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流式细胞术测定银叶真藓(Bryum argenteum Hedw.)基因组大小



全 文 :分子植物育种,2016年,第 14卷,第 4期,第 858-863页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.4, 858-863
研究报告
Research Report
流式细胞术测定银叶真藓(Bryum argenteum Hedw.)基因组大小
汪琛颖
郑州师范学院生命科学学院,郑州, 450044
通讯作者, cywang2013@hotmail.com
摘 要 银叶真藓(Bryum argenteum Hedw.)是藓类植物真藓科真藓属的模式种。世界广布种。该研究以银叶
真藓为试材,采用流式细胞术,首先选用同属于藓类植物而且已公布基因组大小的小立碗藓(Physcomitrella
patens)作为内参,估算得到银叶真藓基因组大小为 568~589 Mb。鉴于参照的小立碗藓基因组大小为 487 Mb
是测序结果,可能在实际反映其基因组大小上有偏差,所以作者又选取了既有测序结果(125 Mb)又有流式细
胞术估算基因组大小数据(157 Mb)的拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为内参,对银叶真藓基因组大小进行了
再次估算。结果表明,银叶真藓的基因组大小为 728.09±77.84 Mb,1C DNA含量约为 0.75 pg。该研究所得数
据有助于银叶真藓基因组测序的研究。
关键词 银叶真藓,基因组大小,流式细胞术,小立碗藓,拟南芥
Measuring Genome Size in Silver Moss Bryum argenteum Hedw. by Flow
Cytometry
Wang Chenying
College of Life Sciences, Zhenzhou Normal University, Zhengzhou, 450044
Corresponding author, cywang2013@hotmail.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000858
Abstract Bryum argenteum Hedw., which belongs to Bryum in Bryaceae, is type specie of moss. The world has
cosmopolitan species. In this study, the author firstly selected Physcomitrella patens as an internal reference, which
was the homogeneous moss and the genome size was announced, using B. argenteum as a testing material and flow
cytometry measurements. The estimated genome size of B. argenteum was 568~589 Mb. In view of the referential
genome size of P. patens obtained by genome sequencing was 487 Mb, the genome size might be reflected with
deviation in fact. Therefore, the author secondly selected the Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Columbia
as an internal reference, which had both the sequencing results (125 Mb) and genome size data (157 Mb) estimated
by the flow cytometry. And the author estimated the genome size of B. argenteum again. Finally, the result
indicated that the genome size of B. argenteum was 728.09±77.84 Mb and 1C DNA was about 0.75 pg. The data
obtained in this study is helpful to the research on genome sequencing of B. argenteum.
Keywords Bryum argenteum, Genome size, Flow cytometry, Physcomitrella patens, Arabidopsis thaliana
基金项目:本研究由河南省科技计划资助项目(132300410358)和河南省教育厅高等学校重点科研项目(16A180053)共同资助
银叶真藓(Bryum argenteum Hedw.)植物体呈银
白色至淡绿色,孢蒴呈明显的红色,成团状簇生或者
疏松丛生。近距离观察时,其颜色很鲜亮,但是由于
其植株非常矮小,所以并不为公众所知。银叶真藓的
配子枝端可以轻易地断裂并传播,进而完成其繁殖
(Glime, 2013)。银叶真藓是少数几个能够在全球发现
的苔藓植物种类之一(Stark et al., 2010)。
1801年,Hedwig以银叶真藓为模式标本建立了
真藓属 Bryum Hedw.。1824年,Schwaegrichen以此为
基础建立了真藓科 Bryaceae Schwaegr.这一类群。真
藓科的传统分类主要是依据不同的假设,根据可比
较的形态学特征来进行的,但是以单倍的配子体世
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
代为基础所构建的分类学假设会与基于二倍的孢子
体世代的假说相冲突(Dixon, 1932)。Cox和 Hedder-
son (1999; 2003)利用 DNA 序列分子数据,Pedersen
等(2003)根据形态学数据结合分子数据,对真藓科的
系统发育分析得出的真藓科分类,显示出与经典分
类系统的巨大分歧。真藓属是藓类植物中种数最多
的属之一,也是藓类中形体变异最复杂的类群(陈邦
杰, 1963)。目前,较为一致的做法是通过开发和选用
不同分类阶元的基因及基因间隔区或内含子的
DNA序列,并开展多基因联合分析,再结合形态学
研究提供的系统发育信息证据来解决真藓科的系统
发育研究中出现的有争议的问题。
基因组序列的研究为我们提供全面解析各种生
命现象如生物的各种遗传性状、生物的起源、进化、
发育以及生理等在分子水平上的前提和基础。据此,
作者认为,鉴于 B. argenteum在真藓科分类上的特殊
地位,如若对其全基因组进行测序研究,将极有可能
为苔藓植物,尤其是为真藓科各物种的研究提供基
础背景资料,从而有可能促进或加快对真藓科植物
系统发育、分类及基因功能的研究,在较短的时间内
实现苔藓植物研究的跨越式发展。
对银叶真藓基因组大小进行测定,并据此估测
其 DNA含量,是进行其全基因组测序、基因组文库
的构建以及其进化研究的必要基础之一,同时对于
测序工作前期预算的评估亦具有重要意义。
本研究采用目前进行物种基因组大小测定常用
的方法之一—流式细胞术的方法。作者曾成功应用
此方法分析蕙兰基因组的大小(汪琛颖等, 2015)。应
用此法对苔藓植物物种基因组大小进行测定目前尚
未见报道。
该研究利用银叶真藓(B. argenteum)为待测对象,
分别选取小立碗藓(P. patens)或拟南芥(A. thaliana)
作为内参,用流式细胞仪对样品进行重复试验,通过
比较、计算测定银叶真藓基因组大小,以期为银叶真
藓其基因组等相关研究提供必要的基础数据。
1结果与分析
1.1以小立碗藓为内参的银叶真藓基因组大小分析
用 Galbraith buffer缓冲液对小立碗藓和银叶真
藓分别处理后进行的流式分析中,变异系数(coeffi
cient of variation, CV)均在 3.5%以内,Galbraith 缓冲
液制备的内参和待测样品的粒子团清晰、明确、集中
(图 1)。
小立碗藓(P. patens)属于葫芦藓科(Funariaceae)
小立碗藓属(Physcominella)植物,是第一个被测序的
苔藓植物基因组,其基因组大小为 487 Mb (Rensing
et al., 2008)。小立碗藓、银叶真藓流式细胞仪测定结
果见图 2、图 3。小立碗藓、银叶真藓的 4次流式细胞
仪检测结果都分别出现了 3个峰,且 3个峰的出峰
位置均保持稳定。第 2个峰的出峰位置为第 1个峰
的 2倍,第三个峰是第二个峰的两倍。由此可见,第 1
峰为 G0/G1期的 DNA含量,第 2个峰为 G2/M期的
DNA 含量。比较样品银叶真藓与内参小立碗藓
G0/G1期的峰值后大小发现,单倍体银叶真藓基因
组要大于小立碗藓的,约为后者的 1.17倍(表 1),故
估算出的银叶真藓基因组大小是 568.26±21.05 Mb,
或相对 DNA 含量是 0.59±0.02 pg (以 1 pg DNA=
0.965×109 bp计算) (Straus, 1971)。
1.2以拟南芥为内参估算银叶真藓基因组大小
模式植物拟南芥(A. thaliana)属于十字花科(Bras-
sicaceae),是目前植物基础研究中最受欢迎的物种之
一。其基因组序列是第一个被报道的植物基因组序
列。它的二倍体基因组大小是 125Mb (The Arabidop-
sis Genome Initiative, 2000)。拟南芥、银叶真藓的流式
细胞仪测定结果(图 4)。拟南芥所有供试材料的流式
细胞仪测定结果均有出峰位置保持稳定的三个峰。
且第 2个峰的出峰位置为第 1个峰的 2倍,第三个
峰是第二个峰的两倍。故第 1个为处于 G0/G1期的
2C DNA含量峰,第 2个为 DNA复制后处于 G2/M
期的 4C含量峰。两样本混合后的检测结果显示,银
叶真藓的 1C DNA含量峰与拟南芥的 4C DNA含量
峰有部分重叠现象。比较样品银叶真藓 G2/M期与
内参拟南芥 G0/G1期的峰值大小(表 2)后估算单倍
体银叶真藓基因组大小是 579±61.98 Mb,相对 DNA
含量是 0.60±0.06 pg。
2讨论
准确估计 DNA C值对于完整理解植物或动物
基因组是非常重要的(Bennett et al., 2000)。随着非模
式生物全基因组测序和其他基因组研究的迅速发
展,越来越需要一种能够在大范围物种内使用的强
大且容易的方法来估计真核生物基因组的大小。而
使用流式细胞术的溴化乙锭(propidium iodide, PI)染
色法,因其相对快捷,适用于各种生物材料,可以提
供大量的核信息而成为一种针对测定基因组大小的
有效的方法。使用这种方法时,细胞核可以被能够嵌
859
入 DNA大沟的 PI染色,通过比较已知基因组大小
的标准品和未知基因组大小的样品的相对荧光强
度,从而可以估算未知样品的基因组大小(Hare and
Johnston, 2011)。
该研究选取小立碗藓、拟南芥分别作为内参,主
要是考虑了两个方面的原因:第一,进行植物基因组
大小测定时,首选植物材料作为标准参照物(John-
ston et al., 1999)。第二,小立碗藓与银叶真藓同属于
藓类植物,植株均为单倍配子体,形体较为接近,在
获取细胞核悬液时处理方法相似;在预备试验中,发
现两者的混合样本的检测基因组测定峰无重叠现
象,这为以已知基因组大小的小立碗藓作为内标来
估算银叶真藓基因组大小提供了准确性保障。而拟
南芥(A. thaliana)属于被子植物,其植株是二倍体(孢
流式细胞术测定银叶真藓(Bryum argenteum Hedw.)基因组大小
Measuring Genome Size in Silver Moss Bryum argenteum Hedw. by Flow Cytometry
图 1小立碗藓(A),银叶真藓(B)及两者混合样品(C)PI染色效果
注: PI-A:荧光总量; PI-H:最大荧光强度
Figure 1 PI dyeing effect of P. Patens (A), B. argenteum (B) and mixed samples (C)
Note: PI-A: Total fluorescence of particle; PI-H: Maximum flurescence intensity
图 2小立碗藓(A),银叶真藓(B)的流式细胞仪分析
注 : 1 代表小立碗藓 1C DNA 含量峰 , 2 代表小立碗藓 2C
DNA含量峰, 3代表小立碗藓 4C DNA含量峰, 4代表银叶真
藓 1C DNA含量峰, 5代表银叶真藓 2C DNA含量峰, 6代表
银叶真藓 4C DNA含量峰; PI-A:荧光总量; Count:峰值
Figure 2 Flow cytometric analysis of PI-strained nuclei isolated
from P. Patens (A) or B. argenteum (B)
Note: Peak 1 stands for the nuclei with 1C DNA content of P.
Patens, Peak 2 stands for the nuclei with 2C DNA content of P.
Patens, Peak 3 stands for the nuclei with 4C DNA content of P.
patens, Peak 4 stands for the nuclei with 1C DNA content of B.
argenteum, Peak 5 stands for the nuclei with 2C DNA content of
B. argenteum, Peak 6 stands for the nuclei with 4C DNA content
of B. argenteum; PI-A: Total fluorescence of particle; Count:
Peak values
图 3银叶真藓及小立碗藓混合样品流式细胞仪分析
注: PI-A:荧光总量; Count:峰值
Figure 3 Flow cytometric analysis of PI-strained nuclei isolated
from P. patens and B. argenteum mixed samples
Note: PI-A: Total fluorescence of particle; Count: Peak values
图 4拟南芥(A)及拟南芥、银叶真藓藓混合样品(B)流式细胞仪
分析
注: 7代表拟南芥 2C DNA含量峰; 8代表拟南芥 4C DNA含
量峰; 9代表拟南芥 8C DNA含量峰
Figure 4 Flow cytometric analysis of PI-strained nuclei isolated
from A. thaliana (A), A. thaliana and B. argenteum mixed samples
(B)
Note: Peak 4 stands for the nuclei with 2C DNA content of A.
thaliana; Peak 8 stands for the nuclei with 4C DNA content of A.
thaliana; Peak 9 stands for the nuclei with 8C DNA content of A.
thaliana
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
注: A:测定重复; B:样品峰值(G0/G1峰); C:变异系数(%); D:样品峰值 G2/M峰); E: 变异系数(%); F:内参峰值(G0/G1峰); G:
变异系数(%); H: (G2/M峰)银叶真藓 /拟南芥(G0/G1)峰; I: 银叶真藓基因组大小 (Mb); J:银叶真藓相对 DNA含量(pg)
Note: A: Repetition; B: G0/G1 Peak value of sample (B. argenteum); C: CV (%); D: G2/M Peak value of sample (B. argenteum); E: CV
(%); F: G0/G1 Peak value of internal reference (A. thaliana); G: CV(%); H: G2/M Peak value of sample / G0/G1 Peak value of internal
reference; I: Genome size of B. argenteum (Mb); J: Relative content of DNA (pg)
表 2流式细胞仪测定的样品(银叶真藓)和内参(拟南芥)
Table 2 Test of B. argenteum and A. thaliana using flow cytometry
I
572.23
666.69
520.75
559.07
579±61.98
J
0.59
0.69
0.54
0.58
0.60±0.06
A
1
2
3
4
均 值 ±
标准差
M±SD
B
64 841
66 958
66 011
65 705
65 878.5±873.57
C
2.28
1.03
1.95
1.65
1.73±0.53
D
143 552
175 228
128 751
128 751
144 070.5±
2 912.19
E
2.16
1.8
1.52
1.51
1.75±0.31
F
31 358
32 854
30 905
28 787
30 976±1 680.24
G
1.71
2.88
1.26
3.04
2.22±0.87
H
4.58
5.33
4.17
4.47
4.64±0.50
子体),与银叶真藓形体差距较大。但是有利用流式细
胞术测定其基因组大小的报道(Bennett et al., 2003),
而本研究用以估算银叶真藓基因组大小的小立碗藓
基因组大小(487 Mb)数据是基因组测序结果(Rens-
ing et al., 2008)。在本研究中,以通过基因组测序获得
的拟南芥的基因组大小为 125 Mb作为估算银叶真
藓基因组大小的参照,得到银叶真藓基因组大小为
579±61.98 Mb,这与以 487 Mb作为小立碗藓基因组
大小对银叶真藓基因组大小的估算值 568.26±21.05Mb
相差无几。但作者认为,银叶真藓基因组大小可能会
高于此数值。Bennett等人使用流式细胞术测得的拟
南芥的基因组大小为 157 Mb,而测序得到的 125 Mb
中仅包括 115.4 Mb 测序区加上未测序的着丝粒和
核糖体 DNA区粗略估计的 10 Mb。这其中的误差代
表着在异染色质中的未被测序的缺口(gap)中重复序
列。而拟南芥全基因组测序应是在端粒、核仁组织区
或着丝粒中无缺口保留为止,所以他提出仍需要提
供第一个精确的被子植物 C-值来作为基准校准标
准,以确保在拟南芥中未有基因丢失,特别是在着丝
粒区域,而这一区域的大小明显大于过去所预计的
情况(Bennett et al., 2003)。但是在本研究中,若以
157 Mb作为拟南芥基因组大小的参照数据的话,那
么银叶真藓基因组大小将是 728.09±77.84 Mb。相
应,小立碗藓流式细胞术测定的基因组大小将是
623.93±61.79 Mb,而这一数据将是目前公布的其基
因组大小的 1.28倍。
选用“Galbraith”buffer作为裂解液以制备待测
样品及内参的细胞核悬液的主要原因是 Galbraith等
(1991)曾成功用它制备拟南芥细胞核悬液,以其处理
的动物或植物的细胞核可以稳定达 30 h。选用与拟
南芥处理同样的裂解液对小立碗藓,银叶真藓材料
进行处理,在获得清晰、明确、集中的粒子团的同时,
表 1流式细胞仪测定的样品(银叶真藓)和内参(小立碗藓)
Table 1 Test of B. argenteum and P. patens using flow cytometry
A
1
2
3
4
均值±标准差
M±SD
B
56 844
58 461
54 438
52 197
55 485±2 745.33
C
3.47
1.15
2.37
3.22
2.38
D
49 772
49 519
48 446
42 747
47 621±3 299.78
E
4.73
2.07
0.17
2.52
4.83
F
1.14
1.18
1.12
1.22
1.17±0.04
G
556.20
574.94
547.23
594.66
568.26±21.05
H
0.58
0.60
0.57
0.62
0.59±0.02
注: A:测定重复; B:样品峰值 (G0/G1峰); C:变异系数(%); D:内参峰值(G0/G1峰); E:变异系数(%); F: (G0/G1峰)银叶真藓 /小
立碗藓; G:银叶真藓基因组大小(Mb); H:银叶真藓相对 DNA含量(pg)
Note: A: Repetition; B: G0/G1 Peak value of sample (B. argenteum); C: CV (%); D: G0/G1 Peak value of internal reference (P. patens);
E: CV (%); F: (G0/G1) Peak value of sample/Peak value of internal reference; G: Genome size of B.argenteum (Mb); H: Relative
Content of DNA (pg)
861
亦保证不同组数据之间比较的可参照性。
3材料与方法
3.1材料
银叶真藓(B. argenteum)配子体植株采自郑州师
范学院校园,小立碗藓(P. patens)配子体植株及拟南
芥(A. thaliana)植株由华东师范大学孙越教授馈赠(植
株培养方法: Bierfreund et al., 2003; Sun et al., 2010)。
3.2细胞核悬液的制备及 DNA特异性染色
小立碗藓(或拟南芥)及银叶真藓材料各准备 4份,
每份 10 mg新鲜配子枝(或幼嫩叶片),用去离子水冲
洗,放滤纸上控水,然后置于冰浴塑料培养皿中,分
别加入 1.5 mL冰冻的 Galbraith buffer缓冲液(配方:
Galbraith et al., 1983)。确保材料浸没在解离液中,用
新手术刀片将叶片一次性快速切碎,目的是使细胞
核游离于其中。用 1 mL移液器反复吸取几次以混匀
样品液,过 300目尼龙筛网,滤液置于 2 mL离心管
中。将小立碗藓(或拟南芥)细胞核悬液和银叶真藓细
胞核悬液按等体积分别混匀,即得到混合细胞核悬
液,置于冰上备用。向上述冰浴中的 2 mL离心管中
的细胞核悬液中加入 PI 染料(1 mg/mL)至终浓度
50 μg/mL,轻摇,放 4℃冰箱、避光、染色 30 min。
3.3流式细胞仪分析
开启流式细胞仪 ACEANovoCyteTM (艾森生物),
检测 PI的发射荧光强度,样品流速设定为 14μL/min,
每次样本至少收集 20 000个细胞。保持流式细胞仪
参数不变,用内标法,将内参小立碗藓(或拟南芥)及
待测样本银叶真藓细胞核悬液及混合液分别放到流
式细胞仪上测定。每样本重复测定 2次。利用流式细
胞仪自带软件(NovoExpress1.0.2)进行图像和数据的
处理分析。
总之,该研究利用流式细胞术,对银叶真藓基因
组大小进行测定,估测该物种的 DNA含量,为该物
种全基因组测序工作前期预算提供参考。另外,对小
立碗藓基因组大小亦提供流式细胞术测定数据,这
无疑为小立碗藓全基因组测序(除了目前公布的测序
数据以外),补充诸如叶绿体拷贝数、重复序列、端粒
及着丝粒序列等大小方面的差异值,有助于避免基
因的遗漏等方面的研究。
作者贡献
汪琛颖为本研究的实验设计、实验研究的执行
人,并且完成数据分析、论文写作及修改等工作。
致谢
本研究由河南省科技计划资助项目(132300410358)
和河南省教育厅高等学校重点科研项目(16A180053)
共同资助。感谢华东师范大学孙越教授馈赠实验材
料。感谢中国科学院植物研究所系统与进化植物学
国家重点实验室于宁宁博士在文献查找方面提供的
大力帮助。
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Hicks K.A., Hughes J., Lohr M., Mayer K., Melkozernov A.,
Murata T., Nelson D.R., Pils B., Prigge M., Reiss B., Renner
T., Rombauts S., Rushton P.J., Sanderfoot A., Schween G.,
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