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(收稿日期:2010-10-18)
荧光光度法测定维药刺山柑种子中
总黄酮含量的研究
张　冉 ,美丽万 ·阿不都热依木＊(新疆医科大学药学
院 ,新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的　根据黄酮类化合物与 Al3+形成稳定的荧光络合
物 ,建立一种测定刺山柑种子中总黄酮的新方法。方法　采
用荧光光度法 ,在激发波长 418 nm ,发射波长 530 nm 的条件
下测定刺山柑种子中总黄酮含量 , 并进行方法学验证。结果
对照品芦丁的标准曲线为Y =0.738X-4.313 , r 2 =0.999 1;
平均回收率为 100.6%, RSD 为 2.0%。结论　该方法简便 ,
快捷 ,精密度高 , 准确性好 , 可作为维药刺山柑种子中总黄酮
的含量测定方法。
关键词:荧光光度法;刺山柑种子;总黄酮
doi:10.3969/ j.issn.1004-2407.2011.02.008
中图分类号:R927.2　　　文献标志码:A　　　
文章编号:1004-2407(2011)02-0092-03
作者简介:张冉 ,女 ,在读硕士研究生
＊通信作者:美丽万·阿不都热依木 , 女 ,教授 , 硕士生导师
　　刺山柑种子为白花菜科(Capparidaceae)山柑属
植物刺山柑(Capparis spinosa L.)的种子[ 1-2] ,维语
名为开派 、菠里科果;喜生于荒漠戈壁 、低山坡石质沙
土处 ,在我国主要分布于新疆 、甘肃 、西藏等省区。黄
酮类化合物是刺山柑种子中的主要有效成分之一[ 3] ,
具有多种生物活性 ,并具有抗氧化 、清除体内过剩自
由基 、提高免疫力等功效 。
近年来 ,有关刺山柑总黄酮含量的测定通常采用
紫外分光光度(UV)法 。UV法的实验原理是根据黄
酮类物质与 Al3+形成稳定的络合物 ,并产生特征吸
收光谱而进行测定[ 4] 。由于刺山柑种子中成分复杂 ,
富含多种糖苷类 、酚类 、萜类物质 ,对吸光值产生干
扰 ,影响实验结果的准确性[ 5] 。为了寻求操作简便 、
成本低 、结果准确的检测方法 ,我们根据黄酮类化合
物与 Al3+形成稳定的荧光络合物 ,采用荧光光度法
测定总黄酮含量 。结果表明 ,该方法简便 ,快捷 ,精密
度高 ,准确性好 ,可作为维药刺山柑种子中总黄酮的
含量测定方法。
1　仪器与试药
1.1　仪器　荧光分光光度计(RF-5301PC ,日本岛津
公司);超声仪(SK8210HP ,上海科导超声仪器有限
公司);电热恒温水浴锅(DK-S22 ,上海精宏实验设备
有限公司);分析天平(B-N 梅特勒 ,上海托利多仪器
有限公司)。
1.2　试药　刺山柑种子采于新疆 10个不同产区 ,粉
碎过 40目筛 ,备用;芦丁对照品(中国药品生物制品
检定所 ,批号 100080-200707 ,质量分数 92.5%);其
他试剂均为分析纯。
2　方法
2.1　样品溶液的制备　取刺山柑种子粉末约 0.5 g ,
精密称定 ,置索氏提取器中 ,加 20 mL 石油醚 ,加热
回流 30 min ,弃去石油醚提取液 ,于温水浴中挥干残
留石油醚;加 50 mL 甲醇回流提取 1 h ,滤过 ,滤液置
于 100 mL 量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀;精密量
取样品溶液 2 mL ,置于 10 mL 量瓶中 ,加 100 g ·L-1
A l(NO3)3 溶液 1 mL ,pH4.5 的醋酸-醋酸钠缓冲溶
液 1 mL ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,放置 20 min。
2.2　芦丁对照品溶液的制备　取芦丁 10 mg , 精密
称定 ,置于 100 mL 量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀;精
密量取 0.4 , 0.8 , 1.2 , 1.6 和 2.0 mL 分别置于 10
mL 量瓶中 ,加 100 g ·L-1的 Al(NO 3)3 溶液 1 mL ,
pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液 1 mL , 加甲醇至刻度 ,
摇匀 ,放置 20 min 。照《中国药典》(2010年版)二部
荧光测定法(附录ⅣE)测定荧光强度。
2.3　测定　在激发光谱通带 3 nm 、发射光谱通带 5
nm 、激发波长 418 nm 、发射波长 530 nm 的条件下 ,
测定芦丁对照品溶液的荧光强度 ,以芦丁的质量浓度
为横坐标 ,荧光强度为纵坐标作图 ,绘制工作曲线 ,在
相同的条件下测定样品中总黄酮的荧光强度 ,再用回
归方程计算含量 。
3　结果
3.1　荧光化合物的激发及发射光谱　先用紫外分光
光度仪对芦丁对照品溶液在 200 ～ 800 nm 处扫描 ,得
最大波长。将最大波长做波长扫描最大发射波长 ,反
复扫描得荧光激发波长 418 nm ,发射波长 530 nm 。
3.2　提取方法的考察
3.2.1　提取方法的考察　取刺山柑种子粉末约 0.5
g ,9份 ,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加 20 mL 石油醚 ,
加热回流 30 min ,弃去石油醚提取液 ,于温水浴中挥干
残留石油醚。然后加 50 mL 甲醇;3份加热回流提取
(65 ℃,1 h);3份超声提取(功率 600 W ,频率 60 kHz ,
1 h);3 份冷浸(12 h);滤过 ,滤液置于 100 mL 量瓶
中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀;精密量取样品溶液 2
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mL ,置于 10 mL 量瓶中 ,加 100 g · L-1 Al(NO 3)3
溶液 1 mL ,pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液 1 mL ,加
甲醇至刻度 ,摇匀 , 20 min后测其荧光强度 ,见表 1。
结果表明 ,加热回流提取较完全 ,因此选用加热回流
作为提取方法。
表 1　刺山柑种子中总黄酮提取方法的考察(n=3)
提取方法 样品量/ g 荧光强度 总黄酮含量/mg· g -1
均值
/mg· g -1 RSD/ %
加热回流 0.518 9 15.500 6.87
0.500 1 14.774 6.59 6.72 1.7
0.500 7 14.916 6.69
超声提取 0.500 1 13.385 5.36
0.501 5 13.620 5.72 5.65 1.2
0.501 1 13.550 5.67
冷浸 12 h 0.500 9 8.689 2.10
0.500 3 8.660 2.08 2.12 1.8
0.518 9 8.898 2.17
3.2.2　提取时间的考察　取刺山柑种子粉末约 0.5 g ,
精密称定 ,置索氏提取器中 ,加 20 mL 石油醚 ,加热
回流 30 min ,弃去石油醚提取液 ,于温水浴中挥干残
留石油醚 ,加 50 mL 甲醇;3 份加热回流提取 1 h;3
份加热回流提取 2 h ,滤过;滤液置于 100 mL 量瓶
中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀;精密量取样品溶液 2
mL ,置于 10 mL 量瓶中 ,加 100 g · L-1 Al(NO 3)3
溶液 1 mL ,pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液 1 mL ,加
甲醇至刻度 ,摇匀 , 20 min后测其荧光强度 ,见表 2。
结果表明 ,加热回流 1 h与加热回流 2 h 对总黄酮的
含量影响不大 ,因此选用加热回流 1 h 。
表 2　刺山柑种子中总黄酮提取时间的考察(n=3)
提取时间/ h 样品量/ g 荧光强度 总黄酮含量/mg· g -1 平均含量/mg· g -1 RSD/ %
1 0.501 4 14.966 6.71
0.501 2 14.768 6.57 6.71 1.8
0.502 6 15.193 6.86
2 0.507 7 15.163 6.77
0.508 6 15.276 6.84 6.77 1.1
0.518 4 15.238 6.69
3.3　pH 值的影响　溶液的 pH 值影响络合物的形
成和荧光强度 。在实验中 ,分别配制了 pH 为 3.7 ,4.5
和6.0的缓冲液进行实验 ,发现当溶液 pH 为 3.7时 ,
荧光强度小 ,pH 为4.5和 6.0时 ,荧光强度依次增大 ,
但pH 为 6.0时稳定性差。故选择加入 pH 为 4.5的
醋酸-醋酸钠缓冲液 1 mL。
3.4　硝酸铝的加入量　黄酮类化合物与铝离子可生
成稳定的荧光络合物 ,本实验中分别加 100 g · L-1
的 Al(NO3)3 溶液0.5 ,1.0 ,1.5和 2.0 mL。结果表明 ,
用100 g ·L-1的Al(NO3)3溶液加入0.5 ～ 2.0 mL 对实
验结果影响不大。故选择100 g ·L-1的Al(NO3)3溶液
加入 1 mL。
3.5　静置时间的影响　将溶液静置于室内避免阳光
直射 ,并控制不同时间测定芦丁对照品溶液的荧光强
度 。结果表明 ,溶液荧光强度在 20 min 内略有增加 ,
随后有平缓下降趋势 。所以 , 选择静置 20 min为最
佳测定时间 。
3.6　方法学验证及样品的测定
3.6.1　工作曲线的研究　实验结果表明 ,在芦丁质
量浓度为 4 ～ 20μg · mL -1范围内 ,荧光强度 X 与芦
丁质量浓度Y 具有良好的线性关系 , 线性回归方程:
Y =0.738X -4.313 , 相关系数 r 2 =0.999 1 ,说明荧
光强度与相应的质量浓度线性显著相关 。
3.6.2　精密度实验　精密量取同一供试品溶液 ,重
复测定 6次 ,记录荧光强度 , 计算总黄酮含量。结果
总黄酮平均含量为 5.88 mg ·g -1 , RSD 为 0.5%,表
明仪器精密度良好。
3.6.3　重复性实验　取同一批样品 ,按照方法 2.1
项下平行制备 6份供试品溶液 ,记录荧光强度 , 计算
总黄酮含量 ,结果总黄酮平均含量为 6.08 mg ·g -1 ,
RSD为 2.0%,表明实验重复性良好。
3.6.4　回收率实验　为了验证实验的准确性 ,在样
品中加入芦丁对照品后计算其回收率 ,结果见表 3。
表 3　回收率实验结果(n=6)
样品质量浓度/μg·mL-1
测得质量浓度/μg·mL -1
加入芦丁质量浓度/μg·mL -1
加样回收率/ %
平均回收率/ %
RSD/ %(n =6)
6.09 10.12 4 100.8
6.09 10.23 4 103.5
6.09 10.02 4 98.2 100.6 2.0
6.09 10.06 4 98.4
6.09 10.12 4 100.8
6.09 10.15 4 102.0
3.6.5　样品测定　取新疆 10 个不同产区的刺山柑
种子约 0.5 g ,精密称定 ,按照供试液的制备方法制备
样品 ,测定并计算刺山柑种子中总黄酮的含量 ,结果
见表 4。
表 4　新疆 10 个不同产区的刺山柑种子中总黄酮含量
产地 样品量/ g 总黄酮含量/mg· g -1
鄯善 0.502 1 6.86
哈密 0.501 6 6.07
伊犁 0.501 4 8.89
吐鲁番 0.503 8 4.73
乌鲁木齐 0.502 4 10.40
阿克苏 0.499 1 4.27
乌苏 0.500 9 5.48
克拉玛依 0.503 4 5.66
喀什 0.501 0 5.06
库尔勒 0.499 7 7.01
4　讨论
刺山柑是新疆地区作为治疗类风湿关节炎的常
用民族药 ,实践证明具有较好的疗效 ,用药途径多为
外敷。黄酮类化合物具有多种生物活性 ,具有抗氧
化 、清除体内过剩自由基 、提高免疫力等功效 ,是刺山
柑种子中的主要有效成分之一 。本实验首次采用荧
93西北药学杂志　2011 年 4 月　第 26 卷　第 2 期
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光分析法对新疆 10个不同产地的刺山柑种子进行总
黄酮的含量测定 。对表 4中数据进行比较可以发现 ,
不同产地刺山柑种子中总黄酮的含量有较大差别 ,其
中乌鲁木齐的刺山柑种子中总黄酮含量最大 ,阿克苏
的刺山柑种子中总黄酮含量最小 ,表明不同产区刺山
柑内在品质存在较大差异 。应加强对其化学 、药理研
究 ,完善质量标准 ,为临床用药安全有效提供保障 。
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(收稿日期:2010-10-26)
秦艽种子蛋白质的提取及 SDS电
泳研究
唐泽丽 ,李多伟＊ ,王　瑶 ,杨　维 ,邓丽丽(西北大学
生命科学学院 ,陕西 西安 710069)
摘要:目的　探讨秦艽种子的提取方法 、最佳变性聚丙烯酰胺
凝胶(SDS)电泳体积分数 , 为秦艽种子蛋白的研究和种质的
鉴别奠定基础。方法采用添加样品缓冲液研磨提取和不添加
任何物质研磨提取 2 种方法对秦艽种子蛋白进行提取 , 用体
积分数为 7.5%, 10%, 15%和 20%的 4 种不同凝胶对提取的
种子蛋白进行 SDS 电泳。 结果　添加样品缓冲液研磨提取
的秦艽种子蛋白电泳图谱效果好;体积分数 15%的 SDS 电泳
谱带数最多 、最清晰 , 适合做电泳分析;提取的 4 种蛋白中球
蛋白和谷蛋白多态性相对较好 , 都可用于区分不同的种子。
结论　该提取工艺较简便可行 , 电泳谱带清晰度高 , 多态性
好 ,可为选育优良品种提供依据。
关键词:秦艽种子;提取方法;SDS 电泳;种子蛋白
doi:10.3969/ j.issn.1004-2407.2011.02.009
中图分类号:R284.2　　　文献标志码:A　　　
文章编号:1004-2407(2011)02-0094-03
作者简介:唐泽丽 ,女 ,在读本科生
＊通信作者:李多伟 ,男 , 副教授 ,硕士生导师
　　秦艽(Gent iana macrophy lla Pall.)为龙胆属
(Gentiana )多年生草本植物 ,以根入药 , 有祛风除
湿 、退虚热 、止痹痛之功效[ 1] ,是国家重点保护的野生
药材之一[ 2] 。秦艽由于生长环境及栽培条件不同 ,其
有效成分龙胆苦苷含量存在差异 ,对其进行有效鉴
别 ,选育优良高产品种是秦艽繁育的首要任务 。植物
种子蛋白作为遗传标记已被广泛应用于种属间关系 、
种内遗传多样性分析 、品种鉴定及植物繁育系统的鉴
别[ 3] 。目前有关秦艽种子尤其是秦艽种子蛋白研究
报道甚少。笔者通过提取秦艽种子不同蛋白及探究
不同体积分数胶的 SDS 电泳 ,研究了 6 个农户仿生
栽培的秦艽种子蛋白 ,比较其种子蛋白组成的差异 ,
为深入研究秦艽种子蛋白 、种质资源以及选育优良品
种提供依据 。
1　仪器与试药
1.1　仪器 　DYCZ-28B 型电泳槽(北京六一仪器
厂);DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);
TY-80B 脱色摇床(北京六一仪器厂);Biofuge S tra-
tos台式高速冷冻离心机(科峻仪器公司);恒温水浴
锅(南京科尔仪器设备有限公司)。
1.2　试药　秦艽种子分别采自陕西省太白县 6家农
户 ,仿生栽培中编号为 1 ～ 6;丙烯酰胺 、N , N′-甲叉
双丙烯酰胺 、四甲基乙二胺 、SDS 、过硫酸铵 ,均为分
析纯 ,均购于成都方正化工厂;其余试剂均为分析纯;
水为蒸馏水 。
2　方法
2.1　提取剂及样品缓冲液制备　提取剂参照文献
[ 4]等方法制备:
(1)清蛋白提取剂:蒸馏水(去离子)。
(2)醇溶蛋白提取剂:体积分数 70%乙醇与体积
分数 70%异丙醇 1∶1。
(3)谷蛋白提取剂:0.1 mol · L-1氢氧化钾溶
液 。
(4)球蛋白提取剂:0.5 mo l· L-1氯化钠溶液 。
样品缓冲液:2 mLβ-巯基乙醇 ,5 mL甘油 , 1 mL
1 g ·L -1的溴酚蓝 ,1 g SDS ,加水溶解并稀释至 50
mL。
2.2　秦艽种子蛋白的提取　秦艽种子蛋白提取方法
Ⅰ 　分别称取 1 ～ 6号种子各0.1 g ,将种子分别加入
1 mL 的样品缓冲液中 ,充分研磨 ,将每份样品平均分
别装于 4个 1.5 mL EP 离心管中 ,再依次注入 0.5
mL 的 4种提取剂 ,并标号 。如 1号种子:1 ～ 4 号分
别代表清蛋白 、醇溶蛋白 、谷蛋白和球蛋白。将加完
提取剂的样品充分摇匀 ,在 60 ℃恒温水浴锅中提取
25 min ,取出离心管;待样品冷却至室温 ,于高速冷冻
离心机中在 4℃下离心 8 min(10 000 r ·min-1),弃
沉淀 ,取上清液置于 4 ℃冰箱中保存备用 。
秦艽种子蛋白提取方法Ⅱ　分别称取 1 ～ 6号种
子各0.1 g ,将种子不添加任何物质充分研磨 ,其余步
骤同方法Ⅰ 。
2.3　聚丙烯酰胺凝胶电泳　参照文献[ 5]方法 ,制备
4种胶体 , 其分离胶体积分数分别为 7.5%, 10%,
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