全 文 ：硅胶干燥野扁桃叶片制备 DNA样品
及其 SSR反应体系的建立
曾　斌 1a ,罗淑萍 1b ,李　疆 1a ,程运江 2 ,廖　康 1a
( 1. 新疆农业大学 a. 林学园艺学院 ; b. 农学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;
2. 华中农业大学 作物遗传改良国家重点实验室 ,湖北 武汉 , 430070)
摘　要: 对硅胶干燥保存制备新疆野扁桃 DN A样品和 SSR反应体系优化进行了研究。结果表明:在室温下
贮存 3个月、 6个月、 9个月、 1年和 2年的硅胶干燥的同一野扁桃叶片材料中采用改进的 CT AB法提取了高质
量的基因组总 DNA,较好的克服了野扁桃叶片中含有较高的多糖、多酚、色素以及单宁等次生物质的影响。
通 过 A260 /A280、琼脂糖凝胶电泳和 PCR- SSR扩增结果分析对提取的基因组 DN A进行了鉴定 , 2年内不同
保存时期的同一材料对于 DN A提取没有明显差异 ,提取的 DNA用于 SSR扩增所得的扩增产物也均无明显
差异 ;确立野扁桃最佳的 PCR- SSR反应体系是 30～ 50 ng DNA模板 , 0. 5 U TaqDNA聚合酶 , 2. 0 mmol·
L- 1Mg Cl2, 0. 2 mmol· L- 1dNT Ps , 0. 2 mmol· L- 1的引物 , 10× Taq酶配套缓冲液 ( pH 8. 0) ,反应终体积 20
μL,引物最佳退火温度为 54～ 57℃。利用 40个野扁桃随机叶样验证此反应体系 ,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测结果显示 ,扩增产物在 200～ 600 bp,多态性高 ,且反应体系的稳定性和可重复性好。
关键词: 新疆野扁桃 ;硅胶保存 ;基因组 DN A; SSR反应体系
中图分类号: S662. 9　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1003- 8981( 2009) 01- 0001- 06
Preparation of DNA from Silica-Gel-Dried Leaves of Amygdalus
Ledebouriana Schlecht. and Construction of Reaction System for SSR
ZENG Bin1a , LUO Shu-ping1b , LI Jiang1a , CHENG Yun- jiang2 , LIAO Kang1a
( 1a. Ho rticultura l Collage; b. Ag ronomy Collage , Xinjiang Ag ricultural Univ ersity,
U rumqi 830052, Xin Jiang , China; 2. National Key Labo ra to r y o f Crop Gene tic Improvement,
Hua zhong Ag ricultur al Univ er sity , Wuhan 430070, Hubei, China)
Abstract: Improved C TAB method w ere employed to ex t ract g enomic DNA f rom the leaves o f
Amygdalus Ledebouriana Schlech t. sav ed in silica-gel fo r three month s, six months, nine
months, one year and tw o yea rs. The results show ed tha t the ex tracted DN A w as tested using
the value of A260 / A280 , ag ar ose gel elect ropho resis and PCR-SSR amplification. The DN A from
the leaves saved in silica fo r tw o yea rs is g ood fo r PCR-SSR amplification and has no significant
difference. The optimal PC R-SSR reac tion sy stem fo r Amygdalus Ledebouriana Schlecht. w as
built, PCR-SSR w as run in a reaction vo lume of 20 uL containing 30～ 50 ng template DNA,
0. 5 unit o f Taq DN A polyme rase, 2. 0 mmo l· L- 1 MgCl2 , 0. 2 mmol· L- 1 dN TPs, 0. 2 m mol·
L- 1 prim er, 10 mmo l· L- 1 T ris-HCl, the optimal annealing tem perature o f primer s o f 54～
57℃ . 40 leave samples of Amygdalus Ledebouriana Schlecht. we re used to retest the above
SSR system , SSR fr agments betw een 200～ 600 bp we re de tect ed by polyacr ylamide gel ( 8% ) ,
indica ting tha t the SSR reaction sy stem was steady and reproducible.
经济林研究　 2009, 27( 1): 1-6
Nonwood　 Forest　 Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期: 2008-08-25
基金项目: 国家自然科学基金项目“新疆野扁桃种质资源综合评价的研究” ( 30760205) ;新疆维吾尔自治区教育厅高校科研计划重点项
目“新疆野巴旦杏种质资源的研究 ” ( X JEDU2006I26 ) ;高校博士点专项科研基金项目 “新疆野生果树种质资源研究 ”
( 20070758001)。
作者简介: 曾　斌 ( 1970- )男 ,湖北松滋人。 副教授 ,博士 ,主要从事果树种质资源及园艺作物生物技术方面的研究。
通讯作者: 李　疆 ( 1958- )男 ,湖南邵东人。 教授 ,博导 ,主要从事果树栽培生理及种质资源方面的研究。 E-mai l: li jiangx j@ 163. com。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2009. 01. 003
Key words: Amygdalus Ledebouriana Schlech t. ; preserv ation in silica; genomic DN A; SSR
reac tion system
野扁桃 Amygdalus Ledebouriana Schlecht.为蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物 ,是一种十分珍贵且古老的
野生果树种 ,属新生代第三纪孑遗物种 ,在当今世界上已十分稀少 ,被誉为“活化石”。目前主要分布于新疆北部
的巴尔鲁克山及阿尔泰山等地 [ 1]。
在植物提取 DNA的研究中通常采用新鲜或冷冻的材料。但对于野外 ,特别是远距离采样时 ,由于受条件的
限制 ,携带液氮或冰壶非常不方便。有研究表明 ,用硅胶干燥保存的野外标本的叶材料可用于基因组 DNA的提
取 [2, 3 ]。从扁桃的新鲜材料中提取基因组 DNA曾有过研究 [ 4, 5] ,但对于扁桃属植物的野扁桃种 ,特别是从硅胶干
燥的叶片中提取 DNA,尚未见报道。
SSR多态性标记因同时具有多态性百分率高、重复性好且呈共显性等特点 ,是一种较为理想的分子标记
技术 ,在果树种质资源遗传多样性和基因分子标记等遗传育种领域中应用较广泛 [6, 7 ]。筛选 SSR引物及建立稳
定的反应体系是 SSR多态性标记应用的基础。该标记在作物种质资源遗传多样性和基因分子标记等遗传育种
领域中已广泛应用 ,但国外内还未曾见在野扁桃上的应用研究。因此 ,本试验尝试用硅胶干燥野扁桃叶片提取
DNA,并对野扁桃 SSR反应体系进行优化 ,以期建立其最佳的反应体系 ,为进一步进行新疆野扁桃不同群体遗
传多样性 SSR分子标记的鉴定研究奠定基础。
1　材料及方法
1. 1　材　料
1. 1. 1　制备 DNA样品材料
分别用硅胶干燥保存 3个月、 6个月、 9个月、 1年和 2年的野扁桃幼叶做样品备用。具体操作如下: 采集 5～
10 g新鲜材料置于一带拉锁的小塑料袋中 ,再加入 50～ 100 g变色硅胶 ,摇动使叶片与硅胶充分、均匀地接触 ,
一般来说 ,硅胶与叶片的质量比至少 10∶ 1,以保证叶片在 12 h内干燥。一旦发现硅胶从深蓝色变成粉红色要
及时更换 ,干燥的材料带回实验室 ,室温下保存即可。
1. 1. 2　建立 DNA样品反应体系的材料
CT AB等分析纯试剂为国产品 , M gCl2、 dN TPs、 TaqDN A聚合酶、 DNAmarker ( 100～ 1 500 bp)均购自
MBI( Fermentas)科技有限公司 , SSR引物由上海生工生物公司合成。
1. 2　方　法
1. 2. 1　仪　器
高速冷冻低温离心机 ( eppendorf , Centrifug e 5804R, Germany )、电泳仪 ( EPC3000)恒温摇床 ( HQ45A,武
汉科仪 )、 PCR仪 ( BIO-RAD, PTC-200型 )紫外分光光度计 ( lamada , Bio-10型 )、紫外透射反射仪 ( WFH-201)、
DYY-Ⅲ电泳槽 (北京六一科仪 )及紫外凝胶成像及分析系统 ( UV P-BIO-RAD)。
1. 2. 2　制备 DNA样品
称取不同保存期的硅胶干燥的叶片各 0. 05～ 0. 1 g ,放入研钵中 ,加入液氮迅速研磨成粉状 ,采取以下改良
CT AB法提取总 DNA[ 8～ 10]。将研磨的叶样干粉迅速转入预冷的 1. 5mL离心管中 ,加入 600μL预热的 CTAB提
取液 ( 2% CTAB, 1. 4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH8. 0, 0. 4%U-mercapto ethanol (巯基乙醇 ,
用前加入 ) ,快速混匀 ,再加入 15 mg PV P( Poly Viny I Pyr rilodone) ,混匀 ,置于恒温摇床 65℃温浴 60～ 90 min,
加等体积的氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1) , 13 000 r /min, 4℃离心 10 min,取上清液转入一新的 1. 5 mL离心管中 ,重复
上面的氯仿 -异戊醇步骤 ,然后 ,取上清液转入另一新的 1. 5 mL离心管中 ,加入 3μL RNAseA ( 10 mg /mL) ,室
温摇动 30 min;加入1 /2体积的 5 M NaCl混匀 ,加入 2倍体积预冷的无水乙醇 ( - 20℃ ) ,轻轻混匀 ,冰浴至少 30
min,沉淀 DNA,将离心管倒扣于滤纸 ,室温风干沉淀 1 h; 70%的乙醇洗涤 DNA沉淀 2次 ,风干后溶于 30μL TE
溶液中 , 4℃保存备用。
1. 2. 3　 PCR-SSR反应体系条件的优化
SSR初始反应体系参照相关类果树的 PCR-SSR的反应体系 [11～ 14 ] ,野扁桃 PCR-SSR初始 20μL反应体系
包含: 10× Taq酶配套缓冲液 , 1. 5 mmo l· L- 1MgCl2 , 0. 2 mmo l· L- 1dN TPs,正反引物各 0. 1 mmol· L- 1 , 0. 5
2 经　　济　　林　　研　　究 第 27卷　
U TaqDN A聚合酶 , DN A模板 30 ng ,相应的扩增程序为: 94℃预变性 , 4 min,然后 94℃变性 60 s, 55℃复性 40
s, 72℃延伸 60 s,共 34个循环后 , 72℃延伸 8 min补齐。
由于 SSR技术是基于 PCR的一种标记 ,其反应条件易受各种因素的干扰 ,如模板 DNA、 TaqDN A聚合酶、
dN TPs以及 Mg2+ 的浓度等都能影响 SSR扩增的结果。 若许多因子的条件不适合则导致图谱弥散状背景的产
生、扩增产物的消失以及电泳谱带位置的改变。这些现象都影响 SSR的扩增结果 ,从而影响整个试验结果。为
确保试验的准确性和可重复性 ,在初始试验的条件上获得稳定的 SSR标记 ,必须对 SSR反应条件逐一进行筛
选 ,建立优化反应体系。
PCR-SSR扩增反应体系的优化采用单因素试验设计 ,进行 PCR扩增的模板 DNA、 Mg2+ 、 dN T Ps、引物、
Taq酶的用量等 5因素 6水平的梯度试验 ,如表 1所示。在调整反应体系时 ,除 1种成分因素变动外 ,其他反应
因子浓度不变。
表 1　野扁桃 SSR-PCR体系优化的因素与水平
Table 1　 Factors and levels in optimization of SSR-PCR reaction system of Amygdalus Ledebouriana Schlecht.
水平
Lev el
Mg2+ 浓度
Concent ration of M g2+
/( mmol· L- 1 )
dNT Ps浓度
Concen t ration of dN TPs
/ ( mmol· L- 1 )
Taq酶用量
Dosage of Taq polymerase
/U
模板 DNA用量
Dosag e of template DN A
/ng
引物用量
Dosag e of primer
/( mmol· L- 1 )
1 0. 5 0. 025 0. 1 10 0. 05
2 1. 0 0. 05 0. 2 20 0. 1
3 1. 5 0. 1 0. 3 30 0. 2
4 2. 0 0. 2 0. 4 40 0. 3
5 2. 5 0. 3 0. 5 50 0. 4
6 3. 0 0. 4 1. 0 60 0. 5
　　同一引物对于不同的物种 ,退火温度可能不同 ,较低的退火温度保证引物与模板结合的稳定性 ,但也会使
引物与模板产生错配 ,产生非特异性条带 ,退火温度过高 ,则会抑制引物和模板的结合 ,只有在 Tm允许的范围
内为了提高 PCR反应的特异性 ,为减少非特异性扩增 ,可在允许范围内适当调整引物的退火温度 ,可以提高
PCR反应的特异性 [ 12]。
退火温度设有 50℃、 51℃、 52℃、 53℃、 54℃、 55℃ 56℃、 57℃、 58℃、 59℃和60℃ 11个处理 (注:在调整
反应体系时 ,除比较因素变动外 ,其他反应因子相同 ) ,并利用 PCR仪的梯度功能 ,对引物进行梯度扩增 ,寻找
最适退火温度。
2　结果与分析
2. 1　野扁桃 DNA样品的纯度和分析
图 1　部分野扁桃植物总 DNA 1%琼脂糖凝胶电泳情况
Fig. 1　 Total DNA of some samples of Amygdalus Ledebouriana
Schlecht. on 1% agarose gel electrophoresis
　　改良的 CTAB方法提取不同保存期所
得的 DNA溶液的 A260 /A280均在 1. 6～ 1. 9
之间 ,而且 OD260 /OD230> 2,说明所得 DNA
样品中基本无蛋白质污染 ;通过琼脂糖凝
胶电泳分析 (见图 1) ,并进一步通过 PCR-
SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 (使用 3对
不同的 SSR引物 )结果可知 ,不同保存时
间同一材料所提取的 DNA电泳图谱并没
有明显的差异 ;同一个体不同保存时期的
干叶样提取的 DNA模板 ,可获得同等效果的 PCR-SSR扩增 ,且扩增产物较为一致 (见图 2) ,进一步表明了硅胶
干燥保存的野扁桃植物叶片在 2年内并无明显变化 ,均可用于 DNA提取及后续的 PCR-SSR分析研究。用硅胶
对材料叶片迅速干燥保存 ,用于提取 DNA的方法 ,为野外取材进行分子水平的研究提供了新的思路。
3第 1期 曾　斌等:硅胶干燥野扁桃叶片制备 DN A样品及其 SSR反应体系的建立
1～ 5为 A号 SSR引物扩增的保存 3个月、 6个月、 9个月、 1年、 2年
的同一野扁桃干叶样材料 DN A的指纹图谱 ; 6～ 10为 B号 SSR引
物扩增的保存 3个月、 6个月、 9个月、 1年、 2年的同一野扁桃干叶
样 DN A的指纹图谱 ; 11～ 15为 C号 SSR引物扩增的保存 3个月、 6
个月、 9个月、 1年、 2年的同一野扁桃干叶样 DN A的指纹图谱。
Lane l～ 5: S SR fingerp rint of Amygdalus Ledebouriana Schlech t.
prod uced by primer A for saving th ree month s, six months , nine
month s, one year and tw o years; Lane 6～ 10: SSR fingerprint of
Amygdalus Ledebour iana Sch lecht. produced by primer B fo r
s aving th ree mon ths , six months , nin e months , one year and tw o
years; Lane 11～ 15: SSR f ingerprin t of Amygdalus Ledebour iana
Schlecht. p roduced by primer C fo r saving th ree month s, six
month s, nine m on th s, one year and tw o years.
图 2　不同保存时期同一野扁桃材料的 DN A的 PC R-SSR
扩增产物电泳图
Fig. 2　 Agarose gel electrophoresis of PCR-SSR products
for saving in dif ferent per iods of Amygdalus
Ledebouriana Schlecht. DNA
2. 2　野扁桃 SSR技术体系的建立
2. 2. 1　 Mg2+浓度对 SSR反应的影响
图 3中 6个泳道显示了不同 Mg2+ 浓度的扩增结
果。结果表明 , 6个浓度均有扩增产物。当 Mg2+ 浓度
分别为 2. 0 mmol· L- 1和 2. 5 mmol· L- 1时表现良好
的扩增效果 ,浓度分别为 0. 5 mmo l· L- 1和 1. 0
mmol· L- 1时由于 Mg2+影响 TaqDN A聚合酶活力显
著降低 ,导致无扩增谱带或扩增谱带缺失。 结合其它
引物扩增结果并从经济上考虑 ,确定 Mg2+浓度为 2. 0
mmol· L- 1为适宜浓度。
2. 2. 2　 dN TPs浓度对 SSR反应的影响
图 4中 6个泳道显示了不同 dN TPs浓度的 PCR
扩增产物情况 ,结果表明均有扩增产物 ,但 dN TPs浓
度较低为 0. 025 mmol· L- 1及 0. 05 mmol· L- 1时 ,扩
增条带少而不清晰 ,浓度为 0. 2 mmol· L- 1和 0. 3
mmol· L- 1时均扩增出清晰、稳定及整齐的条带 ,综
合所有引物的情况 ,尤以 0. 2 mmol· L- 1时扩增条带
最佳。故 dN TPs的浓度确定为 0. 2 mmol· L- 1为宜。
2. 2. 3　 TaqDN A聚合酶浓度对 SSR反应的影响
图 5中 6个泳道显示了不同 Taq DN A聚合酶的
浓度的 PCR扩增产物情况。结果表明: 0. 1 U时无扩
增产物 ,其他 5个浓度均有扩增产物。但在 0. 2 U、
0. 3 U、 0. 4 U及 1. 0 U时条带模糊不清 ,酶量为 0. 5
U时谱带较亮且清晰 ,扩增效果最好 ,故确定 Taq
DN A聚合酶适宜用量为 0. 5 U。
6个泳道显示 Mg2+浓度分别为 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0
mmol· L- 1; M. 100 bp- 1. 5 kb标准分子量
Lan e l-6. Mg Cl2 concen tration 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0
mmol· L- 1; M. 100 bp- 1. 5 kb DNA M ark er
图 3　 Mg2+浓度对 SSR反应的影响
Fig. 3　 Effects of MgCl2 concentrat ion on SSR reaction
6个泳道显示 dN TPs浓度分别为 0. 025, 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 3,
0. 4 mmol· L- 1; M . 100 bp- 1. 5 k b标准分子量
Lane 1- 6. dN T Ps concen t ration 0. 025, 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0.
3, 0. 4 mmol· L- 1; M . 100 bp- 1. 5 k b DN A Marker
图 4　 dNTPs浓度对 SSR反应的影响
Fig. 4　 Effects of dN TPs concentration on SSR reaction
2. 2. 4　引物浓度对 SSR反应的影响
图 6中 6个泳道显示了不同引物浓度的扩增产物情况。 结果表明: 0. 3、 0. 4和 0. 5 mmol· L- 1的引物浓度均
无扩增条带 ,引物浓度为 0. 2 mmol· L- 1时扩增效果最好 ,谱带清楚 ,故选择 0. 2 mmo l· L- 1为引物优化浓度。
4 经　　济　　林　　研　　究 第 27卷　
6个泳道显示 Taq DNA聚合酶的浓度分别为 0. 1, 0. 2, 0. 3,
0. 4, 0. 5, 1. 0 U; M . 100 bp- 1. 5 kb标准分子量
Lan e 1-6. Taq polymeras e amount concen t ration 0. 1, 0. 2,
0. 3, 0. 4, 0. 5, 1. 0 U; M . 100 bp- 1. 5 kb DNA Marker
图 5　 TaqDN A聚合酶浓度对 SSR反应的影响
Fig. 5　 Ef fects of Taq polymerase amount concentration
on SSR reaction
6个泳道显示引物浓度分别为 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5
mmol· L- 1; M . 100 bp- 1. 5 kb标准分子量
Lane 1-6. Prim er concen t ration 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4,
0. 5 mmol· L- 1; M . 100 bp- 1. 5 k b DN A Marker
图 6　引物浓度对 SSR反应的影响
Fig. 6　 Ef fects of primer concentration on SSR
reaction
6个泳道显示模板 DNA的用量分别为 10, 20, 30, 40, 50, 60 ng; M .
100 bp- 1. 5 k b标准分子量
Lane l-6. Template DN A amount 10, 20, 30, 40, 50, 60 ng;
M . 100 bp- 1. 5 kb DN A Marker
图 7　模板 DN A用量对 SSR反应的影响
Fig. 7　 Ef fects of template DNA amount on SSR reaction
2. 2. 5　模板 DNA对 SSR反应的影响
图 7中 6个泳道显示了不同模板 DNA用量的扩
增结果。结果表明:模板 DNA在设定的用量范围内 ,
30～ 60 ng谱带基本保持稳定且带型清晰。但随量的
增大易产生非特异性带 ,故本研究结果表明加入模板
DNA以 30～ 50 ng为宜。
2. 2. 6　 PCR反应过程中退火温度对扩增结果的影响
退火温度对扩增结果影响较大 ,如图 8所示 , 11
个泳道显示了野扁桃中 ( SSR引物 BPPCT032扩增结
果 )进行不同退火温度 PCR扩增结果 ,退火温度 54～
57℃时扩增效果稳定 ,在较低及太高的退火温度下 ,
扩增谱带均较弱 ,不同引物应适当调整其退火温度 ,
才能达到最佳效果。
2. 2. 7　 PCR-SSR优化体系的应用
11个泳道显示了第 5对引物的 11个退火温度处理: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,
60℃ ; M . 100 bp- 1. 5 k b标准分子量 ,所用引物为 BPPCT032
Lane 1- 11. Primer 5: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60℃ ; M . 100 bp- 1. 5 kb
DN A Mark er, the p rim er used in th e S SR-PCR is B PPCT032
图 8　不同退火温度对 SSR反应的影响
Fig. 8　 Ef fects of dif ferent annealing temperature on SSR react ion
　　用 SSR引物 ( BPPCT032)对采自
5个不同群体的 40个随机的野扁桃样
品进行扩增 ,以检测确立野扁桃 PCR-
SSR反应体系的效果。 结果如图 9所
示 ,该引物能扩增出清晰、多态性高的
带 ,表明确立的 PCR-SSR反应体系稳
定可靠 ,可应用于野扁桃分子进化和
系统发育等研究。
综合上述试验结果 ,确立了野扁
桃 SSR反应的最佳体系为:在 20μl反
应体系中 , M g2+ 、引物和 dN TPs的最
适浓度分别为 2. 0 mmol· L- 1、 0. 2
mmol· L- 1、 0. 2 mmol· L- 1 ;反应体
系中 TaqDN A聚合酶宜加入 0. 5 U,
模板 DNA应加入 30～ 50 ng;引物的最佳退火温度为 54～ 57℃。
5第 1期 曾　斌等:硅胶干燥野扁桃叶片制备 DN A样品及其 SSR反应体系的建立
40个泳道显示了引物 BPPCT032对 40个野扁桃样品的扩增情况
Lane 1- 40: Th e resul t of fo rty samples of Amygdalus Ledebour iana Schlech t. SSR
ampli fication of prim er BPPCT032
图 9　引物 BPPCT032的扩增结果
Fig. 9　 Amplif ication result of primer BPPCT032
3　讨　论
DNA提取的难易首先取决于植
物种自身 ,由于野扁桃叶内富含多糖、
多酚、色素以及其他次生代谢物质 ,多
酚易氧化为醌 ,与核酸结合发生不可
逆转的反应。多糖一般较难除去 ,常常
使 DNA提取物呈胶状 ,使得提取过程
中材料易于褐化 , DN A沉淀呈现棕褐
色 ,在用作 PCR扩增模板时均难获得
满意的结果 [3, 4 ]。为了防止褐化 ,常用
的办法是在提取缓冲液中添加抗氧化
剂 ,如 PV P、Na2 S2O5、维生素 C或活性炭等。
使用改良的 CTAB法提取硅胶干燥的野扁桃的叶组织总 DNA,所得到的 DNA样品经检测 ,符合 PCR-SSR
试验的要求。但提取的 DNA浓度较大 ,有少量的降解 ,可能的原因是叶片在干燥过程中组织细胞内的一些成分
发生变化。
使用硅胶干燥叶片制备 DNA,只能处理少量材料 ,否则 DNA产出率低且严重降解 ,影响 PCR的结果 ,但采
用硅胶干燥法 ,在野外条件下能迅速处理野扁桃叶片 ,在实验室可获得高质量的 DNA,而且 PCR-SSR的结果
理想。同时 ,同一材料不同保存的时间段所提取的 DNA和 PCR-SSR扩增产物几乎没有差异 ,所以用硅胶干燥
保存野扁桃植物材料是可行的 ,而且极为方便。
一个优化的 PCR扩增体系和反应程序是 SSR检测过程中最为重要的环节 ,建立稳定的反应体系是 SSR多
态性应用的基础。 PCR反应的扩增效率是反应体系中各因素综合作用的结果。SSR反应涉及很多影响因素 ,如
不同厂家生产的 PCR仪、不同厂家出品的 TagDN A聚合酶、 PCR缓冲液、 SSR反应体系中的引物、 Mg2+ 、
dN TPs和模板 DNA的浓度等。任何一种因素发生改变 ,都有可能不同程度地影响到整个扩增结果。因此 ,利用
SSR技术进行遗传分析 ,首先就要考虑扩增结果的重复性和真实性 ,对于不同的研究目的、不同的扩增仪器以
及不同批次的试剂都应系统地摸索反应条件 ,优化反应体系。 因此 ,研究者需根据具体的研究材料和实验室条
件进一步优化 ,以取得最佳结果。
虽然 SSR反应存在众多的影响因素 ,但这些因素还是有一定规律可循的。 Mg2+ 浓度决定 TaqDN A聚合酶
的活性 ,浓度过低时 ,酶活力显著降低 ,浓度过高则催化非特异的扩增。 dN TPs浓度过低影响扩增效率 ,过高将
与 TaqDN A聚合酶竞争 Mg2+ ,影响游离 Mg2+ 浓度 ,降低酶活性。引物的质量和特异性也直接影响 PCR扩增反
应 ,引物浓度过高会促进非特异性扩增 ,还会增加引物二聚体的形成。模板 DNA和 TaqDN A聚合酶的质量和
数量对 PCR反应也有较大影响 ,浓度过高会增加非特异性扩增产物 ,过低则靶序列产量很低。
参考文献:
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[本文编校:吴　彬 ]
6 经　　济　　林　　研　　究 第 27卷