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(收稿日期:2010 － 11 － 17)
中图分类号:R114，Q260625. 151 文献标识码:A 文章编号:1002 － 3127(2011)01 － 0033 － 04 ·论著·
明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞 PCNA和 BCL-2
蛋白表达的影响
孙赫，钟进义，孟扬
(青岛大学医学院预防医学系，山东 青岛 266021)
【摘要】 目的 研究明日叶(Angelica keiskei Koidz)查尔酮对小鼠肝癌细胞 PCNA 和 BCL-2 蛋白表达的影响。方法
将 50 只皮下接种肝癌 H22 细胞株的小鼠随机分为 5 组，每组 10 只。高、中、低剂量组分别每日经口灌胃给予 40、20
和 5 mg /kg 的查尔酮，肿瘤对照组给予等量生理盐水，连续 10d，环磷酰胺组隔天腹腔注射环磷酰胺 20 mg /kg。取肝癌组
织用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法测各组小鼠肝癌细胞增殖活性，免疫组化法检测各组肝癌细胞增殖细胞核抗原
(PCNA)和凋亡相关蛋白 BCL-2 表达水平。结果 高剂量查尔酮组和肿瘤对照组的肝癌细胞增殖活性分别为(0. 716 ±
0. 018)和(1. 135 ± 0. 032)，差异有统计学意义(P < 0. 05)。高剂量组 PCNA 和 BCL-2 蛋白表达率分别为 28. 33% 和
16. 77%，肿瘤对照组分别为 72. 77%和 65. 17%，差异均有统计学意义(P < 0. 05)。结论 查尔酮可降低小鼠肝癌细胞
PCNA 和 BCL-2 表达水平，对肝癌细胞增殖有一定抑制作用。
【关键词】 查尔酮;小鼠肝癌细胞;增殖活性;PCNA;BCL-2
作者简介:孙赫，硕士研究生，研究方向:卫生毒理学。
通讯作者:钟进义，教授，博士生导师，研究方向:卫生毒理学。
Effect of angelica keiskei koidz chalcone on PCNA and BCL-2
protein expression of mice hepatocarcinoma cells
SUN He，ZHONG Jin-yi，MENG Yang
(Department of Public Health，Medical College of Qingdao University，Shandong，Qingdao 266021，China)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Angelica keiskei Koidz chalcone on the expressions of PCNA and BCL-2 protein in
mice hepatocarcinoma cells. Methods Fifty mice were inoculated with hepatocarcinoma H22 cells and divided into five groups，10 mice per
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group. High，medium and low dosage groups were given 40，20，5 mg /kg / d of chalcone by mouth，respectively. The tumor control group
was given saline by mouth and the cylophosphamide group was given 20 mg /kg cyclophosphamide by intraperitoneal injection every other day.
Ten days later，all mice were sacrificed. The proliferation activities of hepatocarcinoma cells were determined by methy tetrazolium (MTT)
assay，and the levels of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)and BCL-2 protein expression were measured by immunohistochemistry
method. Results The cell proliferation activity of high dose group and tumor control group were (0. 716 ± 0. 018)and(1. 135 ± 0. 032).
The difference was significant (P < 0. 05). The expression levels of PCNA and BCL-2 protein in high dose group were 28. 33% and
16. 77%，respectively，and those of the tumor control group were 72. 77% and 65. 17% . The differences between two groups were
significant(P < 0. 05). Conclusion Chalcone can reduce the expressions of PCNA and BCL-2 protein，and inhibit the proliferative
activities of mice hepatocarcinoma cells.
【Key words】 Chalcone;hepatocarcinoma cell;proliferation;PCNA;BCL-2
“明日叶”学名叫 Angelica keiskei Koidzumi，属伞
形花科二年生或多年生草本植物，原产地在日本伊豆、
八丈诸岛，因含有丰富的维生素、矿物质及微量元素，
具有提高机体免疫力、改善睡眠、延缓衰老的功效而又
名“长寿草”［1］。据国外文献报道，明日叶中的活性成
分查尔酮 (Chalcone)具有抗肿瘤、抗氧化及清除氧自
由基、抗胃溃疡、抗菌、抗炎、抑制磷酸二酯酶、抗 HIV
等多种生物学活性［2-4］。但国内有关查尔酮抗肿瘤方
面的研究报道甚少。本研究采用给荷(H22)肝癌小鼠
经口灌胃查尔酮的方法，测定了 PCNA 和 BCL-2 等指
标，观察查尔酮对小鼠的肝癌细胞增殖活性的抑制作
用。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 动物:健康昆明种小鼠(SPF 级)，6 ～ 8 周龄，
体重 18 ～ 20 g，由山东鲁抗医药实验中心提供，于本实
验室适应性喂养一周后用于试验。肿瘤种鼠为山东省
实验动物中心提供荷(H22)肝癌小鼠，许可证号:
SCXK(鲁)2008-0002。
1. 1. 2 实验样品:明日叶查尔酮由本实验室制备，经
紫外分光光度法测定其纯度 > 90%，查尔酮标准品由
美国 Sigma 公司提供，纯度 > 99%。
1. 1. 3 试剂与仪器:四甲基偶氮唑蓝(MTT)、RPMI-
1640 培养基、胎牛血清购自美国 GiBco 公司;增殖细
胞核抗原(PCNA)单克隆抗体、BCL-2 多克隆抗体、
SABC 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限
公司;瑞典 Rosys Anthos2010 型自动酶标仪;日本
Olympus XDS-1B 型倒置显微镜;照相机购自日本
OLIMPUS 公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 癌细胞接种:无菌取接种 H22 肝癌细胞株第 6
天的小鼠腹水，用生理盐水制备细胞悬液，调节细胞密
度为 1 × 107 个 /ml，于受试动物右前肢腋窝皮下注射
0. 2 ml。
1. 2. 2 动物分组与处理:将已接种瘤细胞的小鼠随机
分为 5 组，每组 10 只。高、中、低查尔酮剂量组分别给
予查尔酮水溶液 40、20 和 5mg /kg，经口灌胃，1 次 / d。
肿瘤对照组按同样方法给予等量生理盐水，连续 10 d。
环磷酰胺组按照 20 mg /kg 剂量腹腔注射，隔天 1 次。
于末次给药后第 2 天将所有小鼠脱颈椎处死，无菌条
件下取肝癌组织备检。
1. 3 检测指标
1. 3. 1 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法测定各组小鼠瘤
细胞的增殖活性:将新鲜小鼠瘤组织剪碎，经消化、过
滤、离心，制成瘤细胞悬液。以含 10 ℅胎牛血清的
RPMI-1640 培养基调节细胞浓度为 1 × 106 /ml，培养于
96 孔板，每孔 0. 1 ml，置 37 ℃、5% CO2 培养箱培养 16
h，用 MTT 法测定细胞增殖活性，用吸光度值(A)表
示，根据公式计算各组查尔酮对小鼠肝癌细胞的增殖
抑制率:抑制率(%)= (肿瘤对照组 － 查尔酮剂量
组)/肿瘤对照组 × 100%
1. 3. 2 PCNA 蛋白表达:用免疫组化法(SABC)按检
测试剂盒说明检测肝癌组织中 PCNA 蛋白的表达。取
瘤组织常规包埋、切片脱蜡水化、3% H2O2 灭酶、微波
修复、PCNA-抗 4 ℃过夜(工作浓度 1 ∶ 50)，二抗孵育
30 min，DAB 显色、脱水、透明和封片。高倍显微镜
(× 400)下，随机取视野观察 PCNA 蛋白的表达水平。
每只动物观察 1000 个肿瘤细胞，记录其中的阳性细胞
数。各组的 PCNA 增殖指数(%)= PCNA 阳性细胞
数 /计数细胞总数 × 100%
1. 3. 3 BCL-2 蛋白的表达:采用 BCL-2 免疫组化试剂
盒，根据上述免疫组化方法检测瘤组织细胞中 BCL-2
蛋白的表达，显微镜观察方法计算 BCL-2 阳性表达
率。
1. 4 统计学方法 采用 SPSS17. 0 统计软件，计量资
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料做单因素方差分析和 q 检验，计数资料做 χ2 检验，
检验水准 α = 0. 05。
2 结果
2. 1 肿瘤细胞增殖活性检测结果 高、中剂量查尔酮
组肝癌细胞增殖活性水平分别为 0. 716 ± 0. 018 和
0. 834 ± 0. 027，均较肿瘤细胞对照组显著降低(P <
0. 05)，其他各组结果见表 1。
表 1 各组小鼠肝癌细胞增殖活性
组别 A 抑制率(%)
肿瘤对照组 1. 135 ± 0. 032 —
查尔酮高剂量组 0. 716 ± 0. 018 * 36. 92
查尔酮中剂量组 0. 834 ± 0. 027 * 26. 52
查尔酮低剂量组 1. 106 ± 0. 038 # 2. 56
环磷酰胺组 0. 079 ± 0. 056 * 40. 18
注:与肿瘤对照组比较，* P < 0. 05;与高剂量组比较，#P < 0. 05。
2. 2 PCNA 蛋白的表达结果 PCNA 蛋白为细胞核内
表达，呈棕黄色的颗粒。本实验肿瘤对照组 PCNA 蛋
白阳性细胞数多，染色深，成棕黄色或棕褐色，呈高表
达(图 1)，高剂量查尔酮组表达水平低于肿瘤对照组
(图 2)。肿瘤对照组和高剂量查尔酮组 PCNA 表达率
分别为 72. 77% 和 28. 33%，差异具有统计学意义
(P < 0. 05)。各组 PCNA 阳性表达率见表 2。
图 1 肿瘤对照组 PCNA 高表达(DAB × 400)
2. 3 BCL-2 蛋白的表达结果 Bcl-2 蛋白主要表达于
细胞浆内，光学显微镜下阳性表达细胞的胞浆中可见
棕黄色颗粒。本实验肿瘤对照组 Bcl-2 蛋白阳性表达
细胞数多，染色深，呈高表达(图 3)，高剂量查尔酮组
染色多呈淡黄色，呈低表达(图 4)。两组的阳性率分
别为 65. 17% 和 16. 17%，差异有统计学意义(P <
0. 05)。各组 BCL-2 阳性表达率见表 2。
3 讨论
图 2 高剂量查尔酮组 PCNA 低表达 (DAB × 400)
图 3 肿瘤对照组 BCL-2 高表达(DAB × 400)
图 4 高剂量查尔酮组 BCL-2 低表达(DAB × 400)
查尔酮广泛存在于自然界中，其化学结构式为1，
表 2 各组小鼠 PCNA 和 BCL-2 的表达
组别
观察
细胞数
PCNA BCL-2
阳性
细胞数
阳性表
达率(%)
阳性
细胞数
阳性表
达率(%)
肿瘤对照组 5 000 3 638 72. 77 3 258 65. 17
查尔酮高剂量 5 000 1 417 28. 33 * 839 16. 17 *
查尔酮中剂量 5 000 2 168 43. 35 # 1 867 37. 32 #
查尔酮低剂量 5 000 3 610 72. 04 # 3 124 62. 55 #
环磷酰胺组 5 000 1 305 26. 11 * 788 15. 77 *
注:与肿瘤对照组比较，* P < 0. 05;与高剂量组比较，#P < 0. 05。
3-二苯基丙烯酮，为多种药用植物如明日叶、红花、甘
草等的有效成分，具有广泛的生物学活性［5］。近年
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来，科学工作者对其抗肿瘤、抗菌、抗炎等生物学活性
的开发上进行了广泛而深入的研究。据报道，查尔酮
可以通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞分裂而抑制乳腺癌
的细胞增殖［6］，从啤酒花中提出的查尔酮是结肠癌和
卵巢癌等细胞的有效抗增殖剂，且可抑制肿瘤细胞株
的细胞生长［7］。但国内未见有明日叶查尔酮对肝癌
细胞增殖活性的抑制作用及其机制的研究报道，本实
验主要是探讨了明日叶查尔酮对肝癌细胞生长的抑制
作用。
细胞增殖活性是反映细胞生理功能和增殖能力的
重要指标，当细胞受到损伤时，首先表现的是细胞增殖
活性的降低。MTT 法是目前国内外测定细胞增殖活
性水平的常用方法［8-9］，测定原理为细胞线粒体琥珀酸
脱氢酶可以还原 MTT 为蓝紫色的甲瓒，其生成量与细
胞的代谢活性密切相关。当细胞受损或死亡时，该反
应可降低或消失。本实验结果，高剂量查尔酮组细胞
增殖活性低于肿瘤对照组和查尔酮中、低剂量组，说明
查尔酮对 H22 肝癌细胞的增殖有抑制作用。本实验
结果与文献报道查尔酮能够抑制肿瘤细胞增殖并诱导
细胞凋亡的研究结果一致［10］。
增殖细胞核抗原(PCNA)是 DNA 多聚酶 delta 的
辅助蛋白，其合成、表达与细胞的增殖密切相关，细胞
静止状态时含量很少，当细胞的增殖活性升高，PCNA
表达增强，PCNA 增殖指数升高，反之则 PCNA 表达减
弱，PCNA 增殖指数降低，是比较公认的反映细胞增殖
状态的重要指标。本实验结果显示，高、中剂量查尔酮
组 PCNA 蛋白阳性表达率较肿瘤对照组显著降低，且
高剂量组低于中剂量组，表明查尔酮有抑制肿瘤细胞
增殖的作用。本项实验结果也与前述 MTT 法测定的
细胞增殖活性结果相吻合。
Bcl-2 家族是对细胞凋亡具有广泛调控作用的一
个基因家族。其中，Bcl-2 是最主要的细胞凋亡抑制基
因，当细胞受到损伤、增殖活性受到抑制或发生细胞凋
亡时，Bcl-2 蛋白的表达水平可降低，多数肿瘤细胞的
Bcl-2 蛋白表达水平升高。本实验结果显示，肿瘤对照
组 Bcl-2 蛋白表达水平最高，而高、中剂量查尔酮组的
表达水平均较肿瘤对照组降低，进一步表明了查尔酮
具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本研究结果证明，查尔酮能够抑制 H22 肝癌细胞
增殖活性，降低 PCNA 和 Bcl-2 蛋白表达水平，对小鼠
肝癌细胞生长有一定抑制作用。
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