全 文 ： 
鲜切荸荠类黄酮 3’-羟化酶分离纯化及其动力学性质
何凤平，潘永贵※，张伟敏1
（海南大学食品学院，海南 海口 570228）
2
摘 要：以鲜切荸荠为材料，通过 pH7.5Tris-HCl 缓冲液浸提得到类黄酮 3’-羟化酶(F3’H)粗酶液，然后采
用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-纤维素离子交换层析及 Sephadex G-100 凝胶过滤层析进行分离纯化，最
终所得纯化酶的纯化倍数达到 14.01，比活力提高到 478.49 U/mg，回收率为 6.38%。通过 SDS-PAGE 垂直
板电泳进行纯度鉴定，已达到电泳纯，测定得到其相对分子质量约为 53.09 kDa。纯化酶 F3’H 的最适温度
和最适 pH 分别为 30 ℃和 7.5；以柚皮素作为底物，测得该酶的米氏常数（Km）为 1.08 mmol/L，最大反应
速度（Vmax）为 416.67 U/min·mL；高浓度的 Na+对其酶活表现出微弱的抑制作用，Ca2+和柠檬酸具有强烈
的抑制作用，而 Fe2+、Mg2+、NADPH 和 VC 却表现出强烈的激活作用。
关键词：鲜切荸荠；类黄酮 3’-羟化酶；分离纯化；动力学性质

Isolation, Purification and Characterization of Flavonoid 3’-hydroxylase in Fresh-cut Chinese
Water-chestnut
HE Fengping, PAN Yonggui※, ZHANG Weimin
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

Abstract: The crude enzyme solution of flavonoid 3’-hydroxylase (F3’H) in fresh-cut Chinese water-chestnut was
extracted by Tris-HCl buffer (pH7.5), and then isolated and purified by ammonium sulfate precipitation, dialysis,
and ion-exchange column chromatography on DEAE-cellulose followed by gel filtration on Sephadex G-100.
After purification procedure, the enzyme exhibited final purification fold of 14.01, specific activity of 478.49
U/mg and protein yield of 6.38%, respectively. The purified enzyme showed a single protein band and the
molecular mass was about 53.09 kDa via sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
Further enzymatic characterization assays showed that the purified enzyme attained maximal activity at 30 ℃ and
pH 7.5, and had a Km and Vmax of 1.08 mmol/L and 416.67 U/(min·mL), respectively, using naringein as the
substrate. The flavonoid 3’-hydroxylase activity was slightly inhibited by Ca2+ and citric acid, strongly inhibited
by Na+, however, Fe2+, Mg2+, NADPH and ascorbic acid exhibited strongly inhibition activated on flavonoid
3’-hydroxylase activity. 
Key words: fresh-cut Chinese water-chestnut; flavonoid 3’-hydroxylase; isolation and purification; enzymatic
characterization
中图分类号：TSS255.1 文献标志码：A

荸荠（Eleocharis tuberose），别称马蹄、凫茈、地栗、乌芋等，为多年生草本植物莎草科荸荠属
形成的地下球茎。荸荠不仅质脆多汁、营养丰富，而且还可入药，对多种疾病具有辅助治疗的作用。
荸荠经去皮、切分处理之后即可食用，但是经过鲜切处理之后，切割表面短期内会变黄，严重影响了
                                                              
基金项目：国家自然科学基金项目（31360414）
作者简介：何凤平（1991-），女，硕士研究生，研究方向为果蔬采后生理及保鲜。Email: hfping123@126.com
※通信作者：潘永贵（1970-），男，教授，博士，研究方向为果蔬采后生理和贮运保鲜技术。Email:
yongui123@126.com 
 
2016-08-26
1
网络出版时间：2016-08-28 18:19:18
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160828.1819.022.html
 
产品外观品质及经济价值。研究发现，引起鲜切荸荠黄化的主要原因是组织中某些物质经过苯丙烷代
谢途径（phenylpropnaoid pathway, PPP）生成黄酮类物质所致，随着黄色的加深，鲜切荸荠中总黄酮
的含量相应增加[1]。进一步通过对黄化物质进行分离纯化和结构鉴定，表明鲜切荸荠切割表面黄化与
圣草酚和柚皮素两种黄酮类物质有关[2]。类黄酮 3’-羟化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F3’H）是该黄
酮类物质生物合成的关键酶之一，主要催化柚皮素（naringenin）的 B 环 3’位置羟基化生成圣草酚
（eriodictyol）[3-5]，属于 Cyt P450 亚家族，催化的反应需要依赖于 NADPH 和 O2的参与[6-8]。自 1993
年首次从矮牵牛中分离出 F3’H cDNA 片段以来[9]，近些年，国内外大多数学者对 F3’H 进行的大量研
究主要集中于基因克隆方面[5, 10-12]，例如，从葡萄中分离出 F3’H 基因序列，并确定其在葡萄不同组织
中的 mRNA 表达水平，结果显示，在花、茎、藤蔓和种子组织中均有较高表达水平[13]；从桔梗中克
隆的 F3’H 基因 EgF3’H 全长 cDNA 序列，与拟南芥（75.1%）、牵牛花（73.8%）和矮牵牛（68.2%）
均具有很高的同源性[12]。然而关于荸荠属类的 F3’H 基因研究几乎未见报道，关于其分离纯化及动力
学性质的研究更是不曾见到报道，因此，本研究以鲜切荸荠为原材料，对其 F3’H 的粗提液采用硫酸
铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析及 Sephadex G-100 凝胶过滤层析来进行分离和纯化，同时通
过 SDS-PAGE 垂直板电泳对纯化酶的纯度进行鉴定及相对分子量的测定，并研究其动力学性质，旨在
为 F3’H 的相关研究提供理论依据及参考。同时，对于控制鲜切荸荠的黄化也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器
新鲜荸荠购于海南海口果蔬批发市场，运回实验室室温预冷，清洗，挑选大小基本一致和无机械
损伤的果实，去皮切分，于-80 ℃超低温冰箱中迅速冷冻，备用。
ProteinRulerⅠ（分子量范围：12 kDa-80 kDa，250 μL） 北京全式金生物技术有限公司；柚皮素
（纯度 98.0%） 西力生物公司；DEAE-纤维素 上海源叶生物科技有限公司；Sephadex G-100、Tris、
DTT、PVP、NADPNa2、α-酮戊二酸、过氧化氢酶、牛血清蛋白 Solarbio 公司；甘氨酸钠、抗坏血酸
钠 上海麦克林生化试剂公司；硫酸铵、盐酸等试剂均为分析纯。
800S 高速组织捣碎机 美国 Waring 公司；TGL-16M 高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限
公司；超低温保存箱 海尔公司；DYYB-10 高速冷冻干燥机 上海德洋意邦仪器有限公司；T6 系列紫
外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DHL-2 型电脑恒流泵 上海精科实业有限公司；
TH-500 梯度混合器 上海泸西分析仪器厂；HD-A 电脑采集器、HD-3 紫外检测仪 南京大学；
JY-ECPT3000 型电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 F3’H 的分离纯化
1.2.1.1 粗酶液的制备
参照 Raimi 等[14]的方法略作改动。取 300 g 冷冻的鲜切荸荠，按 1:2（w:v）的比例加入 600 mL 经
过预冷（0~4 ℃）的 0.02 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.5，2.5 mmol/L DTT 和 1%PVP）。高速组织捣碎
机快速捣碎，4 ℃浸提 4 h，八层脱脂纱布过滤，滤液于 4 ℃、8 000 r/min 离心 30 min，上清液即为
F3’H 粗酶液。
1.2.1.2 硫酸铵分级沉淀的最适饱和度确定
取 F3’H 粗酶液各 40 mL，然后于冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入不同饱和度的固体硫酸铵
（10%~90%，每 10%为一间隔），4 ℃静置 4 h，8 000 r/min 离心 20 min，测定上清液中的 F3’H 酶活
性及蛋白含量，并绘制出硫酸铵分级沉淀曲线以确定硫酸铵分级沉淀的最适饱和度。将最适饱和度条
件下的酶液用 0.02 mol/L pH7.5 的 Tris-HCl 缓冲液透析 24 h（中间每隔 4 h 换一次透析液），即得初步
纯化的 F3’H 酶液，4 ℃保存备用。
1.2.1.3 DEAE-纤维素离子交换层析
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2
 
DEAE-纤维素离子交换柱（2.6 cm×20 cm）装柱后，先用 0.02 mol/L 、pH8.5 Tris-HCl 缓冲液平
衡，然后将 1.2.1.2 中初步纯化的 F3’H 酶液上样（上样量为 5 mL），先用 0.02 mol/L 、pH8.5 Tris-HCl
缓冲液洗脱至样品完全吸附，再用 0~0.8 mol/L 的 NaCl 溶液（0.02 mol/L 、pH8.5 Tris-HCl 缓冲液配
制）进行线性梯度洗脱，流速为 1.2 mL/min。于 280 nm 波长处采用紫外检测仪进行检测，收集每个
洗脱峰，同时测定各个洗脱峰的 F3’H 酶活性并绘制洗脱曲线，确定具有 F3’H 活性的目标峰并收集，
于 4 ℃透析、冷冻干燥，-20℃密封保存备用。
1.2.1.4 Sephadex G-100 凝胶过滤层析
Sephadex G-100 凝胶柱（1.6 cm×50 cm）装柱后，先用 0.02 mol/L 、pH7.5 Tris-HCl 缓冲液平衡，
然后将 1.2.1.3 中冷冻干燥的酶粉用 0.02 mol/L 、pH7.5 Tris-HCl 缓冲液溶解后上样（上样量为 1 mL），
并用 0.02 mol/L 、pH7.5 Tris-HCl 缓冲液洗脱，流速为 0.6 mL/min，于 280 nm 波长处采用紫外检测
仪进行检测，收集每个洗脱峰，同时测定各个洗脱峰的 F3’H 活性并绘制洗脱曲线，确定具有 F3’H
活性的目标峰并收集，于 4 ℃透析，冷冻干燥，-20℃密封保存备用。
1.2.2 F3’H 的纯度鉴定及相对分子质量的测定
采用 SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰氨凝胶）垂直板电泳法[15]鉴定 1.2.1.4 中所得的 F3’H 酶纯度并测
定其相对分子质量。SDS-PAGE 垂直板电泳采用分离胶浓度为 12%，电流强度为 15 mA；浓缩胶浓度
为 5%，电流强度为 10 mA。电泳大约 3 h 后终止，考马斯亮蓝 R-250 染色，脱色后拍照。
1.2.3 F3’H 活性测定
类黄酮 3’-羟化酶（F3’H）活性的测定参照 Larson、Schwinn 等[3, 16]的方法略作改动，取 0.2 mL
酶液加入 2 mL 0.02 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.5，内含 0.8 mmol/L 甘氨酸钠，7000 U/mL 过氧化氢
酶，0.1 mmol/L α-酮戊二酸，0.1 mmol/L FeSO4·7H2O，0.1 mol/L 抗坏血酸钠）中，然后加入 0.8 mL 1
mg/mL 柚皮素振荡混匀后，通过加入 100 μL 1 mmol/L NADPH 溶液引发反应，30 ℃恒温 30 min 之后
加入 100μL 两种黄酮类混合物以终止反应，立即于 280 nm 波长处测定 F3’H 酶活性，以每分钟吸光
度变化 0.001 来表示一个 F3’H 活性单位（即 1U），F3’H 活性表示为 103×ΔA280nm/min。以加入 0.2 mL
蒸馏水，其余反应体系相同为空白。
1.2.4 蛋白质含量测定
蛋白质含量测定参照 Bradford 法[17]，牛血清蛋白为标准蛋白。根据以牛血清蛋白质量（μg）为
横坐标（x），其吸光度 A595 nm为纵坐标（y）制作出的标准曲线：y=0.0037x+0.0163（R2=0.9940），计
算样品中的蛋白质含量。
1.2.5 F3’H 动力学性质研究
1.2.5.1 F3’H 最适反应温度研究
分别置于 10 ℃~70 ℃（温度每间隔 10℃）一系列温度中反应 30 min，加入 100 μL 两种黄酮类
混合物以终止反应，按照 1.2.3 项方法测定各个温度条件下的 F3’H 酶活，以各温度条件下测得的 F3’H
最大酶活为 100%，计算出相对酶活，确定其最适温度。
1.2.5.2 F3’H 热稳定性研究
将纯化的 F3’H 酶液分别置于 30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的恒温水浴锅中保温 80 min，每隔 20 min
取出，迅速置于冰浴中，按照 1.2.3 项方法测定各个温度条件下的 F3’H 残余酶活，以各温度条件下所
测得的 F3’H 最大酶活为 100%，计算出相对酶活，研究其热稳定性。
1.2.5.3 F3’H 最适 pH 研究
将纯化的 F3’H 酶液分别加至 0.02 mol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH3.5，4.5，5.5）、磷酸氢二钠-
磷酸二氢钠缓冲液（pH6.5，7.5）和 Tris-盐酸缓冲液（pH8.5，9.5）中，按照 1.2.3 项方法测定各个
pH 值条件下的 F3’H 酶活，以各 pH 值条件下所测得的 F3’H 最大酶活为 100%，计算出相对酶活，确
定其最适 pH。
1.2.5.4 F3’H pH 稳定性研究
将纯化的 F3’H 酶液分别加至 0.02 mol/L、pH4.5~11.5 的缓冲液中，4 ℃下放置 24 h，按照 1.2.3
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项方法测定各个 pH 值条件下的 F3’H 残余酶活，以各 pH 值条件下所测得的 F3’H 最大酶活为 100%，
计算出相对酶活，研究其 pH 稳定性。
1.2.5.5 金属离子及化合物对 F3’H 活性的影响
在最适 pH 和最适反应温度条件下，向反应体系中分别加入不同浓度（0、2.5、5、7.5、10 mmol/L）
的金属离子 Mg2+、Fe2+、Ca2+和 Na+及不同百分比（0、2.5、5、7.5、10、30% w/v）的化合物 NADPH、
VC和柠檬酸，然后按照 1.2.3 项方法测定加入金属离子或化合物后的 F3’H 酶活，以未加入金属离子
或化合物时测得的 F3’H 酶活为 100%，计算出相对酶活，研究金属离子及化合物对其活性的影响。
1.2.5.6 F3’H 的 Km和 Vmax值测定
在最适 pH 和最适反应温度条件下，以不同浓度（1、3、5、7、9 mmol/L）柚皮素为底物，按照
1.2.3 项方法测定 F3’H 酶活，根据 Lineweavwer-Burk 作图法（双倒数作图法）[18]，计算出米氏常数
Km和 Vmax值。
1.2.6 数据分析
以上各个处理均重复测定 3 次，运用 Excel2007 和 SPSS17.0 进行数据处理及分析，SigmaPlot12.0
绘图。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵分级沉淀的最适饱和度
粗酶液中含有大量的杂蛋白，硫酸铵处理可较好地除掉杂蛋白，实现目标蛋白的初步纯化。由图
1 可见，当粗酶液经 40%饱和度的硫酸铵处理时，上清液中 F3’H 相对酶活和蛋白含量分别为 78.26%
和 0.43 mg/mL；当硫酸铵饱和度为 70%时，上清液中 F3’H 相对酶活和蛋白含量分别为 21.73%和 0.15
mg/mL，仅分别为饱和度 40%时的 28%和 34%。因此，最终选择 40%~70%饱和度的硫酸铵来分级沉
淀 F3’H 粗酶液。本研究中采用 40%~70%饱和度的硫酸铵分级沉淀 F3’H 粗酶液后，纯化倍数为 1.27
倍，回收率达到 43.60%。
20 30 40 50 60 70 80 90
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0
20
40
60
80
100
蛋白含量
 
硫酸铵饱和度（%）
 
 相对酶活
 
蛋
白
含
量
（
mg
/m
L）
 
 
相
对
酶
活
（
%）
 

图 1 硫酸铵分级沉淀鲜切荸荠 F3’H 的饱和度确定
Fig.1 Ammonium sulfate precipitation on F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut

2.2 DEAE-纤维素离子交换层析
鲜切荸荠中 F3’H 粗酶液先经过 40%~70%饱和度的硫酸铵初步纯化，所得的酶液经透析后，进
行 DEAE-纤维素离子交换层析，所得洗脱曲线见图 2。由图 2 可知，采用 0~0.8 mol/L 的 NaCl 进行线
性梯度洗脱，出现了两个洗脱峰，测定各洗脱峰的酶活，发现第一个洗脱峰的酶活极低则认为可不作
考虑，第二个洗脱峰的酶活最大，由此确定 F3’H 主要在第二个洗脱峰中，收集该洗脱峰的酶液透析
冷冻干燥，进行 Sephadex G-100 凝胶过滤层析。
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 时间 (h)0 1 2 3 4 5
蛋
白
含
量
（
mg
/m
L）
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
F3
H
酶
活
（
U/m
L ）
0
2
4
6
8
10
12
14
Na
Cl(
mo
l/L
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8蛋白含量
F3H酶活

图 2 鲜切荸荠 F3’H 的 DEAE-纤维素离子交换层析
Fig.2 DEAE-cellulose ion-exchange column chromatography of F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut

2.3 Sephadex G-100 凝胶过滤层析
将经 DEAE-纤维素离子交换层析纯化步骤之后所得的 F3’H 酶液，进行 Sephadex G-100 凝胶过滤
层析出现了两个洗脱峰，通过测定各洗脱峰的酶活，发现仅第二个洗脱峰具有 F3’H 活性（图 3），收
集该洗脱峰组分进行 SDS-PAGE 垂直板电泳，鉴定纯度并测定其相对分子量。F3’H 经过以上各步纯
化之后，其比活力达到 478.49 U/mg，纯化了 14.01 倍，且回收率为 6.38%（结果见表 1）。
时间 (h)
0 1 2 3 4 5
蛋
白
含
量
（
mg
/m
L）
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
F3
H
酶
活（
U/m
L）
0
5
10
15
20蛋白含量
F3H酶活

图 3 鲜切荸荠 F3’H 的 Sephadex G-100 凝胶过滤层析
Fig.3 Sephadex G-100 gel filtration column chromatography of F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut

表 1 鲜切荸荠 F3’H 的纯化结果
Table 1 Purification of flavonoid 3’-hydroxylase in fresh-cut Chinese water-chestnut
纯化步骤
总酶活
(U)
总蛋白
(mg)
比活力
(U/mg)
纯化倍数
回收率
(%)
粗酶液
(NH4)SO4 沉淀
DEAE-纤维素
Sephadex G-100
15350
8820
4223
980
449.46
202.31
14.48
2.05
34.15
43.60
291.64
478.49
1
1.27
8.54
14.01
100
57.46
27.51
6.38

2.4 SDS-PAGE 垂直板电泳鉴定纯度及测定相对分子质量
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F3’H 粗酶、DEAE-纤维素纯化酶和 Sephadex G-100 纯化酶进行 SDS-PAGE 垂直板电泳，电泳图
谱见图 4。由图 4 可以看出 F3’H 经过各步纯化后的效果，其中经过 Sephadex G-100 凝胶过滤柱层析
之后得到的酶液（泳道 5 和 6）显示为单一蛋白条带，说明经 Sephadex G-100 凝胶过滤柱层析所得的
F3’H 纯度极高，已达到电泳纯。
根据 SDS-PAGE 电泳图谱中标准蛋白相对分子质量的对数值 lgMW（y）与相对迁移率 Rm (x)制
作的线性回归方程：y= -1.0597x+5.0938（R2=0.9985）及电泳图谱中 F3’H 的 Rm为 0.348，计算出 F3’H
的相对分子质量约为 53.09 kDa（图 5）。与葡萄（56.14 kDa）[19]中 F3’H 的相对分子质量比较接近，
而与蓝莓（58.33 kDa）[10]、银杏（63.47 kDa）[11]相差较大，其原因主要是研究果实的种类不同。

1、F3’H 粗酶液；2 和 3、DEAE-纤维素纯化酶；4、标准蛋
白 Maker(12 kDa-80 kDa)；5 和 6、Sephadex G-100 纯化酶
图 4 F3’H 的 SDS-PAGE 电泳图谱
Fig.4 SDS-PAGE of purified F3’H
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
lgM
W
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
y = -1.0596x + 5.0938
R² = 0.9986
 样品 
相对迁移率(Rm) 
图 5 SDS-PAGE 电泳中标准蛋白 Maker 的相对分子质量对数值
（lgMW）与相对迁移率（Rm）的关系
Fig.5 Relationship between standard molecular mass and mR of
SDS-PAGE

2.5 鲜切荸荠 F3’H 动力学性质研究
2.5.1 温度对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响及热稳定性
在一定的温度范围内，酶活性会随之升高而增大，然而温度过高则会降低酶活性，因此确定酶的
最适反应温度尤其重要。如图 6A 所示，鲜切荸荠 F3’H 活性随着反应温度的升高显著升高（p<0.05），
在 30 ℃时达到最高，随后，随温度的升高逐步降低（p<0.05），直至 70 ℃之后几乎检测不到酶活性，
其可能原因是温度过高使酶蛋白发生了热变性。由此可知，鲜切荸荠 F3’H 的最适反应温度是 30 ℃，
这与草莓中的研究结果一致[20]。
鲜切荸荠 F3’H 的热稳定性如图 6B 所示，F3’H 在 30 ℃和 40 ℃保温 80 min 期间，相对酶活大
小基本相等，说明稍低温度条件下可以使得酶活性保持稳定；60 ℃保温期间，相对酶活显著减小
（p<0.05），保温 80 min 之后，相对酶活降至 26.67%。
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6
 温度 ℃（ ）
10 20 30 40 50 60 70
相
对
酶
活
（%
）
0
20
40
60
80
100
120
A
时 间(min)
0 20 40 60 80
相
对
酶
活
（%
）
0
20
40
60
80
100
120
30 ℃40 ℃50 ℃60 ℃
B

图 6 温度对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响（A）及热稳定性(B)
Fig.6 Effect of temperature on F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut (A) and its thermal stability (B)

2.5.2 pH 对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响及 pH 稳定性
pH 也是酶最为敏感的因子之一，一定 pH 范围内，酶活性会随之升高而增加，然而环境过酸或过
碱均会导致其降低，其原因在于环境过酸或过碱能影响酶蛋白构象而使酶本身变性失活、改变酶活性
中心的结构及影响底物分子上某些基团的解离等[21]。pH 对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响见图 7A，可以
看出，鲜切荸荠 F3’H 在 pH7.5 时相对酶活达到最大，所以此 pH 是其最适 pH。
鲜切荸荠 F3’H 的 pH 稳定性结果见图 7B，由图可以发现，鲜切荸荠 F3’H 在不同 pH 条件下 4 ℃
放置 24 h 之后，在 pH6.5~8.0 范围内相对酶活较高，最为稳定；同时还发现，F3’H 在 pH 大于 8.0 之
后，相对酶活显著下降至 10%以下（p<0.05）。
pH3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5
相
对
酶
活
（%
）
0
20
40
60
80
100
120
A
pH4 5 6 7 8 9 10 11 12
相
对
酶
活
（%
）
0
20
40
60
80
100
120
B
图 7 pH 对鲜切荸荠 F3’H 的影响（A）及 pH 稳定性(B)
Fig.7 Effect of pH on F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut (A) and its pH stability (B)

2.5.3 不同金属离子及化合物对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响
几种金属离子对 F3’H 活性的影响见表 2，从中可知，当 Na+浓度小于 7.5 mM 时对 F3’H 活性无
显著影响（p>0.05）；而 Ca2+却对 F3’H 具有显著的抑制作用（p<0.05），随着浓度的增加抑制作用变
得愈加强烈，当浓度达到 10 mM 时，F3’H 的相对酶活降至 45%左右。此外，当浓度低于 7.5 mM 时，
Mg2+和 Fe2+对 F3’H 的活性均具有显著的激活作用（p<0.05），但是 Fe2+的激活作用明显强于 Mg2+，其
中 Mg2+的浓度达到 10 mM 时却对 F3’H 表现出轻微的抑制作用。不同种类和浓度的金属离子对鲜切
荸荠中 F3’H 具有激活或是抑制的作用，且对其活性的影响程度均不同，最主要的原因也许是反应体
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7
 
系中添加的金属离子影响了酶的活性中心构象，进而影响了其活性[22, 23]。
通过向反应体系中添加 NADPH、VC和柠檬酸这三种化合物，结果见表 3。不同浓度的 NADPH
对 F3’H 均具有显著的激活作用（p<0.05），其主要原因是 NADPH 提供的 NADP+是一种氧化形式的电
子供体，作为一种辅助因子参与羟基化反应的电子转移，从而激活 F3’H[16]；柠檬酸对 F3’H 具有显著
的抑制作用（p<0.05），随着浓度的增加，其相对酶活逐渐降低，由于反应体系中柠檬酸的加入改变
了环境 pH，从而影响其酶活，这与李洁[24]的研究报道是一致的；VC本是一种常见的酶促褐变抑制剂，
它对 F3’H 不但没有抑制的作用反而具有显著的促进作用（p<0.05），可能是由于 F3’H 并不属于酶促
褐变酶，主要是催化柚皮素的 B 环 3’位置羟基化生成圣草酚，而且圣草酚又是鲜切荸荠主要黄化物
质之一[2]，这说明在鲜切荸荠的实际生产过程中，VC可能对其黄化不会有抑制的效果[25]，反而还会产
生促进的作用。
表 2 不同金属离子对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响（ ±SD）
Table 2 Effect of various metal ions on F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut (mean±SD)
金属离子（mM）
相对酶活（%）
0 2.5 5 7.5 10
Ca2+
Fe2+
Mg2+
Na+
100a
100e
100d
100b
81.30±1.06b
292.70±1.05d
136.15±1.06c
100.88±0.66a
72.79±0.93c
415.54±1.18c
199.33±1.15a
100.67±1.15b
54.52±0.5d
461.29±0.86a
190.97±1.00b
91.49±0.55c
45.48±0.50e
438.59±0.68b
90.64±0.55e
90.93±0.39c
注：表中同行数据后不同英文字母表示差异显著（p<0.05）

表 3 不同化合物对鲜切荸荠 F3’H 活性的影响（ ±SD）
Table 3 Effect of various compounds on F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut (mean±SD)
化合物
（‰ w/v）
相对酶活（%）
0 2.5 5 10 30 50
NADPH
VC
柠檬酸
100a
100f
100a
199.55±0.48a
176.23±0.90e
75.17±0.29b
192.99±0.69b
184.75±0.81d
62.67±0.76c
189.41±0.53c
207.27±0.37a
62.50±0.5c
170.59±0.80d
199.83±0.29b
61.83±0.76c
162.58±0.62e
192.44±0.51c
50.17±0.29d
注：表中同行数据后不同英文字母表示差异显著（p<0.05）

2.5.4 鲜切荸荠 F3’H 的 Km和 Vmax值测定
以 1、3、5、7、9 mmol/L 的柚皮素为底物，在最适温度 30 ℃和最适 pH 条件下，测定对应浓度
下的 F3’H 酶活。根据图 8 所示的 Lineweavwer-Burk 双倒数图得出的 F3’H 动力学双倒数线性回归方
程：y = 0.0026x + 0.0024（R² = 0.9995），8），计算得到其 F3’H 的 Km=1.08 mmol/L、Vmax=416.67 U/mL。
米氏常数（Km）常常是用来表示酶与底物之间的亲和力，Km 值越大表示酶与底物之间的亲和力弱；
Km值越小表示酶与底物之间的亲和力强。本研究中，F3’H 的 Km值为 1.08 mmol/L，说明 F3’H 与底
物柚皮素之间的亲和力较强。
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8
 1/[S](mmol/L)-1
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
1/[
V]
(U
/m
L)-
1
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
 
y = 0.0026x + 0.0024
R² = 0.9995 

图 8 鲜切荸荠 F3’H 的 Lineweavwer-Burk 图
Fig.8 Lineweavwer-Burk plot of F3’H in fresh-cut Chinese water-chestnut

3 结 论

鲜切荸荠经过 pH7.5 的缓冲液粗提得到的粗酶液，经 40%~70%饱和度的硫酸铵盐析后，再进行
DEAE-纤维素离子交换层析和 Sephadex G-100 凝胶过滤层析，最终得到 F3’H 纯化酶，其纯化倍数达
到 14.01，比活力提高到 478.49 U/mg，回收率为 6.38%。F3’H 纯化酶通过 SDS-PAGE 垂直板电泳法
鉴定为均一蛋白，已达到电泳纯，而且测定得到其相对分子质量约为 53.09 kDa。
纯化后 F3’H 的动力学性质研究结果表明，该酶的最适反应温度为 30 ℃，在温度低于 40 ℃时较
稳定。最适 pH 为 7.5，在 pH6.5~8.0 范围内最为稳定。以柚皮素为底物，测定出该酶对底物的米氏常
数 Km为 1.08 mmol/L，最大反应速度 Vmax为 416.67 U/min·mL。金属离子 Na+对其活性影响较小，当
浓度较大时才具有抑制作用；Ca2+和柠檬酸却具有强烈的抑制作用；而 Fe2+和 Mg2+却表现出强烈的激
活作用，且 Fe2+的激活作用明显高于 Mg2+，此外， NADPH 和 VC也表现出强烈的激活作用。

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