全 文 ：第 18卷　第 1期
2002年 3月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal o f Fujian Teach ers Univ ersity ( Natural Science)
Vo l. 18　 No. 1
Ma r. 2002
文章编号: 1000-5277( 2002) 01-0082-04
用于 DNA提取的刺桫椤叶片组织保存方法研究⒇
王经源 , 黄儒珠
(福建师范大学生物工程学院 , 福建 福州　 350007)
　　摘要: 用一种由 1. 5% SDS, 100 m mo l /L T ris ( pH 8. 3) , 50 m mo l / L EDTA ( p H 8. 0) , 500 m mol /
L NaCl和 500 m mo l /Lβ-巯基乙醇组成的 SDS提取液保存野外采集的刺桫椤 (Alsophila spinulosa ) 叶片组
织 , 结果表明 , 保存 7 d、 15 d、 30 d、 90 d、 180 d (室温下 ) 的刺桫椤叶片组织提得的 DN A分子量与鲜叶
一致 , 均大于 48kb, 得率为 600～ 1200μg /g· FW. 采自同一植株不同保存时间的叶片组织获得的 DN A用
于 RAPD分析 , 结果完全一致 . 用该方法保存的 8个刺桫椤天然居群的 91份样品 ,提得的 DN A已用于基于
PCR技术的研究 .
关键词: DN A提取 , 保存 , RAPD, 刺桫椤
中图分类号: Q946　　　文献标识码: A
　⒇⒇
以 PCR( po lymerase chain reaction)为基础的分子标记技术 ,如 RAPD( random amplified polymo r-
phic DN A)、 SSR( simple sequence repeat )、 AFLP( ampli fied f ragment leng th polymorphism)和 RFLP
( rest riction f ragment leng th po lymo rphism ) 等是植物分子生物学研究的常用手段 . 基于 PCR的分子
标记技术中 , 用于 PCR的模板 DNA要求纯度高、完整性好 . 新鲜的或用液氮或干冰冻存的植物材料 ,
提得的 DNA可以满足实验要求 .然而 ,大部分用于研究的植物材料往往是从远离实验室的野外采集获
得 ,由野外到实验室 ,新鲜材料在旅途中可能枯萎、腐烂 ,特别是一些离体材料极易受 DNA酶的作用 ,
从而导致 DNA降解 , 而无法获得高质量的 DNA. 若采用液氮或干冰冻存植物材料 , 也存在野外携带
和运输不便、 费用高等缺点 . 为此有必要建立一套可靠、 稳定、 经济的植物材料保存方法 , 以解决野
外实验材料不易保存的障碍 . Doyle& Dickson[1 ]、 Pyle& Adams[ 2]、 Liston et al[3 ]、 Chase& Hills [4 ]、
Rogstad
[5 ]等研究了用化学试剂法、 低温冷冻法、 干燥法、 饱和 NaCl- CTAB (十六烷基三乙基溴化
铵 )法等保存植物材料 . 这些方法在应用时受到一定的限制 . 作者在对刺桫椤基因组 DNA提取的研究
中 , 从 Guillemaut et al[6 ]建立的用于提取 DNA的 SDS提取法中使用的 SDS提取液 , 能有效地抑制
DNA酶的活性得到启示 ,试着将 SDS提取液直接用于刺桫椤叶片组织的保存 ,出乎意料获得满意的效
果 . 用作者建立的方法 , 保存 7 d、 15 d、 30 d、 90 d、 180 d (室温下 ) 的刺桫椤叶片提取的 DNA与
从新鲜叶片提取的 DNA分子量、 得率、 RAPD扩增结果完全一致 .
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料刺桫椤叶片采自福建、 贵州和四川 3省 8个刺桫椤天然居群 (表 1) .
1. 2　叶片组织的采集与保存
野外采集未完全伸展的拳卷状刺桫椤嫩叶 , 置自封口塑料袋中 , 用手轻压排去袋内的空气 , 封口 ,
⒇
⒇
⒇作者简介: 王经源 ( 1972—　 ) , 男 , 福建福清人 , 硕士研究生 .
基金项目: 福建省教育委员会科学基金项目 ( JA99143)
收稿日期: 2001- 09- 15
尽量于阴凉处存放 . 当天或 3 d内在野外工作驻地 , 对采集的叶片组织进行如下处理保存: 称 0. 1 g叶
片于研钵中 , 加少量石英砂及 0. 5 m l SDS提取液 [内含: 1. 5% SDS, 100 m mol /L Tris ( pH 8. 3) ,
50 m mo l /L EDT A ( pH 8. 0) , 500 m mol /L NaCl , 500 m mo l /Lβ-巯基乙醇 ] ,迅速研磨成浆状 ,再加
0. 5 ml SDS提取液 ,混匀后 ,移至 1. 5 m l Eppendo rf管中 ,于室温下避光保存 ,定期用于 DNA提取 .
1. 3　 DNA的提取及质量检测
( 1) 取经 1. 2步骤处理的叶片匀浆 (新鲜的或定期保存的 ) , 加 330μl 5 mo l /L醋酸钾 , 混匀 , 置
- 18℃ 冰箱 20 min.
( 2) 10000 r /min离心 10 min, 上清液转入新的 Eppendo rf管中 , 加入等体积的酚∶氯仿 ( 1∶ 1) ,
温和混匀 . 10000 r /min离心 10 min, 小心吸出上清液转到新的 Eppendo rf管中 , 加入等体积的氯仿 ,
轻柔混匀 .
( 3) 10000 r /min离心 10 min, 上清液转入新的 Eppendorf管中 ,加入 2倍体积的 4℃ 冰箱预冷的
无水乙醇 , 轻轻转动离心管 , 使液体充分混合 . 此时可见到絮状的 DNA漂浮在溶液中 , 用广口吸管将
其吸出 , 置于新离心管中 , 稍离心 , 弃去残留溶液 .
( 4)沉淀用 70% 乙醇洗涤 2次 , 然后用无水乙醇洗涤 1次 , 空气中干燥 (或真空抽干 )后加入适
量 TE溶解 , 于 4℃ 或 - 20℃ 保存待用 .
( 5)用紫外分光光度计 , 测定波长 260 nm及 280 nm的光吸收值 , 根据 OD260估算 DNA产率 , 根
据 OD260 /O D280比值判断 DNA样品的大致纯度 . 用 0. 8% 琼脂糖凝胶 , 于 3 V /cm电场中电泳 , 溴乙
锭染色 , 检查所得 DNA的大致分子量 .
1. 4　RAPD反应
以上述提取的 DNA为模板 , 用含 10个碱基的 RAPD随机引物 ,在 M J PTC- 100型 PCR仪上进
行 RAPD扩增反应 . 反应体积为 10μl, 内含 0. 5 U Taq DN A聚合酶及其 Buf fer, 400μmo l /L dN T P,
2 mmol /L MgCl2 , 10 ng的模板 DNA, 0. 3μmol /L引物 DNA. 扩增程序为: 94℃ 预变性 4 min. 然
后于 94℃ 变性 30 s, 36℃ 复性 40 s, 72℃ 延伸 90 s, 循环 42次 . 最后在 72℃ 延伸 7 min后于 4℃
保存 . 扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶于 3 V /cm电场中电泳 , 溴乙锭染色后 , 在 BIO- RAD Gene Doc
1000凝胶成像仪上检测并拍照记录 .
以上实验所用试剂、 酶及 RAPD引物均购自上海生工生物工程技术有限公司 .
表 1　采集的刺桫椤天然居群及样本数
居 群 地点 样 本 数
01 贵州赤水金沙　 27
02 贵州赤水复兴　 5
03 四川荣县金花　 12
04 四川乐山西坝　 11
05 四川乐山石麟　 7
06 福建永泰青云山 8
07 福建福安瓜溪　 15
08 福建宁德　　　 6
2　结果与分析
2. 1　 DNA提取结果
按上述方法从刺桫椤鲜叶和以 SDS提取液保存 7 d、 15 d、 30 d、 90 d、 180 d的同一植株叶片提
取的 DN A,分子量大小基本相同 ,均大于 48 kb,且 DNA降解碎片很少 ,泳道前端也几乎看不到 RNA
弥散带 , 说明提得的 DNA完整性好 (图 1) . 其次 , 以 SDS提取液保存 7 d、 15 d、 30 d、 90 d、 180 d
83　第 1期　　　　　　　　　　王经源等: 用于 DNA提取的刺桫椤叶片组织保存方法研究
的同一植株叶片提取的 DNA OD260 /OD280比值 ( 1. 84～ 1. 93) 与以鲜叶提取的 DNA OD260 /OD280比值
( 1. 84～ 1. 87) 也基本相同 , DN A提取得率以鲜叶计达 600～ 1200μg /g , 与鲜叶一致 , 比用硅胶干燥
法保存的干叶提取得率 (以鲜叶计为 70～ 110μg /g ) 高得多 [ 7] .
图 1　刺桫椤总 DNA的电泳结果
　　 M.λDN A ( 48kb) ; 1. 鲜叶提得的 DN A ; 2、 3、 4、 5、 6以 SDS提取液保存 7d、
15d、 30d、 90d、 180d提得的 DNA; 7～ 21居群 01部分样品以 SDS提取液保存 11d
提得的 DN A.
从贵州、四川、 福建 3省 8个刺
桫椤天然居群采集的 91份样品 (表
1) , 用 SDS提取液保存 1～ 14 d不
等 , 提得的 DNA经检测质量基本一
致 (图 1泳道 7～ 21示出其中部分结
果 ) . 由此可见 , 用 SDS提取液保存
的刺桫椤叶片组织提取 DNA能获
得与鲜叶一致的高纯度、完整性好的
结果 .
2. 2　RAPD分析
用筛选的 RAPD随机引物 S35 ( T TCCGAACCC)、 S1405 ( CCCGAAGCG A)分别对鲜叶提得的
DNA及以 SDS提取液保存不同时间的叶片提得的 DNA进行 RAPD扩增反应 , 结果 (图 2) 表明 , 引
物 S35扩增得到一条清晰的扩增带 ( 730bp) ,引物 S1405扩增得到 6条清晰度不一的扩增带 ( 2050 bp、
1750 bp、 1100 bp、 960 bp、 790 bp、 680 bp) , 用 SDS提取液保存 7 d、 15 d、 30 d、 90 d、 180 d五
份样品提取的 DNA与用新鲜样品提取的 DNA的 RAPD扩增带型完全一致 .
图 2　 RAPD分析结果
　　 1和 7, 鲜叶 ; 2和 8、 3和 9、 4和 10、 5和 11、 6和 12以 SDS
提取液保存 7 d、 15 d、 30 d、 90 d、 180 d; ( 1～ 6, 引物 S35; 7～
12, 引物 S1405) ; M . 100bp DN A ladd er
3　讨论
国外对野外采集的用于提取 DNA的植物材
料保存方法已经进行了许多研究 . Doyle& Dick-
son[ 1]用 FA A ( 70%乙醇∶甲醛∶冰醋酸 , 18∶ 1
∶ 1)、 乙醇∶醋酸 ( 3∶ 1)、 氯仿∶乙醇 ( 4∶ 3)、
70%乙醇以及 10% NaCl处理保存 Solanum
glut inosum的叶片 ,结果这些化学试剂均使 DNA
降解 . Pyle& Adams[ 2]尝试了干燥、 冻存和化学
试剂 3类共 27种不同保存方法 ,从鲜叶、冻存及
干燥处理的叶片中得到分子量较大 ( 35～ 50 kb)、
得率较高的基因组 DNA, 但发现所有化学试剂保存的叶片均无法获得高分子量的 DNA. 从 42℃干燥
的 Juniperus ashei及 J . v irginiana叶片中得到分子量较大的 DNA, 但得率仅是鲜叶的十分之一 ,而从
Mognol ia grandif lora干叶中获得的 DNA分子量仅为 2～ 20 kb. Rogstad [5 ]发现用饱和 NaCl- CT AB
溶液保存的 Podophyllum、 Polyalthia和 Taraxacum叶片提得的 DNA与新鲜材料 DNA分子量相近 ,
并对之进行了限制性酶切 , 得到与新鲜材料 DNA相同的结果 , 但未进行 PCR检验 , 且用这种方法保
存的材料 DNA得率比鲜叶要低 10% ～ 30% , 因此他们认为从新鲜材料中提取 DNA或把材料用液氮
研磨后贮存于 - 70℃是更好的选择 . Chase& Hills[ 4 ]建立了用硅胶快速干燥叶片来保存植物材料的方
法 , 对于 Malpighiaceae和 Haemodoraceae等物种可获得分子量与鲜叶相近的 DNA,但 Gaudichaudia
cynanchoides的干叶 DNA表现出一定程度的降解 , 同时硅胶干燥法得率也较低 , 因此他们也认为用鲜
叶直接提取 DNA是最佳的方法 .作者在对刺桫椤的研究中也发现用硅胶干燥的叶片提取的 DNA颜色
较深 , 杂质含量较多 , 影响 RAPD的稳定性 , 而且干叶的 DNA得率远低于鲜叶 .
在对刺桫椤的研究中作者发现 Guillemaut et al建立的用于提取 DNA的 SDS提取法中所使用的
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SDS提取液在室温下可有效地抑制 DNase的活性 ,因此尝试直接用 SDS提取液来保存植物材料 ,结果
令人满意 .与上述各种植物材料保存方法不同的是用 SDS提取液保存植物材料不必添加除新鲜材料提
取法外的任何其它化学试剂 , 也无需增加提纯步骤 . 该法只对新鲜材料提取法在时间和空间上做一些
变更 , 并通过适当提高巯基乙醇的浓度至 500 m mol /L来避免已游离于溶液中的 DNA及多酚类物质
的氧化 , 室温下避光保存以防紫外线对 DNA的损伤 . 实验证明 , 用该法保存刺桫椤叶片组织长达 180
d仍能保持 DNA的完整性 (考虑到这个时间足以满足大多数实验的需要 ,因此作者没有进行更长保存
时间的研究 ) ,并获得与鲜叶一致的得率及 RAPD扩增结果 .实验建立的方法完全可以替代液氮或干冰
冻存法来保存用于 DNA提取的刺桫椤叶片组织 .至于刺桫椤以外的其它植物材料的保存 ,该法是否同
样适用 , 有待进一步的研究 .
参考文献:
[ 1] Doy le J J, Dickson E E. Preserv ation of plant samples fo r DN A restriction endonuclea se analysis [ J]. T axon, 1987,
36: 715- 722.
[ 2] Py le M M , Adams R P. In situ preserv ation of DNA in plant specimens [ J]. Taxon, 1989, 38: 576- 581.
[ 3 ] Liston A, Reiseber g L D, Adams R P, Do N & Zhu G. A meth od fo r collec tion dried plant specimens fo r DN A and
iso zyme analysis, and the r esults o f a field test in Xinjiang , China [ J]. Annals M isso Bo t Ga rd, 1990, 77: 859-
863.
[ 4 ] Chase H W, Hills H H. Silica gel: An ideal mate rial fo r field preserv ation o f leaf samples fo r DN A studies [ J]. T ax-
on, 1991, 40: 215- 220.
[ 5 ] Rog stad S H. Sa turated NaCl- CT AB so lution as a means of field preserv ation o f leaves for DN A ana ly sis [ J]. T ax-
on, 1992, 41: 701- 708.
[ 6 ] Guillemaut P, Marechal- Drouard L. Iso lation of plant DN A: A fast, inexpensiv e, and reliable method [ J]. Plant
Mo l Boil Rep, 1992, 10: 61- 65.
[ 7] 王经源 , 黄儒珠 . 刺桫椤 DN A的简便快速提取方法 [ J]. 福建林学院学报 , 2001, 21 ( 4): 376- 379.
A Method for Field Preservation of Leaves Tissue
for DNA Preparation of Alsophila spinulosa
WANG Jing-yuan, HUANG Ru-zhu
(Bioengineering College , Fujian Teachers University , Fuz hou 350007, China )
Abstract: A preserv ativ e medium which consisted of 1. 5% SDS ( sodium dodecy l sulfa te) , 100 m
mol / L Tris ( pH 8. 3) , 50 m mo l /L EDT A ( pH 8. 0) , 500 m mol /L NaCl and 500 m mol /L β-
sulfhydryl-ethanol , w as applied to field preserv ation of leaves ti ssue fo r DN A preparation o f Alsophila
spinulosa. It was indica ted tha t the isolated DN A from the leaves tissue preserv ed in the medium fo r
7d、 15d、 30d、 90d、 180d w as 48 kb, and DN A yield was 600～ 1200μg /g· FW. This results w as highly
simi lar to that f rom fresh leaves tissue. The isolated DN A from the preserv ed leaves tissue w ere used
fo r RAPD analy zing and i t was show ed tha t the preserved leaves tissue f rom same individual w as ob-
tained a same result as f rom fresh leaves. High-quali ty DN A of 91 individua ls f rom 8 populations of
Alsophila spinulosa was prepa red by this method. This iso la ted DN A has been use to experiments base
on PCR technolo gy.
Key words: DN A prepa ra tion, field preserva tion, RAPD, Alsophila spinulosa
(责任编辑　余　望 )
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