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文殊兰弱碱性生物碱的抗肿瘤活性研究



全 文 :书第 30 卷 第 2 期
2014 年 4 月
哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报( 自然科学版)
Journal of Harbin University of Commerce ( Natural Sciences Edition)
Vol. 30 No. 2
Apr. 2014
收稿日期:2014 - 01 - 09.
基金项目:黑龙江省研究生创新科研项目(YJSCX2012 - 146HLJ).
作者简介:吴 迪(1988 -),男,硕士,研究方向:肿瘤药理学.
文殊兰弱碱性生物碱的抗肿瘤活性研究
吴 迪1,代岐昌1,2,季宇彬1,2,3
(1.哈尔滨商业大学 生命科学和环境科学研究中心 哈尔滨 150076;2.国家教育部天然抗癌药物工程技术研究中心,
哈尔滨 150076;3.哈尔滨商业大学 药物研究所博士后科研流动站,哈尔滨 150076)
摘 要:研究文殊兰中弱碱性生物碱对不同肿瘤细胞的抑制作用,并筛选出敏感细胞株,观察凋亡形
态; MCF - 7 细胞株、SMMC7721 细胞株、SGC7901 细胞株、HepG - 2 细胞株,MTT 溶液,DMSO,Hoechst
33258 等; 利用 MTT法检测文殊兰弱碱性生物碱对上述肿瘤细胞的抑制作用以及 Hoechst 33258 染色
法观察细胞凋亡的形态学变化; 文殊兰弱碱性生物碱对上述细胞株均有明显的抑制作用,对 HepG - 2
细胞的抑制作用更为明显,给药 72 h后测定 IC50 = 9. 374 323 μg /mL; Hoechst 33258 染色法观察细胞
出现凋亡小体,有凋亡现象发生.文殊兰弱碱性生物碱 MCF - 7 细胞株、SMMC7721 细胞株、SGC7901
细胞株、HepG - 2 细胞株具有不同程度的抑制作用,且呈现一定的剂量依赖性,对 HepG - 2 细胞的抑
制作用最强,表现出良好的抗肿瘤活性.
关键词:文殊兰;抗肿瘤; 生物碱; MTT法; Hoechst 33258 染色法
中图分类号:R285 文献标识码:A 文章编号:1672 - 0946(2014)02 - 0150 - 04
Research on anti-tumor activity of Alkalescent alkaloids from crinum
WU Di1,DAI Qi-chang1,2,JI Yu-bin1,2,3
(1. Center of Research on Life Science and Environmental Science,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;
2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs,Ministry of Education,Harbin University of Commerce,Harbin
150076,China;3. Postdoctoral Programme,Institute of Material Medica of Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)
Abstract:Research the anti-tumor activity of Alkalescent alkaloids from Crinum. And screen
the sensitive cells then observe morphological changes of cell apoptosis;MCF - 7 cell,
SMMC7721 cell,SGC7901 cell,HepG -2 cell,MTT solution,DMSO,Hoechst 33258;ex-
periments could illustrate the use of the drug inhibition of these tumor cells by MTT assay. It
could observe morphological changes of cell apoptosis by Hoechst 33258 staining;Alkales-
cent alkaloids from crinum could inhibit these cells obviously. HepG - 2 cell was inhibited
more sensitive to alkaloids. After dosing 72 h it showed that IC50 = 9. 374323 μg /mL;it can
be seen apoptotic bodies and apoptotic phenomenon by Hoechst 33258 staining;the results
indicated that the Alkalescent alkaloids from crinum could inhibit the MCF -7,SMMC7721,
SGC7901,HepG - 2 cells significantly. The suppression was in a dose dependent manne.
The inhibition of HepG -2 was the strongest. It could show the excellent anti-tumor activity.
Key words:crinum;anti-tumor;alkaloids;MTT;Hoechst 33258
文殊兰(Crinum asiaticum var. sinicum (Roxb. ex Herb.)Baker),最早记载于《本草纲目拾遗》,
为石蒜科(Amaryllidaceae)文殊兰属(Crinum)多年
生草本植物,主要分布在我国东南沿海地区,性味
苦、辛、凉,有小毒;功在行血散瘀,消肿止痛,清火
解毒[1].民间主要用于治疗咽喉肿痛,跌打损伤,
痈疽疖疮,毒蛇咬伤等.
现代药理研究已初步确定,文殊兰具有消炎、
镇痛、保护心血管、诱导肿瘤细胞的凋亡以及抗拟
胆碱样作用等作用[2]. 文殊兰提取物活性成分中
石蒜碱具有抑制肿瘤细胞的活性;体外实验表明,
石蒜碱对人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞、人离体鼻
咽癌细胞等有明显的抑制作用,其作用机制可能是
抑制 DNA和蛋白质的合成[3].石蒜碱可以将 HL -
60 细胞阻断在 G2 /M 期,其作用机制是下调 Bcl -
2 的表达,提高 Bax /Bcl - 2 的比率;增强 caspase -
8、caspase - 9 和 caspase - 3 的活性,从而使细胞凋
亡[4].石蒜碱诱导 KM3 细胞凋亡的机制包括将细
胞阻滞在 G0 /G1 期;提高 Bax的表达,降低 Bc - l 2
的表达;激活 caspase - 8、caspase - 9 和 caspase - 3
以及促使线粒体释放细胞色素 C[5].石蒜碱抑制小
鼠淋巴瘤细胞 L5178 以及具有耐药性的小鼠淋巴
瘤细胞增殖的机制与 mdr - 1 基因的表达产物 p -
糖蛋白无关,而是由于和 RNA 形成了一种复合
物[6].本实验通过 MTT 法对文殊兰弱碱性生物碱
的抑瘤率进行了研究测定,通过对比,筛选出了敏
感细胞株并观察凋亡形态,为今后的深入实验奠定
了基础.
1 主要材料和仪器
肿瘤细胞株:MCF -7 细胞株、SMMC7721 细胞
株、SGC7901 细胞株、HepG - 2 细胞株(哈尔滨商
业大学药物研究所);
药品:羟基喜树碱注射液(哈尔滨盛泰药业)、
胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程公司)、Ho-
echst33258(碧云天试剂公司)、溴化四氮唑蓝
(MTT)(Sigma公司);
仪器:Olympus IX70 倒置显微镜、CKX - 41 -
32 荧光倒置显微镜、C - 4040Z00M 型数码相机
(Olympus公司)、WELLSCAN MK3 型酶标仪(Bio
- Rad 公司)、SANYO MCO175 型 CO2 培养箱(日
本三洋公司).
2 实验内容
2. 1 细胞培养
将实验所用肿瘤细胞用含 10%小牛血清 RP-
MI - 1640 培养液培养,并置于含 5% CO2 的 37 ℃
培养箱中进行传代;用 0. 25%胰酶消化,每周传代
2 次.
2. 2 MTT法筛选敏感的肿瘤细胞
取对数生长期的待测细胞,调整细胞浓度至 5
× 104 个 /mL,接种于 96 孔培养板,每孔加入 100
μL细胞悬液,于 CO2 培养箱中培养 24 h后加入药
物,使终质量浓度分别为 1、2、4、8、16、32、64、128
μg /mL,阴性对照组仅加入不含小牛血清的 RP-
MI1640 全培养基,阳性对照组加入羟基喜树碱(20
μg /mL).分别给药培养 48 h(72 h)后,每孔加入
MTT溶液,37 ℃孵育 4 h,弃上清液,加 DMSO溶解
后,于 490 nm测定吸光度.
2. 3 荧光显微镜观察细胞凋亡形态
将细胞调至浓度 1 × 104 个 /mL,转移至六孔
板培养,每孔加入 1 mL 细胞悬液. 培养 24 h 后加
入药物,使终浓度分别为 5、10、20 μg /mL,阴性对
照组仅加入含 RPMI1640 全培养基,阳性对照组加
入羟基喜树碱 20 μg /mL.培养 48 h 后,吸出废液,
每孔加入固定液,固定 30 min,PBS洗 2 次,每次洗
3 min,加入 Hoechst 33258 染液,37 ℃避光染色 30
min,使用荧光显微镜观察并记录图像.
3 实验结果及讨论
实验通过 MTT法对文殊兰弱碱性生物碱的抑
瘤率进行了研究测定,结果如图 1,可以看出文殊
兰弱碱性生物碱对肿瘤细胞生长有明显的抑制作
用,而且呈现出剂量关系.通过计算 IC50,结果如表
1,发现文殊兰弱碱性生物碱对 HepG - 2 细胞的抑
制作用最为明显,因此,选择 HepG - 2 细胞作为敏
感细胞株进行肿瘤细胞凋亡实验. 采用 Ho-
echst33258 法观察不同质量浓度文殊兰弱碱性生
物碱对 HepG - 2 细胞凋亡形态变化的影响,在荧
光显微镜下记录的图像结果如图 2.可观察到细胞
凋亡的凋亡小体以及凋亡的出现,而且细胞数也随
着给药量增加而减少.
表 1 MTT法检测文殊兰弱碱性生物碱
对四种细胞生长的抑制作用
细胞种类
给药 48 h后计算
IC50 /(μg·mL -1)
给药 72 h后计算
IC50 /(μg·mL -1)
MCF - 7
HepG - 2
7721
7901
19. 03
41. 77
30. 53
113. 12
28. 10
9. 37
23. 20
20. 71
·151·第 2 期 吴 迪,等:文殊兰弱碱性生物碱的抗肿瘤活性研究
图 1 文殊兰弱碱性生物碱对不同肿瘤细胞抑制曲线
(A.对照组;B.阳性对照羟基喜树碱 5 μg /mL;C.文殊兰弱碱性生物碱 5 μg /mL;D.文殊兰弱碱性生物碱 10 μg /mL;
E.文殊兰弱碱性生物碱 20 μg /mL)
图 2 不同质量浓度文殊兰弱碱性生物碱对 HepG -2 细胞凋亡形态学变化的影响
·251· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 30 卷
4 结 语
通过 MTT实验发现文殊兰中弱碱性生物碱能
够抑制 SGC7901、SMMC7721、HepG -2、MCF -7 四
种肿瘤细胞的增殖,并且通过计算 IC50得出 HepG
-2 细胞对文殊兰弱碱性生物碱最敏感(IC50 = 9.
37 μg /mL).通过荧光显微镜观察给药 HepG -2 细
胞发现,文殊兰弱碱性生物碱能够诱导肿瘤细胞特
征性形态逐渐明显,并且有凋亡小体的出现. 说明
文殊兰弱碱性生物碱具有抗肿瘤活性,为本课题深
入研究其凋亡机制提供了数据支持.
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