ,藁本内酯表现
出了显著的神经保护作用;手术缺血 2 h再灌 0、3
h,于腹腔给予 20 mg·kg-1藁本内酯 ,与溶媒模型组
相比 ,能减少脑梗死体积(48.23%),并且能显著改
善神经行为症状;还探讨了脑水肿及动物脑温在脑
缺血后的病理生理过程中起重要作用 [ 7] 。因脑卒
中发生时 ,局部脑血流量降低到基线值以下 ,在脑梗
死的核心区 ,血流降到基线值的 5% ～ 20%,半暗区
的血流量降至基线值的 20% ～ 40%。再灌注后 ,血
流回升至基线值的 70%或以上 [ 8-9] 。
虽然许多不同的机制被引入到卒中环节中 ,但
有更多资料表明:炎症至少可以介导缺血早期的病
症进展 [ 10] 。NF-κB是引发炎症反应的关键因素 ,
是一个普遍存在的多效性转录因子 ,由 NF-κB/Rel
家族成员的同源异源二聚体组成。功能型 NF-κB
是由 p50、p52、RelA(p65)、RelB和 c-Rel蛋白组成
同源二聚体或异源二聚体 ,而其中 p65是 NF-κB
功能的必需成分 ,他与 p50构成的二聚体蛋白质发
挥主要的生理功能。当细胞处于静止状态时 , NF-
κB与其抑制蛋白 IκB以非活性的配体结合存在于
胞浆中而无活性 。NF-κB能够被多种因素诱导而
活化 ,包括细胞因子与氧化应激 [ 11] 。作者曾对　　
NF-κB的蛋白水平表达做了相关性的分析。由文
献[ 12]报道得知:在大鼠缺血 2 h再灌注模型中 ,
NF-κB水平于再灌注后 3 ～ 6 h增加 ,并且再灌注
后 72 h仍然维持高表达。考虑到藁本内酯注射给
药后吸收迅速 [ 13]和炎症因子高水平表达的时间段 ,
选择在再灌后 3 h第二次给予藁本内酯。
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收稿日期:2010-01-10
687第 6期 王雁南 ,等。藁本内酯对脑缺血再灌注大鼠的作用及其抗炎机制的研究