全 文 ：文章编号:1001-4829(2008)02-0346-03
　　收稿日期:2007-09-12
　　基金项目:科技部农业科技成果转化项目(DZEFN215300560)
作者简介:李婷婷(1980-),女 ,云南人 ,研究实习员 ,主要研究
方向为分子植物病理学 , ＊为通讯作者。
昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的
鉴定与提纯及高效价抗血清的制备
李婷婷 ,方　琦 ,丁　铭 ,苏晓霞 ,张丽珍 ,张仲凯＊
(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 ,云南 昆明　 650223)
摘　要:对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳 、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定(ELISA)和电子显微镜技术
(IEM)检测 ,直径大约 28nm,经 TAS-ELISA测定仅与 CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒(Carnationmottlevi-
rus, CarMV)的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化 ,将提纯后的 CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体 ,间接 ELISA测定为
1∶10240。
关键词:麝香石竹斑驳病毒;鉴定;抗血清制备
中图分类号:S681.5　　　文献标识码:A
Identification, purificationandhighefficiencyantiserum
preparationofcarnationmottlevirusinKunming
LITing-tingFANGQi, DINGMing, SUXiao-xia, ZHANGLi-zhen, ZHANGZhong-kai＊
(BiotechnologyandGeneticGermplasmInstituteofYunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650223, China)
Abstract:Avirusisolatedfromcarnationwithmosaicleavesanddiminishflowers.ThroughIEMandimmunodifsiontests, thevirusparticle
wassphericalabout28nmindiameterandwereinbarshapewithantiserumofCarMVbyimmunodifsiontests.Onthebasisofobservedchar-
acteristics, thevirusisolatewasconsideredtobeidenticaltocarnationmotlevirus(CarMV).Higheficiencyantiserumfromimmunedrabbit
waspreparedanddetectedbyindirectELISA, whichtheeficacyis1∶10240.
Keywords:carnationmotlevirus;detection;antiserumpreparation
　　麝香石竹(DianthuscaryophylusLinn)又名康乃
馨(Carnation),是一种深受人们喜爱的鲜切花 。麝
香石竹受多种病毒侵染危害 ,导致花器变小 ,花杂色
和种质退化 ,其中危害普遍的是麝香石竹斑驳病毒
(carnatinvirus, CarMV)。 CarMV属于番茄丛矮病毒
科(Tombusviridae)麝香石竹斑驳病毒属(Carmovir-
us),是其典型成员 , 1955年由 Kasanis记述 [ 1] 。关
于 CarMV传播方式未见明确报道 ,可通过汁液摩擦
接种传染 ,在生产中可能主要通过无性繁殖材料传
播 。自然寄主主要是石竹科植物 ,经人工接种可侵
染 15科 30多种双子叶植物 [ 1] 。麝香石竹和昆诺藜
可用于保存病毒和作提纯用的繁殖寄主。
　　CarMV侵染引起麝香石竹轻度斑驳 ,症状通常
不明显 ,在试管苗和田间植株中病毒含量很高 ,但不
一定表现明显症状。感病植株花朵变小 ,有时引起
花色变异及植株矮化 ,大大降低了观赏价值和经济
价值 。
　　麝香石竹是云南鲜切花的重要种类之一 ,生产
中种苗退化较快 ,为探明其原因 ,本研究对感染麝香
石竹的主要病毒进行了检测鉴定 ,并分离纯化了毒
源 ,制备高效价的抗血清应用于种苗生产的检测 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　感病麝香石竹植株 　采自云南昆明 ,整株
采集保存于 -20℃冰箱内备用。
1.1.2　标准抗原抗体 　用于 CarMV的 ELISA检
测试剂盒 ,由浙江大学周雪平教授提供 。
1.2　方法
1.2.1　 CarMV的检测 　将斑驳症状明显叶片参
照张仲凯等[ 2]的方法进行样品粗汁液负染色 ,置于
JEM10OCX-Ⅱ型透射电子显微镜观察 , PBS-T研磨
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西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2008年 21卷 2期
Vol.21　　No.2
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2008.02.052
的叶片采用三抗体夹心酶联免疫吸附法 (TAS-
ELISA)测定[ 3] 。
1.2.2　CarMV的提纯　取新鲜病叶 ,加等体积(W/
V)的 0.02 MPBS(pH7.6)匀浆 , 3层尼龙纱布过
滤 ,滤液加等体积 CCl4 ,混匀 ,静置 15min, 6000g离
心 10min,上清加 7% PEG, 0.15 MNaCl,溶解 ,静
置过夜 , 10 000 g离心 20 min,沉淀用 0.02 MPBS
(pH7.6)悬浮均匀 , 6000 g离心 10 min,沉淀同上
悬浮 ,重复 3次 ,合并上清 , 35 000 r/min超速离心
2.5h,沉淀用 0.02MPBS(pH7.6)悬浮均匀 , 6000
g离心 10min,合并上清即为提纯病毒制品[ 4] ,经紫
外分光光度计做 260和 280 nm的吸收测定并标定
浓度 ,电镜负染法测相对纯度 , -20 ℃保存。
1.2.3　ELISA检测鉴定 　采用三抗体夹心酶联免
疫吸附法(TAS-ELISA)测定 [ 3] ,在聚苯乙烯微孔反
应板上加标准多克隆抗体 , 37 ℃孵育 3h,抽去多克
隆抗体液 ,用 PBS-T[ 0.02 MPBS(pH7.4)含 0.05
%吐温 20]洗涤 3次 ,每次 3 min;加用 PBS-T研磨
的待测样品 、阳性对照 、阴性对照及空白对照 , 37 ℃
孵育 3 h,抽去抗原液 , PBS-T洗涤 3次;加标准单克
隆抗体 , 37 ℃孵育 3 h,抽去单克隆抗体液 , PBS-T
洗涤 3次;加 HRP标记的羊抗鼠 IgG, 37 ℃孵育 3
h,抽去标记抗体液 , PBS-T洗涤 3次 ,加底物显色剂
[称硝基苯磷酸盐 (sigma)与底物缓冲液配置成 1
mg/mL的底物溶液 ] 37 ℃孵育 30 min后 ,加 0.5 N
H2SO4终止反应 。于酶标仪 405 nm下测光密度值 ,
与阴性对照进行比较 。
1.2.4　CarMV抗血清的制备及效价的测定　选用
2 kg以上健康雄兔作为免疫动物 ,上述提纯病毒稀
释至 1mg/mL,作为免疫抗原 。取 1 mL病毒液于雄
兔耳静脉注射 , 1周后再重复注射 1次 ,依次重复注
射 4周后 ,第 5周剪耳静脉采血。将兔耳静脉采血
后 ,分离血清 , 分装于无菌 PE管中 , 加入 0.1 %
NaN3 , -70 ℃保存备用 。将上述提纯 CarMV制剂
用包被缓冲液稀释至 1∶100倍后包被聚苯乙烯微孔
图 1　病株病原在电镜下观察到的病毒粒体形态
Fig.1　Thevirionformofdiseasedplantwasobservedundere-
lectronmicroscope
图 2　提纯后在电镜下观察到大量的病毒粒体
Fig.2　Alotofvirusparticlesafterpurificationwereob-
servedunderelectronmicroscope
反应板 , 37℃孵育 3h,抽去抗原液 ,用 PBS-T洗涤 3
次 ,加入含 5 %脱脂奶粉的 PBS-T封闭反应板 , 37
℃孵育 1 h,抽去封闭液 ,拍干不洗板 ,加入从 10倍
至 20 480倍按几何倍数稀释的抗血清 , 37℃孵育 2
h,抽去抗体液 ,用 PBS-T洗涤 3次 ,加入底物显色
剂 , 37℃孵育 30 min后 ,加 0.5NH2SO4终止反应。
2　结果与分析
2.1　CarMV分离物的检测鉴定
将斑驳症状明显叶片进行样品粗汁液负染色后经
电镜粗测具有典型粒体形态 ,即等轴粒体 ,直径大约 28
nm, 50 000倍下每视野粒体数达 10个以上 ,经 TAS-
ELISA测定仅与 CarMV标准抗体反应为阳性。
2.2　CarMV的提纯
将采集样品应用电镜负染法和 TAS-ELISA检
测筛选出相对含 CarMV较多的病株 ,用 CarMV标准
抗体进行筛选 ,筛选出的病株病原与 CarMV标准抗
体呈阳性反应 ,在电镜下观察到 CarMV的粒体形态
为等轴粒体 ,直径约 28nm,见图 1。
　　提纯后的 CarMV于紫外分光光度计下测到典
型的吸收峰值 ,见图 2, A260 /A280为 1.58 [ 5] ,在电镜
下观察其相对含量的纯度 ,发现寄主杂质极少 ,病毒
颗粒大量聚集 ,纯化的效率较明显 ,见图 3。
2.3　纯化病毒的进一步鉴定
TAS-ELISA检测结果呈阳性 ,显色效果与标准
图 3　CarMV提纯病毒制剂紫外吸收光谱图
Fig.3　TheUVabsorptionspectrogramforviruspurifiedprepa-
rationofCarMV
3472期 　　　　　　李婷婷等:昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的鉴定与提纯及高效价抗血清的制备
阳性对照一致 ,阴性对照与空白对照均无显色 。依
此结果 ,提纯后的样品鉴定为 CarMV。
2.4　抗血清的制备及效价的测定
将兔耳静脉采血 ,分离血清 ,分装于无菌 PE管
中 ,加入 0.1 %NaN3 , -70℃保存备用 。抗血清效
价的 I-ELISA检测结果表明 ,测定效价达 1∶10240
倍 。
3　讨　论
　　CarMV是麝香石竹的主要病毒之一 ,对昆明地
区大量的麝香石竹种苗和大田生产中病株的检测表
明 , CarMV普遍侵染危害麝香石竹 ,本试验对抽提
缓冲液的 pH值 、必要的添加剂的加入 、有机溶剂的
处理时间等均作了系列比较 ,成功提取了相对较纯
的病毒制剂 ,并制备出高效价的抗血清 ,与已报道的
效价比较。不过 ,从紫外吸收曲线可看出 ,提纯病毒
制剂中含有少量寄主蛋白杂质。因此 ,在抗血清应
用过程中要设法避免非特异性反应。国内曾报道过
经一次 PEG沉淀后密度梯度超速离心法提纯 Car-
MV,得到了 A260 /A280分别为 1.54[ 6]和 1.70[ 7]的病
毒制剂;还报道了采用二轮 PEG沉淀结合高速离心
法提纯 CarMV,得到 A260 /A280为 1.61[ 8] 的病毒制
剂 。本试验采用一次 PEG沉淀结合超速离心法提
纯 CarMV,成功地从病株上分离纯化到 CarMV,病毒
提取制剂的 A260 /A280为 1.58, 同时制备了效价为
1∶10240的抗血清。国内已有报道为 1∶512[ 6] 和
1∶2048[ 8]的抗血清。本试验避免了二轮 PEG沉淀
的麻烦 ,又排除了密度梯度超速离心法的复杂。该
方法制备的抗血清用于省农科院园艺所麝香石竹斑
驳病毒的检测 ,证明质量稳定可靠 。说明用该方法
提纯的病毒制备抗血清和用该抗血清进行部分免疫
学检测是行之有效的。
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(责任编辑　王家银)
348 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷