全 文 ：. 研究简报 ·
山东白花烟 〔 N ie o t ia n a t a b a cu m (m ut a n t )〕
叶肉原生质体培养及植株再生
关永全 李宝健
(生物学系 )
从烟草属的几个种中已成功地用原生质体培养成株 〔`〕 , 但是对于一些有 价 值的遗
传标记的突变体的原生质体培养至今还很少见有报道 。 本文主要研究了以我国选育的普
通烟草 ( N . t a乙。 ` u m ) 的白花突变体叶肉原生质体培养的条件和方法 .
材 料 和 方 法
实验材料 : 山东白花烟 〔N . t动 ac u m ( m ut a ut )〕 , 是山东烟草研究所近 年 来通过
组织培养的方法选育出来的普通烟草 ( N . t动 cu m ) 的白花突变体 , 经山 东烟草 研究所
和广东省农科院经济作物组多次继代培养试验证明其白花突变件状是稳定的 .
叶 肉原生质体 的分离: 用于分离原生质体的植株材料取自生长在漫散自然光下的实
生苗 , 苗龄为90 一 120 天 , 取样前半个月的温度在 25 ℃一 28 ℃ , 相对湿度在 70 肠一 80 肠 。
实验前两天将植株移至暗处并停止灌水 、 供用 。 分离原生质体的培养基列于表 1 . 酶液
经过滤除菌 。 撕去下表皮的叶片放入无菌酶液中 , 在黑暗27 ℃一 28 ℃下保温 2 小时 。 收
取巳解离的原生质体悬浮液的滤液 , 低速离心收集原生质体。
原生质体的培养: 已收集的叶肉原生质体用不含激素的原生质体培养基 ( 见表 1 )
洗涤2一 3次 , 最后悬浮在加有激素的培养基中 。 原生质体密度在 2 . 。一 2 . 5 x 1 0叮毫升 ,
培养温度28 ℃ , 光照为60 0 L u x 连续光照 。
原生质体细胞群落的转移培养: 当悬滴中的叶肉原生质体经过几次细胞分裂形成由
几个至十几个细胞组成的细胞团后 , 可进行转移培养 , 所用的培养液是完全省去甘露醇
而含 2 肠蔗塘的原生质体培养基 , 重新制成悬滴后培养在 26 ℃一 28 ℃恒温室 的 漫 散光
下。
原生质体愈伤组织 的分化 : 转移培养 7 一 10 天后 , 细胞团已长童肉眼可见的小愈伤
组织 。 这时把小愈伤组织挑出 , 再转移至愈伤组织培养基中继续培养 . 愈伤组织培养基
是用 0 . 6一 0 . 8肠琼脂固化的原生质体培养基 , 其中完全省去甘露醇 , 但含3肠蔗糖 , 2 , 4
一D增至 2 0 9 1/ , 不加细胞动素 , 追加水解乳旦白 1 9 / 1 , p H 6 . 0 。
待愈伤组织长大至 5一 10 毫米时 , 将它们转至含有 3m g l/ 6 一 B A 的 M S 培 养 基
( M
u r a s h g
e a n
d s k
o o g , 2 9 6 2 ) 上诱导出芽 , 2一 3 周后将无根小苗移进无生长素的
W ih et 培养基 ( w ih et , 1 9 6 3 ) 上诱导长根 , 长根后将再生幼苗移栽落盘 , 每天浇水直
至长成大的完整植株 。
第二期 山东白花烟叶肉原生质体培养及植株再生
表 1 分离及培养原生质体培养墓
酶 液 0
·
7一 0 . 8 %纤维素酶
( EA
3一 7 5 6 )i )
0
.
3 %葡聚糖硫酸钾
2 0 0 5
0 0 6
3 70
1 70
12 5
同 Bs Z )
同 B、
,上OCū1.八UJ任性月厅」司上1q`0山
培养基成份 ( m g /升 ) :
K N O 3
C a C 12
·
ZH : O
M g S O 一 7 H ZO
K H : P O 。
N H 一N O 3
微量元素
维生素
2
。
4一 D
K T
蔗糖
甘露醇
同B ,
0
。
6M
0
。
1
10 0 0 0
p H
j
6
·
2
}
6
·
4
“ ·
I
。 · 6 M
l) 上海植物生理研究所产
2 ) G a m b o r g ( 1 9 6 5 )
, 鳌合铁含量减半
给 果
培养在悬滴中的原生质体在培养 2 4小时后体积稍有增大 , 叶绿体仍均匀地分布在细
胞质中 , 整个细胞的立体感比较强 。 到了第 3天 , 原生质体的形状开始变成椭圆形 , 明
显地看到叶绿体的重新排布 . 以及细胞质逐渐变浓。 到了第 4天 , 在一些体积变长了的
原生质体中可见到部份叶绿体成一线形地排布在细 胞中央部份 , 其余的叶绿体仍均匀地
分布在细胞质中 , 这是即将分裂的先兆 . 洗去酶后的第 5 天 , 明显可见的细胞分裂发生
了 , 在大多数情况下 , 分裂的结果产生了两个大小相等的半球型的子细胞 , 这些子细胞
通常不分开 ( 图 1 ) 。 一周之后 , 大 约 有 40 一 60 % 的 原 生质体已进行 了 一次 细 胞分
裂 , 少数的原生质体已经分裂两次 , 产生出 4 个子细胞的小细胞团 ( 图 2 ) 。 但是与开
始培养时相比 , 叶绿体的数目减少了 , 此时一些没有分裂的原生质体逐渐解体死亡 。
在正常情况下 , 原生质体一旦分裂 , 分裂就能继续下去 , 半个月后便产生出 10 多个
细胞组成的细胞团 ( 图 3 ) , 这时可见到一片晶亮的微小颗粒 。 悬滴的外观 已经从原来
的绿色变成半透明的白色或淡黄色。 由于细胞团太小 , 在固体培养基中容易 变 黑 、 坏
死 。 因此 , 我们先把这些小细胞团转移至完全省去甘露醇而含 2肠蔗搪的液 体 培 养基
中 , 再作悬滴培养 。 这时小细胞团迅速长大 , 往往在 10 天左右便发育成肉眼可见的小愈
伤组织 。 把小愈伤组织从悬滴中取出 , 转至固体培养基中去 , 很快便长成较大的愈伤组
织 。 转移培养的成功率较高 , 极少出现变黑坏死的现象。
对分化培养荃 , 曾试验过几种激素组合 : ① 6一 B A ( ZP p m ) ② 6一 B人 ( Z p p m ) +
中 山 大 学 学 报 18 9` 年
N A A ( 0
.
2p p m )③ 6一B A ( 3p p m )④ 6一 B A ( p p Zm )+ I A A ( 0 . p p 2m )。 在这几种培
养基中愈伤组织大多数都能转绿和出芽 , 分化率 约 为 70 一 80 肠 , 其中以 单 用 6一B A
( 3 p p m )的效果较好 。 在附加有 I A A (。 . 2 p p m )的组合中 , 在分化出芽的同时还常伴有少
量根的产由 ( 图 4 ) 。
1
. 正在分裂的原生质体 (培养第五天 ) ,
2
。 经过两次分裂形成由四个细胞组成的细胞团 ,
3
. 细胞团的发育 ,
.4 愈伤组织被诱导出苗 .
已经长出的小苗在转移到不含任何激素的W ih et 培养基后 , 便长出根来 。 长根的时
间快则 3 一 4 天 , 慢则 7 一 8 天 , 很少超过 10 天 。 根长出来后 , 小苗营养充足 , 生长也
较快 。 成株的苗经假植后移入盆栽并长成大的再生植株。
讨 论
叶肉原生质体来源于高等植物的叶肉细胞 , 因此植物材料的生理状态将影响原生质
体的稳定性 , 并进一步影响培养的结果 . S h a p ar d在培养马铃薯叶肉原生质体中发现用
漫散光的短光周期处理植株对于获得稳定高产的有生命力的原生质体特别有利因 . 在我
们的实验中也发现植株生长在漫散自然光照下 , 取样前半个月的温度在25 ℃一 28 ℃ 、 相
对湿 度 在70 一 80 肠的 条 件下 , 对于以后的培养结果影响很大 。 生长在较低温度 ( 17 ℃
以下 )和较高相对湿度 ( 90 肠以上 ) 的植株往往分离出带有大量破碎细胞的不健康的原
生质体 , 通常不能分裂 。 为了提高分离的原生质体的质量 , 可以在分离前进行一些预处
理 。 E v a sn 等人在分离甘蔗原生质体前进行了 12 一 24 小时减低湿度的黑暗处理 , 效果良
好` . 〕 .在我们的实验中也进行了分离前限制灌水及黑暗预处理 , 效果亦较好。 我们还发
现如果在取样的当天灌水 , 原生质体很难分离 , 即使分离出来 , 破碎的也较多。 这说明
细胞的膨胀度是影响分离原生质体质量的一个因素 。
培养基中矿质元素的种类和用最对于维持原生质体正常的生理活性有较大的关系 .
在初期的培养试脸中 , 我们采用 B 。培养基矿质元素的配方 , 结果并不理想 。 后来分别提
高了 C a + 令和 M g 幸 + 的含最并适当降低了铁盐的含量 (表 l ) ,取得了比较理想的结果 . 已知
C a “ 对原生质体能起稳定作用并提高再生和分裂频率川 . iB n d i n g在培养矮牵牛单倍体
原生质体时开始用培养二倍体矮牵牛的培养基闰 ,结果失败了 ,只有在提高 C a “ 和M g “
第二期 山东白花烟叶肉原生质体培养及植株再生
的含量时才得到细胞团 .至于铁盐的含量 ,过高时亦会影响原生质体的稳定性 . H ay w ar d
在矮牵牛原生质体培养中 , 适当降低了铁盐的含量 , 结果提高了存活率川 。 我 们 在本
试验中所采用的铁盐含量是原 B。培养基的一半量 , 看来铁盐的用量还可继续降低 。
悬滴培养是一种比较理想的培养技术。 P ot r y k us 认为这种技术能解决大 量 组合研
究的难题 (劝 . 虽然有些研究者采用这种培养方法未能成功川 , 这可能与所 用 材 料有
关 。 不久前 , 黄瑞心等用烟草为材料 , 首次在我国成功地应用这一培养技术川 。 我们
的结果再次表明 , 这一技术是可行的 . 同时还发现它具有节省材料 、 容易观察 、 气体交
换好等优点 , 并有可能为离体花粉培养 、 胚珠培养及细胞杂交等研究提供比较理想的培
养方法 。
参 考 文 献
〔 1〕 B a n k s , M . S . a n d E v a n s , P . K . , P l a o t S e i . L e t t . , 9 ( 1 97 6 ) , 4 09一 41 6 。
〔 2〕 S h a p a r d , J . F . a n d T o t t e n , R . E . , P l a n t P h y s i o l . , 60 ( 19 77 ) , 3 13一 3 1 6 .
〔3〕 D . A . E v a n s , O . L . G r o e o m e , M . T . V . D e C a r v a l n o , 2 . P f l a ” z e o P h夕 5 10 1. ,
9 8 ( 19 8 0 )
,
33 5一3 5 9 .
〔 4〕 P l e h e r , L . E . , G a m b o r g , O . L . a n d K a o , K . N . , P l a n t S e ` . L e t t . , 3 ( 1 9 7 4 ) ,
1 0 7一 1 11 。
( 5〕 B i n d i n g , H . , P l a n t S e i . L e t t . , 2 ( 1 97 4 ) , 1 8 5一 1 88 .
〔6〕 H a y w a r d , C . a n d P o w e r , J . B . , P l a n t S c i . L e t t . , 4 (1 97 5 ) , 40 7一 4 10
〔7〕 P o t r y k u s , 1. , P l a n t T i s s u e C u l t u r e a n d i t s B i o t e e h n o l o g i e a l A p p l i e a t i o n
( B a r x
.
w
.
r t a l
.
, e l s
.
)
,
1 97 7
,
p 32 3一 333 .
〔 8〕 孙勇如等, 遗传学报 , 6 ( 1 97 9 ) , 4 , 4 2 7一 4 33 ·
〔9〕 黄瑞心等 , 实验生物学报 , 1 4 ( 1 9 81 ) , 1 , 1 5 ·