全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:1616-1619，1600
文章编号:1001-6880(2015)9-1616-05
收稿日期:2015-05-05 接受日期:2015-07-03
* 通讯作者 Tel:86-997-4681608;E-mail:bhj67@ 163． com
叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH自由基活性研究
马国财1，2，赵丽娜1，白红进2*
1 塔里木大学生命科学学院 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源
保护利用重点实验室;2 塔里木大学分析测试中心，阿拉尔 843300
摘 要:以叉枝鸦葱为研究对象，用微波辅助提取法提取总黄酮，采用 DPPH法研究叉枝鸦葱总黄酮对自由基的
消除作用。同时，采用 Graphpad Prism 5． 0 软件进行动力学模型拟合。结果表明:叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH自由
基具的清除作用大于芦丁和 Vc，清除率为 41． 72% ～ 87． 72%，IC50为 5． 6 μg /mL。动力学模型拟合后所得方程
Y =(Y0-NS)* exp(-K* X) + NS，充分反映了叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH自由基的实际消除效应，在样品浓度为
20 μg /mL时效应关系最佳。
关键词:叉枝鸦葱;总黄酮;DPPH自由基;反应动力学
中图分类号:Ｒ284． 2;Q949． 95 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 09． 019
DPPH Free Ｒadical Scavenging Efficiency of Total
Flavonoids from Scorzonera divaricata
MA Gou-cai1，2，ZHAO Li-na1，BAI Hong-jin2*
1College of Life Science / Key Laboratory of Protection ＆ Utilization of Biological Ｒesources in Tarim Basin of Xinjiang Production
and Construction Corps，Tarim University;2 Analytic ＆ Test Center，Tarim University，Xinjiang Alar 843300，China
Abstract:To investigate the antioxidant activity of total flavonoids in Scorzonera divaricata，microwave-assisted extraction
method was used to extract total flavonoids． Antioxidant activity was measured by DPPH free radial scavenging assay．
Meanwhile，the dynamic model of response curves was simulated by Graphpad Prism 5． 0 software． The results showed
that the total flavonoids had higher scavenging activity on DPPH free radial than Vc and rutin，clearance rate was
41. 72%-87． 72%，IC50 was 5． 6 μg /mL． A kinetics equation was established:Y =(Y0-NS)* exp(-K* X)+ NS，which very
well reflected the efficiency of free radical scavenging． The appropriate concentration of the sample was 20 μg /mL．
Key words:Scorzonera divaricata;total flavonoids;DPPH free radical;kinetics of reaction
叉枝鸦葱(Scorzonera divaricata)俗称碱草，系菊
科鸦葱属植物，多生于草原、半荒漠和荒漠地带，能
够固定沙丘、戈壁和干河床上。全草入药，能清热解
毒，主治疗毒恶疮［1］。目前，鸦葱属植物关于化学
成分的研究文献较多，主要有挥发油、无机物质、氨
基酸、萜类、甾体类、鞣质、黄酮类化合物等［2-9］，文献
对叉枝鸦葱的研究报道较少。陶大勇［2］等采用分
光光度法测定了塔里木盆地叉枝鸦葱中鞣质的含
量，陈瑛［3］等对叉枝鸦葱有机溶剂提取物中生物碱
进行了测定，二者都没有对其所含的鞣质和生物碱
单体化合物进行进一步的分离与检测。
Harman［10］提出的自由基学说认为:自由基攻击
生命大分子造成的损伤是引起衰老的根本原因，也
是诱发肿瘤等疾病的重要原因，这一学说已经广泛
的被人们所日益接受。近二十年来，对自由基及其
清除率的研究已经成为天然产物研究的热点，各国
研究人员越来越多的将注意力集中于筛选有阻断自
由基形成或抑制细胞过氧化活性的天然药物研究，
其中对黄酮类化合物的研究是自由基清除剂研究的
热门领域之一［11］。
本文利用紫外-可见分光光度法对叉枝鸦葱全
草中总黄酮清除 DPPH 自由基活性进行研究，为叉
枝鸦葱的合理开发利用和提高其生物利用度提供了
科学依据。
1 仪器与材料
1． 1 仪器
CAＲY-100 紫外可见光分光光度计(澳大利亚
VAＲIAN公司) ;KQ-400KDE 台式通用超声波清洗
器(昆山市超声仪器有限公司) ;JA1203 电子天平
(上海恒平科学仪器有限公司)。
1． 2 试剂
芦丁对照品(德国 Dr． Ehrdnstorfer 公司 批号:
60922) ;DPPH自由基(和光纯药工业株式会社，批
号:ALL1930) ;乙醇，硝酸铝，氢氧化钠，亚硝酸钠，
三氯化铝等，均为国产分析纯。
1． 3 材料
叉枝芽葱于 2009 年 5 月，采集于新疆建设兵团
第四十五团。自然阴干，粉碎，过 60 目筛，待用。经
塔里木大学植物科学学院刘艳萍副教授鉴定为菊科
(Compositae)鸦葱属(Scorzonera)叉枝鸦葱(Scorzon-
era divaricata)植物。
2 实验方法
2． 1 叉枝鸦葱总黄酮提取
精密称取叉枝鸦葱粉末 1． 000 g，加 65%乙醇
20 mL，微波提取 20 min，功率 40 W，滤过，残渣再加
入 65%乙醇 20 mL，重复提取 2 次，过滤，合并滤液，
定容于 100 mL容量瓶中，备用。
2． 2 芦丁对照品溶液的制备
精密称取 120 ℃ 干燥至恒重的芦丁对照品
13. 60 mg 置 50 mL 容量瓶中，加 65%乙醇 20 mL，
超声使溶解，再加 65%乙醇定容至刻度，摇匀即得。
芦丁对照品浓度为 0． 272 mg /mL，备用。
2． 3 显色条件的考察［12］
2． 3． 1 显色系统的筛选
方法 1:分别精密吸取 0． 5 mL的芦丁标准品溶
液和 2 mL样品溶液于 10 mL容量瓶中，加 0． 1 mol /
L 的 AlCl3 溶液 2 mL，摇匀，放置 6 min;再加入 1
mol /L 的 4% NaoH 溶液 3 mL，用 65%乙醇溶液定
容，摇匀，放置 10 min，测定。
方法 2:分别精密吸取 0． 5 mol的芦丁标准溶液
和 2 mL 的样品溶液于 10 mL 容量瓶中，加 5%
NaNO2 溶液 0． 4 mL 摇匀，放置 6 min;加 10% Al
(NO3)30． 4 mL，摇匀，放置 6min;再加 4% NaOH 溶
液 4 mL，65%乙醇定容，摇匀，放置 10 min，测定。
结果表明:方法 2 显色灵敏、稳定，故采用
NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色系统
2． 3． 2 最大吸收波长的确定
精密称取芦丁对照品溶液 0． 5 mL 和 2． 1 项下
样品溶液 2 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，加 65%
乙醇至 3 mL，按 2． 3． 1 项下方法 2 进行显色，测定。
以 65%乙醇平行实验为空白参比，于 400 ～ 800 nm
波长范围内扫描。
2． 4 标准曲线的绘制［13］
精密吸取芦丁对照品溶液 0． 0、1． 0、2． 0、3． 0、
4． 0、5． 0、6． 0 mL，分别置于容量瓶中，按 2． 3． 1 项下
方法 2 操作，以第一份溶液为空白，在 501 nm 处测
定吸光度。吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐
标，绘制标准曲线。得回归方程 A = 0． 0124X-
0. 0322(r = 0． 9996) ，表明芦丁在 27． 2 ～ 163． 2 μg /
mL范围内与吸光度值线性关系良好。
2． 5 叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH 的反应动力学研
究
将 2 mL不同浓度叉枝鸦葱总黄酮提取液与 2
mL、40 μg /mL的 DPPH自由基反应，以相同浓度的
芦丁和 VC为对照，测定不同反应时间的吸光度，研
究不同浓度叉枝鸦葱总黄酮与 DPPH自由基反应随
时间推移的动力学关系，以时间为横坐标，吸光度为
纵坐标绘制不同浓度的叉枝鸦葱总黄酮与 DPPH自
由基随时间推移的动力学关系曲线图。
2． 6 叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH 自由基的清除
率［14，15］
在叉枝鸦葱总黄酮清除自由基的反应动力学研
究的基础上，测定反应平衡时的吸光度，按下式计算
不同浓度叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH 自由基的清除
率:K =［1-(Ai-Aj)/Ac］× 100%。式中，K 为叉枝
鸦葱总黄酮对 DPPH 自由基的清除率，Ai 为加式样
反应后 DPPH溶液的吸光度 Aj 为不加 DPPH，只加
式样的溶液的吸光度;Ac 为不加式样，只加 DPPH
的溶液的吸光度。
0.8
0.6
0.4
0.2
0
400% 500% 600% 700% 800
Wave%length(nm)
Ab
s
图 1 芦丁和样品的吸收曲线
Fig. 1 Absorption curves of rutin and sample
1
0.5
0
400% 500% 600% 700% 800
Wave%length(nm)
Ab
s
图 2 DPPH吸收光谱
Fig. 2 DPPH absorption spectrum
7161Vol. 27 马国财等:叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH自由基活性研究
2． 7 叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH 自由基的 IC50值
的计算
IC50为半数抑制率浓度，即自由基清除率为
50%时的自由基清除剂的浓度。运用 Graphpad
Prism 5． 0 计算 IC50。
3 结果与分析
3． 1 最大吸收波长的确定
对照品和样品溶液均在 501 nm 波长处有最大
吸收峰，故以 501 nm为测定波长(见图 1)。
3． 2 叉枝鸦葱总黄酮的提取
经测定，叉枝鸦葱总黄酮提取率为 2． 79 g /
100g。
3． 3 波长-吸光度之间的关系
测定在乙醇-水介质中的活性时，选择测定波长
为 517 nm(见图 2)。
3． 4 叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH 自由基的反应动
力学研究结果
不同浓度叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH自由基的
反应动力学曲线图(见图 3)。同时采用 Graphpad
Prism 5． 0 对实验数据进行方程拟合，数学模型为:Y
=(Y0-NS)* exp(-K* X)+ NS，其中:Y0 表示最
大吸光度;NS表示当时间达到一定量时，吸光度的
最小极值;K 表示吸光度与时间对应的斜率。拟合
曲线方程各项数据(见表 1) ，并归纳 5 组拟合曲线
方程(见表 2)。
0.6
0.4
0.2
0
A
bs
空白 Blank
样品 Sample
芦丁 Rutin
Vc
0.6
0.4
0.2
0
A
bs
空白 Blank
样品 Sample
芦丁 Rutin
Vc
0.6
0.4
0.2
0
A
bs
空白 Blank
样品 Sample
芦丁 Rutin
Vc
0.6
0.4
0.2
0
A
bs
0.6
0.4
0.2
0
A
bs
空白 Blank
样品 Sample
芦丁 Rutin
Vc
空白 Blank
样品 Sample
芦丁 Rutin
Vc
0 20% 40% 60% 80
时间 Time(min)
0 20% 40% 60% 80
时间 Time(min)
0 20% 40% 60% 80
时间 Time(min)
0 20% 40% 60% 80
时间 Time(min)
0 20% 40% 60% 80
时间 Time(min)
图 3 各浓度拟合曲线图
Fig. 3 Fitting kinetic curves of different concentrations
表 1 动力学数据结果
Table 1 Ｒesults of kinetics data
方程值
Values
浓度 Concentration
5 μg /mL 10 μg /mL 15 μg /mL 20 μg /mL 25 μg /mL
样品
Sample
芦丁
Ｒutin Vc
样品
Sample
芦丁
Ｒutin Vc
样品
Sample
芦丁
Ｒutin Vc
样品
Sample
芦丁
Ｒutin Vc
样品
Sample
芦丁
Ｒutin Vc
Best-fit values Y0 0． 4984 0． 5002 0． 5009 0． 5005 0． 4994 0． 5009 0． 5009 0． 5008 0． 5009 0． 5009 0． 5008 0． 5009 0． 5009 0． 5007 0． 5009
Best-fit values NS 0． 2887 0． 3128 0． 3407 0． 0925 0． 1237 0． 1798 0． 0930 0． 1038 0． 1142 0． 0802 0． 0994 0． 1006 0． 0657 0． 0894 0． 1116
Best-fit values k 0． 2560 0． 2946 0． 8673 0． 4167 0． 3317 0． 9838 0． 5755 0． 5549 0． 6724 0． 7799 0． 5151 0． 7152 0． 6308 0． 4588 0． 5892
Std． Error Y0 0． 013680． 006370． 001190． 011520． 018030． 000710． 006650． 006140． 004130． 001550． 008650． 004230． 003790． 00787 0． 00463
Std． Error NS 0． 004460． 002040． 000360． 003570． 005690． 000210． 002030． 001870． 001250． 000470． 002650． 001280． 001150． 00242 0． 00141
Std． Error k 0． 04543 0． 0295 0． 1189 0． 0470 0． 0511 0． 0629 0． 0606 0． 0518 0． 0645 0． 0380 0． 0591 0． 0791 0． 0427 0． 0395 0． 0474
Ｒ2 0． 9563 0． 9877 0． 9994 0． 9914 0． 9756 0． 9999 0． 9971 0． 9974 0． 9988 0． 9999 0． 995 0． 9988 0． 9992 0． 9960 0． 9985
K K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0K ＞ 0． 0
8161 天然产物研究与开发 Vol. 27
表 2 动力学曲线方程
Table 2 Kinetic curve equation
样品浓度
Sample concentration
公式
Equation Ｒ
2
5 μg /mL Y = 0． 2097* exp(-0． 2560* X)+ 0． 2887 0． 9563
10 μg /mL Y = 0． 4084* exp(-0． 4167* X)+ 0． 0925 0． 9914
15 μg /mL Y = 0． 4079* exp(-0． 5755* X)+ 0． 0930 0． 9971
20 μg /mL Y = 0． 4207* exp(-0． 7799* X)+ 0． 0802 0． 9999
25 μg /mL Y = 0． 4352* exp(-0． 6308* X)+ 0． 0657 0． 9992
从图 3 可以看出，不加样品的 DPPH 自由基随
时间的延长其吸光度没有变化，说明 DDPH 是一种
稳定的自由基，而加入不同浓度叉枝鸦葱总黄酮的
DPPH自由基的吸光度随时间的延长而逐渐降低。
在反应前 5 min 吸光度下降很快，5 min 后，吸光度
下降缓慢，在 30 ～ 45min内反应达到基本平衡，该体
系的吸光度不再下降。但当叉枝鸦葱总黄酮浓度越
高时，反应达到平衡的时间越短，对照芦丁、VC 亦表
现出同样的反应规律。
100
80
60
40
20
0
0 10% 20% 30
浓度
Concentration(μg/mL)
清
除
率
Sc
av
en
gi
ng
%ra
te
(%
)
样品 Sample
芦丁 Rutin
Vc
图 4 叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH自由基清除率
Fig. 4 Scavenging rate of flavonoids from S． divaricata on
DPPH free radical
3． 5 对 DPPH自由基清除率
由图 4 可以看出，叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH 自
由基有明显的清除作用，在 5 ～ 25 μg /mL 的浓度范
围内，叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH 自由基的能力为
41． 72% ～ 87． 72%。随着浓度的增加，其对 DPPH
自由基的清除能力增强，对 DPPH 自由基的清除具
量效关系。同芦丁、VC 相比，叉枝鸦葱总黄酮对
DPPH自由基的清除率明显偏高于芦丁和 VC。
3． 6 清除 DPPH自由基的 IC50值
经计算，叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH 的 IC50值
为 5． 6 μg /mL，大于芦丁 IC50 6． 2 μg /mL 和 Vc 的
IC50 7． 3 μg /mL。说明叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH
自由基的效果好于二者。
4 讨论
叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH自由基的反应动力
学研究，根据公式:Y =(Y0-NS)* exp(-K* X)+
NS，进行求导，其中一阶导数 Y = -(Y0-NS)* K*
exp-kx ＜ 0(恒小于零)说明:吸光度随着时间的增加
而减少，而当时间趋于无穷大时，吸光度无限趋近于
NS值。对其进行二阶求导，其导数为:Y″ = (Y0-
NS)* K2* exp-KX ＞ 0(恒大于零) ，说明:吸光度随时
间的增加的变化率减小，而当时间趋于无穷大时吸
光度随时间的变化率趋于不变，接近于零值。
根据 5、10、15、20、25 μg /mL 拟合曲线图分析
可知，随着样品浓度的增加，NS值逐渐减小，说明样
品浓度对 DPPH的抗氧化性不断增强。
从动力学数据可以看出，当样品浓度在 5、10、
15、20、25 μg /mL时，所得五个具体曲线方程中 Y0
值与实际反应值，随着浓度的增加，差值从 0． 0025
变成零，说明该五组方程表达式均能很好的表达各
个浓度样品的实际反应过程。一个模型五组方程不
但本身线性相关性很强，回归效果好，由于动力学模
型方程经参数估值后所得的模拟计算值与实验值吻
合较好，可以作为优化工艺条件的控制依据。
叉枝鸦葱总黄酮对 DPPH自由基有明显的清除
作用，清除 DPPH自由基的能力随着浓度的增加而
增加，并对 DPPH 自由基的清除率具有量效关系。
叉枝鸦葱总黄酮清除 DPPH 自由基的 IC50值为 5． 6
μg /mL，是一种有效的自由基清除剂。
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