全 文 ：狗舌草中毒猪血液中吡咯代谢物的测定
陈进军 ,王建华
(西北农林科技大学畜牧兽医学院 ,陕西杨陵 712100)
摘　要:用含 10%狗舌草的饲料喂猪 144 d , 进行了血液 S—吡咯测定。染毒后第 8 ～ 96 d , 试验猪血液 S—吡咯
TLC 呈现较为明显的淡紫色斑 , Rf值在 0.56 ～ 0.78 之间;在试验的第 8 d ,试验猪血液 S—吡咯光密度值达 0.089
±0.007 OD单位 , 此后一直呈上升趋势。
关键词:狗舌草;中毒;S—吡咯;猪
中图分类号:S856.9　　　文献标识码:A　　　文章编号:0366-6964(2002)01-0045-03
收稿日期:2000-06-07
基金项目:杨凌农业科技开发基金资助项目(06B8)
作者简介:陈进军(1967～ ),男 ,汉族 ,宁夏中宁县人 ,博士 ,主要从事
动物营养代谢病和毒理学的科研和教学工作。
　　狗舌草[ Tephroseris kirilowii (Turcz.)Holub]
是菊科狗舌草属的一种有毒植物[ 1 , 2] ,含有多种双
稠吡咯啶生物碱(Py rrolizidine alkaloids , PAs), PAs
能够经肝脏转化为 S —吡咯代谢物 ,引起巨肝细胞 ,
甚至肝细胞癌[ 3～ 5] 。陕西省陇县关山牧场曾发现
马匹尤其是幼驹因采食狗舌草而发生一种“肝脑
病” ,十余年间因本病死亡的幼驹累计达 250 匹[ 1] 。
Winter H(1993)用薄板层析法(TLC)定性测定了
PAs中毒牦牛血液 S —吡咯[ 6] 。而 PAs中毒动物血
液S —吡咯的定量测定尚未见报道。本试验利用敏
感动物猪制造狗舌草中毒模型 ,对其血液 S —吡咯
的定量测定进行了研究。
1　材料和方法
1.1　狗舌草　于秋初采自陕西省陇县关山牧场 ,由
中国科学院西北植物研究所鉴定 。日晒至蔫再阴
干 ,粉碎 ,干燥保存备用。
1.2　猪　60 ～ 65日龄健康长白仔猪 12头 ,雌雄各
半 ,体重10.56±0.79 kg 。试验前驱虫 ,去势 ,免疫 ,
预试应期 18 d ,按简化随机分层法等分为对照组(C
组)和试验组(T 组),分置环境相同的两个猪舍供
试。C 组饲料配方为生长猪前期浓缩料:玉米粉∶麦
麸∶草糠=2∶4∶3∶1 ,将 C 组的草糠用狗舌草粉替代
即为 T 组饲料配方。两组猪饲料的营养成分相当 。
1.3　仪器和试剂　EHRISA1050型冰冻干燥机(德
国KARLKOLB公司), 721分光光度计(上海第三
仪器厂)。硅胶 G(100 ～ 200 目 ,浙江黄岗市化工
厂),改良 Ehrlich 试剂(用 40 mL 含 0.4 mL 高氯酸
和 1 mL 乙二醇的 2-丙醇 ,溶解 0.4 g 对-二甲氨基
苯甲醛),硝酸银乙醇液〔用 5 mL 40%(w/v)硝酸银
溶液与 7 mL 40%Tris混合 ,用稀硝酸调 pH 值至
7.3 ,再加无水乙醇至 40 mL ,混匀〕。
1.4　血液 S—吡咯测定
1.4.1　猪血样制备:试验前和染毒后第 8 d开始 ,
每隔 8 d ,于早晨由空腹猪的前腔静脉采血 ,肝素抗
凝 ,用于制备定性和定量测定 S—吡咯用冻干血粉。
1.4.2　S —吡咯定性测定[ 6] :取 0.4 ～ 0.5 g 冻干血
粉 ,与 8 mL 丙酮混合 ,离心(3 000 r/min ,10 min),
用 5 mL 乙醇洗涤沉淀物 ,用 5 mL 硝酸银乙醇液悬
浮该沉淀物 , 磁力搅拌 1 h ,加 10%碳酸钾 1.25
mL ,离心 ,浓缩上清液 ,加 3 ～ 5 mL 蒸馏水 ,混匀 ,
用乙醚萃取 3次 ,用无水碳酸钾和无水硫酸钠脱水 ,
蒸发至胶状 ,用少量甲醇溶解 ,进行 TLC检验 ,展开
剂为石油醚(沸程 60℃～ 80℃)∶丙酮=1∶1 ,固定相
为 75 mm ×25 mm 淀粉硅胶 G 薄板(厚约 1.5
mm),用改良 Ehrlich试剂喷洒 ,稍热至干 ,观察斑点
颜色 ,测定 Rf值 。
1.4.3　血液 S—吡咯定量测定:(1)检样制备:取
10.0 mL 血液 ,置低温冰箱过夜 ,次日置室温下融
化 ,分装于 4个洁净青霉素瓶中 ,斜置于低温冰箱冻
实 ,再移至冰冻干燥机中干制成粉。与 15 mL 丙酮
混合 ,离心(3 000 r/min ,10 min),用 10 mL 乙醇洗
涤沉淀物 ,用 10 mL 硝酸银乙醇液悬浮该沉淀物 ,
磁力搅拌 1 h ,加 10%碳酸钾 2.5 mL ,离心 ,浓缩上
清液 ,加 8 mL 蒸馏水 ,混匀 ,用乙醚萃取 3次 ,用无
水碳酸钾和无水硫酸钠脱水 ,蒸发至胶状 ,用 4 mL
甲醇迅速搅拌溶解 。(2)操作:参考 Glowaz SL 等人
畜牧兽医学报 , 2002 , 33(1), 45～ 47
Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica
的方法[ 7] , 加改良 Ehrlich 试剂 4 mL 于检样中 ,
60℃水浴 5 min ,在 595 nm 和 625 nm 下 ,以蒸馏水
调零 ,测定光密度 A 值(平行重复 3次),校正公式
为Acorr=1.1×(A595-A625)。在同样波长下 ,改变
水浴温度(55℃、57℃和 62℃)及时间(3 、4 、6 min),
共平行重复测定 3×3次 。
1.5　数据统计处理　分别计算每次测定数据的平
均值和标准差 ,进行小样本组间平均数显著性检验
(t检验),并进行 S —吡咯光密度测定值与文献[ 8]中
供试猪血液其它生化指标间的相关性分析。
2　结　果
2.1　血液 S—吡咯定性测定　在采食含 10%狗舌
草饲料后第 8 ～ 96 d ,试验猪血液 S —吡咯 T LC 测
定结果呈现较为明显的淡紫色斑 , Rf值的范围为
0.56 ～ 0.78 。
2.2　血液 S—吡咯定量测定　从第 8 d 开始 , T 组
猪血液 S —吡咯的光密度值就显著升高 ,至第 96 d ,
达到峰值(0.231±0.005 OD.);以后开始下降 ,但
一直高于对照组(表 1 ,水浴条件为 60℃, 5 min)。
3　讨论与结论
3.1　狗舌草中毒的早期诊断　家畜常在采食狗舌
草后数月至两年后发病[ 4 ～ 6] 。所以 ,早期诊断对于
狗舌草中毒的及时发现和治疗更有意义。从本研究
的结果看 ,血液 S —吡咯的测定可以作为狗舌草中
毒早期诊断的重要检测指标 ,也是判断动物采食含
PAs植物的重要依据之一。
表 1　供试猪血液 S—吡咯光密度测定值(OD 单位)
Table 1　Optical density of sulphur-conjugated pyrrolic metabolite in swine(ODunit)( X±SD)
试验期 Period(d) C 组　Control T 组　Test t值　Values p 值　Values
0 0.025±0.003 0.023±0.006 -0.2699 >0.05
8 0.022±0.004 0.089±0.007 9.2418 <0.01
16 0.025±0.006 0.095±0.005 14.0811 <0.01
24 0.023±0.005 0.104±0.004 19.7593 <0.01
32 0.026±0.008 0.076±0.008 6.5070 <0.01
40 0.024±0.004 0.115±0.003 27.5287 <0.01
48 0.027±0.004 0.108±0.001 6.0346 <0.01
56 0.028±0.007 0.132±0.005 21.8039 <0.01
64 0.028±0.005 0.155±0.005 23.8545 <0.01
72 0.032±0.006 0.159±0.009 14.6347 <0.01
80 0.031±0.002 0.181±0.006 22.072 <0.01
88 0.034±0.003 0.203±0.005 30.5382 <0.01
96 0.036±0.003 0.231±0.005 35.4798 <0.01
104 0.033±0.006 0.180±0.011 13.5321 <0.01
112 0.031±0.002 0.133±0.007 13.9337 <0.01
120 0.028±0.002 0.114±0.005 15.8518 <0.01
128 0.026±0.004 0.106±0.012 6.7288 <0.01
136 0.027±0.004 0.080±0.005 10.0783 <0.01
144 0.031±0.006 0.087±0.011 5.5012 <0.01
　　Note:OD unit is the optical density determined in 10 m L of blood.
3.2　关于 S—吡咯测定的反应条件及其效果
3.2.1　比色波长的确定:血液 S —吡咯是 PAs的代
谢产物 ,能特异地与改良 Ehrlich 试剂发生颜色反
应 ,其最大吸收波长为 595 nm 。此外 ,在吡咯代谢
物的提取及其与显色剂反应中会产生微弱的干扰
色 ,所以最后的测定值必须加以校正 ,其校正公式为
Acorr=1.1×(A595-A625)[ 7] 。
3.2.2　显色反应温度:在吡咯代谢物的测定中 ,如
果温度太低 ,则不利于 N —氧化物向吡咯转化而影
响显色;温度过高 ,则使测定值偏低。试验发现 ,在
加入显色剂以后的适宜加热温度为 60℃。
3.2.3　显色反应时间:试验发现 ,加显色剂于血液
S —吡咯测定用检样中以后 ,溶液呈改良 Ehrlich试
剂的本色(淡黄色),60℃水浴加热 3 min后 ,呈现淡
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洋红色 ,加热 5 min ,呈现淡紫色 ,如果时间延长 ,则
呈紫褐色 ,因此 60℃加热 5 min较为适宜。
3.2.4　血液 S —吡咯测定时颜色的稳定性及本方
法的可行性:在加热 5 min后 ,将测定反应液置于室
温下 ,淡紫色可保持 45 ～ 60 min 不变 ,可见反应颜
色的稳定性较好 。加之反应颜色明显(淡紫色),而
且能够较早地测出血液 S —吡咯 ,测定的灵敏度较
高 ,因而认为 ,本研究所用方法定量测定血液 S —吡
咯 ,对 PAs植物中毒进行早期诊断是可行的。
3.2.5　血液 S —吡咯的动态变化:T 组猪采食含
10%狗舌草的饲料 8 d 以后 ,就可以测出其血液中
的S —吡咯 ,而且呈上升趋势。从第 104 d 开始 ,呈
下降趋势 ,试验期末 ,仍显著高于 C 组 ,试验后期下
降的原因可能是参与 PAs代谢的酶类如微粒体混
合功能氧化酶的合成因吡咯代谢物的产生而受到抑
制[ 4 ～ 6] 。因此经常定期对动物尤其是放牧家畜进
行血液S —吡咯的定量监测是有必要的 。
表 2　血液 S—吡咯光密度测定值与 Hb、GOT、AKP
以及γ-GT的相关性
与血液 S—吡咯的回归方程 r
Hb y′=124.481-148.75x′ r=-0.541
GOT y′=30.240+323.577x′ r=0.525
AKP y′=9.656-21.937x′ r=-0.554
γ-GT y′=59.902+421.7724x′ r=0.537
3.3　血液 S—吡咯光密度值与其它血液生化指标
的关系　本试验共进行了 19次测定(包括试验前 1
次),故相关系数(r)的自由度 df =19-2=17 ,查得
95%可信限 r0.05=0.456 ,以此分别与作者的另文报
道(同一批供试猪同时测定)[ 8] 各个 r 值比较(表
2),结果 r 的绝对值均大于 r0.05(P <0.05)。故认
为 ,T 组猪血液 S —吡咯分别与其Hb 、血清 GOT 、血
清 AKP 和血清γ-GT 之间具有显著的相关性 。
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Determination of Sulphur-conjugated Pyrrolic Metabolite in
Swine Exposed to Tephroseris Kirilowii(Turcz.)Holub
CHEN Jin-jun ,WANG Jian-hua
(Ani Sci Vet Med Col lege , Northwestern Agircultural and Forestry Sci-tech
University , Y angling , Shaanx i 712100 , China)
Abstract:The pigs in test g roup w ere fed w ith feed contained 10% tephroseris kiri lowii fo r 144 day s , and the
sulphur-conjugated pyrrolic metabolite in blood w as determined.On the 8th day of the experimentation , the sul-
phur-conjugated py rrolic metabolite in blood just could be qualitatively determined by TLC , and the quantitative
determination of blood sulphur-conjugated py rrolic metabolite′s optical densi ty elevated to 0.089±0.007 OD
units(P<0.01), and continuously increased.
Key words:Tephroseris kirilowii(Turcz.)Holub;Intoxication;Sulphur-conjugated py rrolic metaboli te;Sw ine
　1 期 陈进军等:狗舌草中毒猪血液中吡咯代谢物的测定 47