全 文 ：第 39卷第 2期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.39, No.2
2 0 1 0年 4月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Apr., 2 0 1 0
不同种群狭叶小羽藓(Haplocladiumangustifolium)
重金属含量及遗传多样性
李倩影 , 曹　同＊ , 于　晶 , 俞鹰浩
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:以上海市狭叶小羽藓居群为实验材料 ,测定不同居群植物体中的重金属元素含量 ,利
用随机扩增多态 DNA标记技术(randomamplifiedpolymorphicDNA, RAPD)对不同浓度重金属
污染下的小羽藓居群的遗传多样性和遗传分化进行了初步分析.结果表明:104个检测位点中
发现 94个多态性位点 ,多态位点百分率为 91.35%,总的居群的 Nei基因多样性指数(H)为
0.2682, Shannon指数(I)为 0.4108,小羽藓种群表现出较高的遗传多样性.总的遗传居群间遗
传分化系数(Gst)为 0.5591,居群内遗传分化系数(Hs)为 0.1182,居群间的变异程度远远大于
居群内的变异程度.将各个样点居群的 Shannon信息指数同重金属含量做相关性分析得出 ,
Shannon信息指数的增加同 Cr含量呈明显正相关 ,表明 Cr胁迫对小羽藓种群的遗传分化有较
大程度的影响.
关键词:苔藓植物;狭叶小羽藓;重金属污染;遗传多样性;RAPD
中图分类号:Q781　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2010)02-0194-06
　　　　　　　　　　
收稿日期:2009-11-15
基金项目:国家自然科学基金(30770141);上海市科委创新项目(08390513800);上海市教委重点项目(07ZZ61).
作者简介:李倩影(1984-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;曹　同(1946-),男 , 上海师范大
学生命与环境科学学院教授 ,博士生导师.
＊通讯作者.
0　引　言
苔藓植物结构简单 ,营养体没有维管组织 ,表面积大 ,其独特的形态和生理特征有利于环境中污染
物质在体内的富集[ 1] ,对环境污染有较强的指示性[ 2] ,被世界各国广泛应用于检测环境 ,特别是应用于
检测重金属污染 [ 3, 4] .以往关于苔藓的重金属研究主要集中在环境指示 、生理生化响应等方面[ 5] ,有关
苔藓植物在重金属污染环境条件下的遗传多样性仅有少数报道 [ 6] .近年来 ,曹同等筛选出抗污染性强
的小羽藓(Haploadium),用于指示上海市的重金属污染和时空变化 ,取得了很好的效果 [ 7, 8] ,为了深入
探讨遗传多样性与重金属环境因子的相关性 ,本研究以小羽藓为材料 ,运用 RAPD技术分析不同重金属
浓度下小羽藓遗传多样性差异 ,为植物在重金属污染条件下的分子生态学研究提供基础资料和科学
依据.
1　材料与方法
1.1　调查范围及材料
根据上海市市区 、市郊 、郊区环境污染逐步减轻的特点 ,选取材料 ,分别代表各个区域的污染水平.
调查样点基本情况见表 1.
　第 2期 李倩影 , 曹　同 , 于　晶 , 等:不同种群狭叶小羽藓(Haplocladiumangustifolium)重金属含量及遗传多样性 　　
表 1　调查样点基本情况 　
序号 样点名称 地理位置 面积(m2) 方位
1 大观园(G1) 青浦区 (120.90°E, 31.07°N) 1.0×106 西郊
2 光启公园(G2) 徐汇区 (121.43°E, 31.19°N) 1.3×104 市中心西部
3 佘山(G3) 松江区 (121.17°E, 31.11°N) 9.0×106 西郊
4 桂林公园(G4) 徐汇区 (121.41°E, 31.16°N) 3.5×104 市区西南
5 复兴公园(G5) 卢湾区 (121.46°E, 31.22°N) 8.9×104 市中心
6 长风公园(G6) 普陀区 (121.39°E, 31.22°N) 4.0×105 市区西部
7 和平公园(G7) 杨浦区 (121.49°E, 31.27°N) 1.8×105 市区东北
8 中山公园(G8) 长宁区 (121.41°E, 31.22°N) 2.1×105 市区西部
9 植物园(G9) 徐汇区 (121.43°E, 31.14°N) 8.0×105 市区西南
　　实验材料为狭叶小羽藓(Haplocladiumangustifolium),隶属羽藓科(Thuidiaceae),小羽藓属(Haplo-
cladium)[ 8] ,在上海地区分布广泛.实验材料于 2009年 4月采自上海市区及市郊的九个公园样点 ,各个
样点随机选取空间相隔 10 m以上的 3个狭叶小羽藓藓丛 ,植物体储存于低温的条件带回实验室 ,
-70 ℃低温冰箱保存 ,供 DNA提取.
1.2　研究方法
1.2.1　植物体重金属含量的测定
将采自同一个公园的不同藓丛狭叶小羽藓混合 ,进行预处理 ,准确称取预处理后的植物体样品 1g,
用 1∶4优级纯 HC1O4和 HNO3混合溶液浸泡 48h,进行 “湿法灰化 ”.然后 ,在通风橱内进行过滤 ,并将滤
液在调温电热板上烘干至呈白色粉末状 ,加 2次蒸馏水溶解 ,定容于 10 mL容量瓶.每个样品均做平行
双样 ,以期平均和比较 ,同时配制空白试剂作为对比.然后采用 ICP光谱仪对样品中的 Cd、Cr、Cu、Pb、Zn
5种重金属元素含量进行测定.
1.2.2　植物体基因组总 DNA提取
采用改良的 CTAB法 [ 9] ,同时摸索适合小羽藓植物基因组总 DNA提取的优化条件 ,提取狭叶小羽
藓植物体基因组总 DNA,所提 DNA经 1%含 0.5g/LEB的琼脂糖凝胶中电泳检测 ,紫外分光光度计测
定其浓度和纯度(A260 /A280).
1.2.3　引物筛选与 RAPD扩增
用优化的 2.5×10-5 LPCR扩增程序对从赛百盛公司购买的 100条随机引物(10 bp)进行筛选 ,结
果筛选出 9条扩增条带清晰 、多态性强 、稳定 、重复性好的引物(其序列见表 2).用筛选好的 9条随机引
物对全部样品的 DNA进行 PCR扩增 , PCR反应总体积为 2.5×10-5 L, 经优化的 PCR扩增程序为:
94℃预变性 2min, 92℃变性 30s, 36℃退火 1min, 72℃延伸 1min,共 42个循环;72℃完全延伸 10min.
扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶(含 5×10-4 mg·mL-1溴化乙锭)中电泳 ,电泳缓冲液为 1×TAE,在紫外
扫描自动成像系统(TanonGIS-2008)下照相 ,保存结果.
表 2　RAPD分析用的 9个随机引物序列 　
引物 序列 引物 序列 引物 序列
SBSA01 CAGGCCCTTC SBSA 10 GTGATCGCAG SBSC01 TTCGAGCCAG
SBSA07 GAAACGGGTG SBSA 12 TCGGCGATAG SBSC15 GACGGATCAG
SBSA09 GGGTAACGCC SBSB19 ACCCCCGAAG SBSD 11 AGCGCCATTG
1.2.4　RAPD扩增数据统计与分析
对照反应产物在凝胶上的对应位置 ,有条带记为 “1” ,无条带记为 “0”,得到 RAPD分析的原始数据
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
矩阵.采用 POPGEN32软件 [ 10]计算多态位点百分率 、Shannon信息指数(I)和 Nei指数(h)用来估算基
因多样性.SPSS13.0软件分析 Nei基因多样性指数与各个重金属含量的相关性.
2　结果与分析
2.1　小羽藓植物体内 5种重金属含量
不同样点小羽藓植物体内 5种重金属含量见表 3.狭叶小羽藓体内重金属 Zn平均含量最高 ,为
255.938 mg·kg-1 ,其中中山公园狭叶小羽藓体内 Zn含量最高 ,为 460.302 mg·kg-1 ,长风公园最低 ,只
有 28.954 mg·kg-1.Cu的富集含量平均为 42.808 mg·kg-1 ,含量最高的为和平公园 ,达到 81.087
mg·kg-1 ,最低的为长风公园 ,为 7.020 mg·kg-1.其中 Cr和 Pb的富集含量较为相近 ,平均为 13.974
mg·kg-1和 15.892 mg·kg-1 , Cr含量最高的为佘山 ,达到 38.880 mg·kg-1 ,最低的为植物园 ,为 0.590
mg·kg-1.Pb含量最高的是光启公园 ,为 26.867 mg·kg-1 ,最低的为长风公园 ,仅为 1.608 mg·kg-1.狭
叶小羽藓体内 Cd的平均含量最低 ,只有 1.504 mg·kg-1 ,光启公园相对含量较高 ,为 3.515mg·kg-1 ,长
风公园最低 ,为 0.166mg·kg-1.
表 3　 5种重金属在小羽藓植物体中的含量 mg·kg-1
样点名称 Cd Cr Cu Pb Zn
大观园 1.522 10.298 17.591 20.536 97.050
光启公园 3.515 26.227 60.871 26.867 220.749
佘山 1.943 38.880 24.000 10.174 343.135
桂林公园 1.646 7.754 70.035 22.551 330.813
复兴公园 1.729 19.593 67.769 24.007 428.957
长风公园 0.166 0.716 7.020 1.608 28.954
和平公园 1.349 12.907 81.087 20.878 353.080
中山公园 1.492 8.801 51.019 14.168 460.302
植物园 0.175 0.590 5.877 2.243 40.404
平均 1.504 13.974 42.808 15.892 255.938
2.2　小羽藓体内重金属含量的聚类分析
利用国际标准软件 PC-ORD,以小羽藓体内 Cd、Cr、Cu、Pb、Zn5种重金属元素含量测定结果为依据 ,对
9个样点进行了最小方差聚类分析 [ 11] .根据聚类分析结果可将 9个样点分为 3个组(图 1):(1)相对污染
严重点 ,包括复兴公园和中山公园 2个样点 ,小羽藓体内重金属含量分别为:Cd1.729 ～ 1.492mg·kg-1 , Cr
8.801 ～ 19.593 mg·kg-1 , Cu51.019 ～ 67.769mg·kg-1 , Pb14.168 ～ 24.007mg·kg-1 , Zn428.957 ～ 460.302
mg·kg-1.此组样点均位于市区 ,由工业 、交通等带来的重金属污染物较多 ,苔藓植物体内的重金属含量相
对较高.(2)污染点 ,包括光启公园 、佘山 、桂林公园 、和平公园 4个样点 ,小羽藓体内重金属含量分别为:
Cd1.349 ～ 3.515 mg·kg-1 , Cr7.754 ～ 38.880mg·kg-1 , Cu24.000 ～ 81.087 mg·kg-1 , Pb10.174 ～ 26.867
mg·kg-1 , Zn220.749 ～ 353.080 mg·kg-1.此组样点均处于市区边缘 ,由工业 、交通等带来的重金属污染物
较 1组为少 ,苔藓体内的重金属含量也相对较低.(3)相对清洁点 ,包括长风公园 、大观园 、植物园 3个样
点.小羽藓体内重金属含量分别为:Cd0.166 ～ 1.522 mg·kg-1 , Cr0.590 ～ 10.298 mg·kg-1 , Cu5.877 ～
17.591mg·kg-1 , Pb1.608 ～ 20.536mg·kg-1 , Zn28.954 ～ 97.050mg·kg-1.此组样点位于上海市区边缘或
远郊 ,远离工业及交通重金属污染源 ,苔藓植物体内重金属含量相对较小.
2.3　小羽藓不同居群基因组 DNA的 RAPD扩增结果
利用 9条引物对 9个不同公园小羽藓的 27个藓丛进行 RAPD扩增 ,得到了较清晰的不同样带.其
中引物 SBSA07对小羽藓的 24个藓丛的扩增结果如图 2所示.在此基础上进行不同种群的遗传多样性
的分析和比较.
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　第 2期 李倩影 , 曹　同 , 于　晶 , 等:不同种群狭叶小羽藓(Haplocladiumangustifolium)重金属含量及遗传多样性 　　
图 1　小羽藓体内重金属含量的 Cluster聚类图
图 2　小羽藓居群 24个藓丛引物SBSA07的 RAPD扩增结果
2.4　遗传多样性分析
利用 9条随即引物对 9个狭叶小羽藓居群共 27个藓丛的 DNA进行分析 ,共检测到 104个位点
(表 4),共发现 95个多态性位点 ,多态位点百分率为 91.35%.9个居群的多态位点百分率以 G3种群最
高 ,为 72.12%,其次为 G4,为 49.01%,最低的为 G1,仅为 4.81%,其他的居群比较接近.总的居群的
Nei基因多样性指数(H)为 0.2682, Shannon指数(I)为 0.4108(表 3),小羽藓种群表现出较高的遗传多
样性.总的遗传居群间遗传分化系数(Gst)为 0.5591,居群内遗传分化系数(Hs)为 0.1182(表 3),居群
间的变异程度远远大于居群内的变异程度.
表 4　小羽藓居群的遗传多样性 　
居群 藓丛数 多态位点数 多态位点百分率(%) Shannon信息指数 Nei基因多样性指数
G1 3 5 4.81 0.0306 0.0214
G2 3 35 33.65 0.3022 0.2110
G3 3 75 72.12 0.4590 0.3205
G4 3 51 49.01 0.3121 0.2179
G5 3 18 17.31 0.1102 0.0769
G6 3 20 19.23 0.1224 0.0855
G7 3 18 17.31 0.1102 0.0769
G8 3 13 12.59 0.0796 0.0556
G9 3 14 13.46 0.0857 0.0598
2.5　小羽藓种群遗传多样性与重金属因子的相关性
利用标准数据分析软件 SPSS13.0对 9个样点小羽藓的 Shannon信息指数及相应 Cd、Cr、Cu、Pb、Zn
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
含量进行相关性分析 [ 8] (表 5).结果表明 ,由 Shannon信息指数计算的狭叶小羽藓种群内的遗传多样性
与 Cr元素呈极显著的正相关(r=0.729, P<0.01),与 Cd、Cu、Pb、Zn呈正相关 ,但相关性不显著(P>
0.05).由 Nei[ 9]指数计算的狭叶小羽藓种群内的遗传多样性和各生态因子的相关性同与 Shannon信息
指数计算的一致.
表 5　 9个狭叶小羽藓种群的遗传多样性与不同的重金属因子含量的相关性 　
重金属因子 Cd Cr Pb Cu Zn
相关性系数 P 0.0512 0.729＊ 0.138 0.121 0.251
　　＊P<0.05
3　讨　论
本研究通过测定的小羽藓体内的重金属含量数据 ,对照 2004年安丽 [ 12]测定的相同样本点小羽藓
体内的重金属含量 ,结果表明各个样点的小羽藓体内的重金属含量均有不同程度的增加 ,由于小羽藓体
内的重金属含量同该元素的环境浓度及沉积率之间具有良好的相关性 [ 13] ,小羽藓体内重金属含量的增
加 ,说明周围环境中的重金属含量也有一定程度的增加 ,环境污染还在继续增加.
9条引物在 9个小羽藓种群中共获得 104个检测位点 ,其中有 95个多态性位点 ,多态位点百分率
为 91.35%,相比较而言 ,小羽藓种群表现出较高的遗传多样性[ 14-16] .总的居群的 Nei基因多样性指数
(H)为 0.2682, Shannon指数(I)为 0.4108,总的遗传居群间遗传分化系数(Gst)为 0.5591,居群内遗传
分化系数(Hs)为 0.1182,居群间的变异程度远远大于居群内的变异程度.9个小羽藓居群间出现较大
的遗传分化 ,其主要原因是有限的基因流导致种群间出现较大的遗传分化 , Wright[ 17]认为种群间基因流
大于 1,则能发挥其均质化作用;反之若小于 1,则表明基因流成为遗传分化的主要原因.不同的基因型
在不同微生境上的适合度相异 ,导致具有相同基因型的个体集聚在较适宜的微生境上 ,从而产生遗传
分化[ 18] .
遗传多样性与重金属因子的相关性统计分析显示了 9个小羽藓居群的 Shannon信息指数的增加同
5种重金属含量成正相关 , Cr含量呈明显正相关 ,即小羽藓体内的 Cr含量越多 ,种群的遗传多样性越
大 ,表明 Cr胁迫对小羽藓种群的遗传分化有较大程度的影响.在重金属胁迫环境选择下 ,小羽藓种群发
生了一定程度的分化与微进化 ,小羽藓较高水平的遗传多样性可能是植物适应重金属胁迫环境的基础.
除此之外 ,影响种群遗传多样性除人为因素外 ,还有物种生物学特性等多种因素 [ 19] .
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Geneticdiversityandheavymetalcontentsofdiferentpopulations
ofthemossHaplocladiumangustifolium
LIQian-ying, CAOTong＊ , YUJing, YUYing-hao
(ColegeofLifeandEnvironmentalSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:TheplantsamplesofdiferentpopulationsofthemossHaplocladiumangustifoliumwerecollectedfromnineparksin
Shanghai.Contentsofheavymetals(Cd、Cr、Cu、Pb、Zn)inthesamplesweredetermined, usingrandomamplifiedpolymorphic
DNAmarkers(RAPD), geneticdiversityandgeneticdifferentiationsofthedifferentpopulationswereanalyzed.Among104testlo-
ci, 94 polymorphiclociwerefound, accountingto91.35%ofthetotaltestloci.ThetotalpopulationsoftheHaplocladiumangusti-
folium, withtheNeigenediversityindex(H)of0.2682, Shannonindex(I)as0.4108, showedhighgeneticdiversity.Thegenet-
icdiferentiationcoefficientamongpopulations(Gst)andwithinpopulations(Hs)are0.5591 and0.1182, respectively.Itim-
pliedthatthedegreeofvariationamongthedifferentpopulationsisfargreaterthanthedegreeofvariationwithinpopulations.Cor-
relationanalysisbetweencontentsofheavymetalsandShannoninformationindexofthedeferentpopulationsshowedthatincrease
oftheShannonindexwaspositivelycorrelatedtoincreaseoftheCrcontent.
Keywords:bryophyte;Haplocladiumangustifolium;heavymetalpollution;geneticdiversity;RAPD
(责任编辑:郁　慧)
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